一种oap-mip多结合位点亲和膜金霉素传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于抗生素残留的电化学分析领域，涉及分子印迹技术，尤其是一种金霉素分子印迹传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002]金霉素(Chlortetracyline，CTC)属四环素类光谱抗生素的一种，可由链霉菌培养液中提取出或以半合成方法生产，能够有效抑制革兰阳性菌、阴性菌、立克次氏体等，抗菌范围较广。可广泛地应用于鱼类、禽畜疾病的预防与治疗，添加于饲料中能够增加禽畜日增重及饲料转化率。但由于药物滥用，残留于动物性食品中的金霉素对人体健康构成了潜在的危害。大部分国家已对动物性食品中金霉素的残留做出了严格的限定，我国农业部2002年发布的第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》规定盐酸金霉素在动物性食品中最高残留量分别为肌肉为100mg/kg，肝为300mg/kg，肾为600mg/kg ;在牛或羊类中，奶为100mg/kg ;在禽类中，蛋中为200mg/kg ;在鱼或4下类中，肉为100mg/kg。
[0003]近年来，国内外已报道的检测金霉素的常用方法包括高效液相色谱法(HPLC)、免疫分析法、毛细血管电泳法、薄层色谱法(TLC)、微生物培养法，其中，HPLC法虽然应用最广，检测结果精准可靠，但对样品纯度要求较高，无法满足大批量样本快速筛选的需要。免疫分析法对样品纯度要求不高，但检测结果重现性差。毛细血管电泳法及TLC法分析速度快，但灵敏度低。微生物培养法适合大量样品筛选，但受抗菌活性杂质的影响不能做定量分析。
[0004]分子印迹聚合物(MIPs)是一种具有较强特异性分子识别能力的新型高分子仿生材料，具有制备简单，使用范围广、耐高温、高压、酸碱腐蚀且可多次回收重复加以利用的优势。MIPs传统的制备方法主要有分子自组装法、原位引发聚合法、表面涂覆法，近年来，迅速发展的电聚合方法已成功地应用于制备MIPs，具有可通过控制电荷量达到纳米级厚度的超薄膜、良好的刚性及重现性且可在水环境下进行操作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种响应快、选择性高、灵敏度高、重现性好的现场快速检测方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]金霉素分子印迹传感器的制备
[0008](I)玻碳电极的预处理:将玻碳电极依次用1.0,0.30,0.05 μπι粒度的a -Al2O3抛光粉研磨抛光，而后依次用1:1HNO3、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗2?3min，再将电极置于0.5mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.1?1.0V，反复扫描直至得到阴、阳极峰对称且稳定的循环伏安(CV)图为止。达到稳定后，峰电位差在SOmV以下，则取出电极待用。
[0009](2)分子自组装方式制备印迹膜电极:将0.1g邻氨基酚(OAP)溶于0.1M高氯酸中，并加入0.4M氢氧化钠将pH值调节为弱酸性(pH 5.5)，定容至250mL浓度为3.67mM，从中移取9mL已配好3.67mM OAP的NaClO4溶液，再向其中加入ImL ImM的金霉素(CTC)混合溶解。因聚合反应初期，氧气进攻自由基阳离子，则需通队除O 2约15min，将处理好的三电极系统浸入含 3.67mM 0ΑΡ、0.ImM CTC 与 0.1M NaClO4溶液(pH 5.5)中，在-0.2 ?1.2V的电位区间内循环伏安扫描30圈，扫描速度为50mV/s，所制备的聚合膜经化学修饰作用沉积固定于玻碳电极表面。由于金霉素(CTC)分子中含有酚羟基、烯醇基和二甲氨基。而选用邻氨基酚(OAP)作为功能单体，其结构中存在的羟基也可作为潜在的配位位点，不仅OAP的氨基与CTC的酚羟基、烯醇基可发生分子间氢键相互作用，而且OAP的羟基与CTC的二甲氨基之间亦可发生作用，因此OAP与CTC之间有较多的结合位点，使得所制备的分子印迹聚合物对金霉素具有极高的选择性和结合能力。而随着扫描圈数的增加，电极表面逐渐覆盖一层致密的非导电聚合膜，阻止了 OAP的进一步氧化，使得伏安电流响应受到抑制，由此便制得非导电性的印迹膜电极(CTC-MIP-0AP/GCE)。
[0010](3)模板分子的洗脱:采用上述步骤⑵制备的CTC-MIP-0AP/GCE，将其置入体积比为1: 4的甲醇/硫酸溶液中洗脱24h后，可得到具有能够与金霉素相匹配的识别位点的印迹膜电极(MIP-P0AP/GCE)，即金霉素分子印迹敏感膜传感器。目前，金霉素分子印迹敏感膜传感器的研究尚未报道，本发明是首次采用以OAP为功能单体，CTC为模板分子，利用电聚合方式构建了一种可间接地通过电化学技术来测定金霉素的分子印迹敏感膜传感器。
[0011]根据权利要求1所述的一种金霉素分子印迹传感器及其制备，其特征是:
[0012]印迹膜电极的电化学响应及标准曲线
[0013]利用差分脉冲伏安法在含5mM K3[Fe (CN)6]的10mM KCl PBS中来表征印迹膜传感器的电流响应。将所制备的印迹敏感膜电极浸入含有一定浓度金霉素溶液中静止吸附后进行差分脉冲伏安检测，每个浓度的吸附时间为20min时即达到平衡。每次试验重复3次，根据印迹膜电极吸附金霉素后所发生的电流响应变化，绘制金霉素浓度与响应电流差值的标准曲线。
[0014]本发明的优点和有益效果为:
[0015]1、本发明基于电聚合方法，利用循环伏安法以盐酸金霉素为模板分子、邻氨基酚为功能单体制备了分子印迹电化学传感器，应用差分脉冲伏安法研究了该传感器的响应性能。该传感器响应快，成本低，选择性良好，满足盐酸金霉素痕量分析的要求，有望在食品检测中得到更好的应用。
[0016]2、本发明采用的是邻氨基酚作为功能单体，可在不同电极表面电聚合形成致密的刚性绝缘聚合膜，膜厚可控制在lO-lOOnm，且羟基作为潜在的配位位点，可进一步提高传感器的性能。故本发明中选取[Fe(CN)6]3。铁氰化钾具有良好的电化学稳定性，可保证分析结果的可靠性。由图2-1可知，K3[Fe (CN)6]在洗脱处理后的非印迹膜表面几乎无响应(曲线d)，而洗脱处理后的印迹膜峰电流(曲线b)较大，但与裸电极表面峰电流(曲线a)相比较小。
[0017]3、本发明采用差分脉冲伏安法对同一浓度的盐酸金霉素及干扰物溶液进行测定。选择与盐酸金霉素结构相似的四环素、土霉素及结构差异较大的氯霉素、青霉素作为干扰物进行比较验证，能够充分反映该传感器的选择性。如图4可知，氯霉素和青霉素对盐酸金霉素几乎无干扰，土霉素和四环素产生了极微弱的电流响应，说明该传感器对盐酸金霉素具有特异选择性。
[0018]4、本发明制备的传感器满足盐酸金霉素痕量分析的要求且响应快，成本低，选择性良好。如图5-1可知，不同盐酸金霉素浓度下的差分脉冲伏安电流响应；根据印迹膜电极吸附金霉素后所发生的电流响应变化，绘制金霉素浓度与响应电流差值的标准曲线，如图5-2可知，其检测线性范围可达至20-610nM。
[0019]5、本发明制备的传感器在洗脱溶液中超声清洗5min，并用二次蒸馏水淋洗后即可使电极基本能恢复到响应前的状态。因此使用同一支印迹膜电极对0.2 μΜ CTC平行测定5次，RSD为1.9%，显现出较好的重现性。将此印迹膜电极储存于4°C冰箱中，二周后在同等环境下对0.2 μ MCTC的响应值降至90.3%。经四周后，响应值降至82.7%。具有较佳的长期稳定性。
【附图说明】
[0020]图1-1和图1-2为本发明循环伏安电聚合曲线:其中，图1-1为邻氨基酚单体聚合；图1-2为邻氨基酚和盐酸金霉素聚合；
[0021]图2-1和图2-2为本发明不同电极在K3[Fe (CN)6]及KCl溶液中的差分脉冲伏安曲线及循环伏安曲线:(a) GCE ； (b)MIP-P0AP/GCE ； (c) CTCad-MIP_POAP/GCE ； (d) POAP/GCE ；
[0022]图3为本发明不同聚合圈数对洗脱前后峰电流差值的影响；
[0023]图4为本发明不同被测物所产生的相对峰电流变化率:(a)盐酸金霉素；(b)四环素；(C) 土霉素；(d)氯霉素；(e)青霉素；
[0024]图5-1和图5-2为本发明的不同盐酸金霉素浓度下的差分脉冲伏安曲线及标准曲线；
【具体实施方式】
[0025]本发明基于分子印迹敏感膜传感器的痕量金霉素残留的检测方法，包括金霉素分子印迹敏感膜传感器的制备及电化学响应及标准曲线的绘制。
[0026]1、金霉素分子印迹敏感膜传感器的制备
[0027](I)玻碳电极的预处理:将玻碳电极依次用1.0,0.30,0.05 μπι粒度的d_Al203抛光粉研磨抛光，而后依次用1: 1HN03、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗2?3min，再将电极置于0.5mol/L H2S04溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.1?1.0V，反复扫描直至得到阴、阳极峰对称且稳定的循环伏安(CV)图为止。达到稳定后，峰电位差在SOmV以下，则取出电极待用。
[0028](2)分子自组装方式制备印迹膜电极:将0.1g邻氨基酚(OAP)溶于0.1M高氯酸中，并加入0.4M氢氧化钠将pH值调节为弱酸性(pH 5.5)，定容至250mL浓度为3.67mM，从中移取9mL已配好3.67mM OAP的NaClO4溶液，再向其中加入ImL ImM的金霉素(CTC)混合溶解。因聚合反应初期，氧气进攻自由基阳离子，则需通队除O 2约15min，将处理好的三电极系统浸入含 3.67mM 0ΑΡ、0.ImM CTC 与 0.1M NaClO4溶液(pH