亚硝酸盐检测荧光检测探针以及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及有机化学领域，具体涉及亚硝酸盐检测荧光检测探针及检测方法。
【背景技术】
[0002] 食品添加剂的过度使用是食品安全问题的一个重要方面，近年来，公众食品安全 意识明显增强。亚硝酸盐作为一种常用的食品添加剂，广泛存在于乳制品、肉类及泡菜等腌 制食品中。但是，食品中过量的亚硝酸盐被人体摄入以后，会对人体健康构成严重危害。亚 硝酸盐在食品中的过度添加和残留引起了人们的普遍关注，因而，建立一种快捷、高效、准 确、灵敏的亚硝酸盐检测方法尤为重要。
[0003] 传统的亚硝酸盐检测方法是盐酸萘乙二胺分光光度法，但该方法灵敏度低，选择 性差。近年来，荧光光度法因具有灵敏度高、选择性好、检测限低、仪器设备简单、操作简便 等诸多优点，备受关注，荧光光度法作为一种快速、廉价、灵敏的检测技术得到广泛关注。荧 光光度法检测亚硝酸盐主要是基于荧光探针与亚硝酸盐的特异性反应。
[0004] 但是目前市场上尚无亚硝酸盐检测荧光探针，开发一种检测快速、高效、灵敏的亚 硝酸盐荧光探针以解决传统亚硝酸盐检测技术的不足成为当务之急。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种亚硝酸盐检测荧光检测探针。
[0006] 本发明的再一目的是提供亚硝酸盐检测荧光检测方法。
[0007] 本发明的再一目的是提供亚硝酸盐检测荧光检测方法，以解决传统亚硝酸盐检测 技术灵敏度低，选择性差的缺点。
[0008] 根据本发明的荧光检测探针，其结构式如式I所示：
[0009]
[0017] 本发明的荧光检测探针的检测原理为:探针化合物本身荧光强度很弱，亚硝酸盐 在酸性条件下生成一氧化氮(N0)，一氧化氮与探针化合物发生自由基反应，使其发生芳构 化，生成强荧光的的吡啶衍生物。反应前后荧光强度的变化与亚硝酸盐的浓度之间呈线性 关系，从而可定量检测亚硝酸盐的含量。
[0018]
12345 为了实现上述目的，根据本发明的【具体实施方式】，本发明的亚硝酸盐检测荧光检 测方法包括步骤： 2 (1)将待测食品样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，得样品提取液； 3 (2)将步骤（1)得到的提取液在?!1〈3.0的酸性条件下与荧光探针于60°〇水浴中反 应30min; 4 (3)将步骤(2)得到的反应液用NaH2P〇4_Na2HP〇4缓冲液调节pH至6.0~8.0，用荧光 分光光度计测定荧光强度； 5 (4)配置亚硝酸盐标准溶液，将其与荧光探针反应后，测定荧光强度，荧光强度对 应亚硝酸盐含量作校正曲线进行定量分析；
[0024] (5)依据步骤(4)得到的校正曲线计算得到食品样品中的亚硝酸盐含量。
[0025]优选地，最大激发波长为390nm，最大发射波长为458nm。
[0026]本发明检测食品中亚硝酸盐的方法，检测限为0.02μπι〇1 · Γ1。亚硝酸钠标准溶液 在0.2~4.5μπι〇1 · I/1浓度下，荧光强度与亚硝酸盐浓度呈良好的线性关系，相关系数大于 0.998，被测物中亚硝酸盐的回收率在93.3~103.5 %，相对标准偏差(RSD)〈3.1 %。与现有 技术相比，本发明的有益效果是:根据本发明的检测亚硝酸盐的方法，该荧光探针在酸性条 件下，对亚硝酸盐具有独特的识别性能，生成相应吡啶类衍生物的性质，通过检测作用前后 荧光性质的改变来实现对亚硝酸盐的定量检测。本发明的亚硝酸盐检测方法相对于现有技 术灵敏度和准确度更高，选择性更好。
【附图说明】
[0027] 图1为荧光探针与亚硝酸盐反应前后的荧光光谱；
[0028] 图2为荧光探针与一系列浓度的亚硝酸钠标准溶液反应后的荧光光谱。
【具体实施方式】
[0029]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。
[0030]实施例1制备亚硝酸盐检测荧光探针
[0031] 基于sonogashira反应制备焚光探针，合成过程如下：
[0032] 1、7_甲氧基香豆素(7-MC-1)的合成
[0033] 将7-羟基香豆素（lg，6.2mmol)溶于30mL丙酮，加入无水碳酸钾（1.7g, 12.35mmol)，在室温下搅拌lOmin。再加入碘甲烷（1.05g，7.41mmol)，加热回流反应5h，停止 加热，趁热过滤，将滤液旋干，乙醇重结晶得白色晶体0.8g，产率73%。4 NMR(400Hz⑶Cl3) 5ppm:7.67(d,lH ,J = 9.4Hz),7.38(d,lH ,J = 8.52Hz),6.87(m,2H ,J = 2.3Hz),6.26(d,lH ,J = 9.4Hz),3.89(s,3H)〇
[0034] 2、7-甲氧基-3-碘代香豆素(7-MC-2)的合成
[0035] 将7-MC-l(lg,5.68mmol)、对甲基苯磺酸（TsOH 0.98g,5.68mmol)溶于30mL THF (四氢呋喃）中，剧烈搅拌下，缓慢向其中滴加20mLTHF的NIS(N -碘代丁二酰亚胺1.5g， 6.82mmol)溶液。加热回流反应10h，停止加热，恢复至室温，将溶剂旋干，固体用二氯甲烷/ 石油醚=1:1柱层析分离，得白色固体0.12g，产率70 %。4 NMR(400Hz CDC13)δρρπι: 8.28(s， lH)，7.34(d，lH，J = 8.6Hz)，6.87(q，lH，J = 2.3Hz)，6.83(d，lH，J = 2.2Hz)，3.90(s，3H)·。
[0036] 3、7-MC_DHP 的合成
[0037] 先在重蒸好的四氢呋喃和三乙胺(Et3N)中通氮气30min，在氮气保护下，将7-MC-2 (0 · lg，0 · 33mmol)和含二氢吡啶的炔（0 · 08g，0 · 33mmol)用10mL THF溶解，加入2mL三乙胺， 揽摔10min后，再加入Pd2(dba)3( 15mg，0 ·017mmol)、CuI (13mg，0 · 049mmol)、PPh3(三苯基憐 6mg，0.033mmo 1)。加热回流反应4h，停止加热，冷却至室温，将溶剂旋干，用乙酸乙酯/石油 醚（1:1)柱层析得白色固体〇.〇6g，产率45%</H NMR(400Hz CDCl3)Sppm:7.75(s，lH)，7.34 (d,lH,J = 8.6Hz) ,6.85(q,lH,J = 2.3Hz) ,6.80(d,lH,J = 4.6Hz) ,6.12(s,lH) ,5.06(s, 1H),3.89(s,3H),3.81(s,6H),2.37(s,6H)〇
[0038] 4、7-MC_Py 的合成
[0039] 将7-MC-DHP(20mg,0.05mmol)溶于2mL甲醇中，室温下加入O.lmol · L-^Cl溶液 lmL，再加入亚硝酸钠水溶液，于60°C水浴中反应30min后，加入二氯甲烧萃取，无水硫酸钠 干燥。将二氯甲烷旋干，用乙酸乙酯/石油醚（1:1)柱层析得黄色固体19mg，产率93% NMR(400Hz CDCl3)Sppm:7.86(s，lH)，7.44((1, lH，J = 8.7Hz)，6.91(q，lH，J = 2.3Hz) ,6.84 (d，lH，J = 2.2Hz)，4.06(s，6H)，3.92(s，3H)，2.63(s，6H)。
[0040] 实施例2荧光检测
[00411上述亚硝酸盐检测荧光探针检测亚硝酸盐的方法，包括以下步骤：
[0042] (1)配置亚硝酸钠标准溶液，配置一组不同浓度的亚硝酸钠标准溶液。
[0043] (2)食品样品的提取，将10g火腿样品搅碎后，加入12.5mL饱和硼砂溶液，加入70摄 氏度左右的热水约300mL，于沸水浴中提取约15min，依次加入lOmL亚铁氰化钾溶液和lOmL 乙酸锌溶液沉淀除去蛋白质，过滤，取滤液待测。
[0044] (3)分别取亚硝酸盐标准溶液和火腿样品提取液，加入亚硝酸盐检测荧光探针，在 口!1〈3.0的酸性条件下，于60°(3水浴中反应301^11，冷却至室温，以恥!^04-似2册04(0.051，？!1 =7.4)缓冲溶液调节pH至7.0。
[0045] (4)以390η为激发波长，测定反应后溶液在458nm处的荧光发射强度，依据标准曲 线就可以计算出样品中亚硝酸盐的含量。
[0046]测定结果
[0047] 分别选取火腿、香肠、泡菜和榨菜四种食品样品，按照上述步骤（1)~(4)的方法测 定其中亚硝酸盐的含量，测定结果与现有的分光光度法一致，如下：
[0048]
[0049]检测极限的测定
[0050] 按照国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的规定，检测极限L0D = kSb/S，其中Sb为 空白多次测定的标准偏差;S为标准曲线的斜率;k为根据一定置信水平确定的系数，IUPAC 建议对光谱化学分析法取k = 3。
[0051 ]平行取20份亚硝酸盐检测荧光探针溶液，在不加入亚硝酸盐标准溶液的情况下， 置于60°C水浴中30min，冷却至室温，以NaH2P〇4-Na2HP〇4(0.05M，pH = 7.4)缓冲溶液调节pH 至7.0。以390nm为激发波长，测定溶液在458nm处的荧光发射强度。计算20次荧光强度测定 结果的标准偏差Sb，再结合步骤(4)中测得的标准曲线的斜率，即得荧光探针用于亚硝酸盐 检测的检测极限。
[0052] 图1:1，2表示不与亚硝酸盐反应时，荧光探针本身的激发光谱和发生光谱，1为激 发光谱，2为发射光谱，此时，最大激发波长为374nm，最大发射波长为444nm，且荧光强度很 弱。1'，2'表示荧光探针与亚硝酸盐反应后，由于生成了强荧光的产物，荧光强度明显增强， 最大激发波长为39011111，最大发射波长为45811111。焚光探针的浓度为3.0\10- 5111〇1.「1，亚硝 酸盐的浓度为l.〇Xl(T5mol · I/1，实验方法如上述步骤(3)所述。
[0053] 图2:为荧光探针与一系列浓度的亚硝酸盐标准溶液反应后的荧光发射谱，荧光探 针的浓度为3.0父10_5111 〇1.1/1，亚硝酸盐标准溶液的浓度分别为(&)0;(13)0.2\1(^ 6111〇1· L-S(c)0.4X10-6mol · L-S(d)0.6X10-6mol · L-S(e)0.8X10-6mol · L-S(f)1.0X10- 6mol · L-S(g)1.5X10-6mol · L-^(hU.OXlO-6mol · L-S(i)2.5X10-6mol · L-^(jU.OX 10-6mol · L-1; (k)3.5X10-6mol · L-1; (1)4.0 X 10-6mol · L-SUM. 5X10-6mol · L-1。实验方 法如上述步骤(3)所述。
[0054] 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进 行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 结构式如式I所示的化合物作为亚硝酸盐检测巧光探针的用途，2. -种亚硝酸盐检测巧光检测方法，其特征在于，所述方法包括W下步骤：(1) 将待测样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，得样品提取液； (2) 将步骤（1)得到的样品提取液在抑<3.0的酸性条件下与结构式如式I所示的化合物 于60°C水浴中反应30min; (3) 将步骤(2)得到的反应液用调节pH至6.0~8.0,测定巧光强度； (4) 配置亚硝酸盐标准溶液，将其与结构式如式I所示的化合物反应后，测定巧光强度， 巧光强度对应亚硝酸盐含量作校正曲线进行定量分析； (5) 依据步骤(4)得到的校正曲线计算得到待测样品中的亚硝酸盐含量。
【专利摘要】本发明涉及有机化学领域，具体涉及亚硝酸盐检测荧光检测探针及检测方法，结构式如式I所示的化合物可以作为亚硝酸盐检测荧光探针，在酸性条件下，对亚硝酸盐具有独特的识别性能，生成相应吡啶类衍生物的性质，通过检测作用前后荧光性质的改变来实现对亚硝酸盐的定量检测。本发明的亚硝酸盐检测方法相对于现有技术灵敏度和准确度更高，选择性更好。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105510295
【申请号】CN201610066427
【发明人】何兰, 王秋花, 马素芳
【申请人】中国食品药品检定研究院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日