察'项的测试结果：当疏血通注射液浓度在2.50~4.44ml原 液· mri之间时，疏血通浓度与消耗的凝血酶活性单位呈良好线性关系，可W较准确测定抗 凝血活性;特选择3.0ml原液· mri作为供试品溶液浓度，并对其进行相关方法学考察。
[0038] 4、精密度考察
[0039] 精密量取同一批号疏血通注射液(批号为12031611)6.0ml，减压浓缩(50~60°C) 至干，残渣加水溶解并完全转移至2ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，制成浓度为3.0ml原液· mri的供试品溶液;精密量取供试品溶液10化1，置适宜白瓷板中，加入含0.5% (牛)纤维蛋 白原的Ξ径甲基氨基甲烧盐酸缓冲液（临用配制）200μ1，揽匀，置水浴（37±0.5°C)溫热 5min，滴加每1ml中含10单位的凝血酶溶液(每Imin滴加1次，每次扣1，边滴加边轻轻揽匀， 每分钟揽拌10次左右)至出现整块可挑起透明凝胶状沉淀，记录滴定终点时间和消耗凝血 酶活性单位，按下式计算:U = CiVi/(C2V2);式中U-每1ml疏血通原液中含凝血酶活性单位， U/ml; C广-凝血酶溶液的浓度，U/ml; C2-供试品溶液的浓度，为3.0ml原液· ml-i; V广-消耗 凝血酶溶液的体积，μ1; V2--供试品溶液的加入量，μ1。中和一个单位的凝血酶的量，为一个 抗凝血酶活性单位。
[0040]供试品溶液重复测定6次，结果见表3;计算滴定终点时间的RSD为1.78%，表明精 密度良好。
[0041 ]表3精密度考察结果
[0042]
[00创 5、稳定性考察
[0044] 取"4精密度考察"项下的供试品溶液，分别于制备后0、2、4、化测定，记录相关数据 并计算结果，结果见表4;4个时间段测定的12个数据的总RSD为2.25%，结果表明，供试品溶 液在化内基本稳定（由于凝血酶对照品和纤维蛋白原当天配制必须当天使用，故未考察更 长时间）。
[0045] 表4稳定性考察结果
[0046]
[0047] *表中实验结果中数据为上下结构，其中居上第一个数据为滴定终点时间，单位秒 (S)，居下第二个数据为其对应滴入的凝血酶活性单位，单位U。
[004引 6重复性考察
[0049]取同一批号疏血通样品（批号12031611)，平行制备供试品溶液6份，按照"4精密度 考察"项下的操作制备供试品溶液进行测试，记录相关数据和计算结果，结果见表5,6份样 品18个数据的总RSD为3.93%，表明实验方法的重复性良好。
[(K)加]表5重复性考察结果
[0化1 ]
[0052] *表中实验结果中数据为上下结构，其中居上第一个数据为滴定终点时间，单位秒 (S)，居下第二个数据为其对应滴入的凝血酶活性单位，单位U。
[0053] 实施例2 20批疏血通注射液抗凝血酶活性的测定
[0054] 分别精密量取20批次疏血通注射液样品各6.0ml，减压浓缩(50~60°C)至干，残渣 加水溶解并完全转移至2ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，制成浓度为3.0ml原液· mri的供试 品溶液;精密量取供试品溶液1〇化1，置适宜白瓷板中，加入含0.5% (牛)纤维蛋白原的Ξ径 甲基氨基甲烧盐酸缓冲液(临用配制)200μ1，揽匀，置水浴(37°C±0.5°C)溫热5min，滴加每 1ml中含10单位的凝血酶溶液(每Imin滴加1次，每次化1，边滴加边轻轻揽匀，每min揽拌10 次左右）至出现整块可挑起透明凝胶状沉淀，记录消耗凝血酶溶液的体积，记录滴定终点 时间和消耗凝血酶活性单位并计算抗凝血酶活性。结果见表6。
[0055] 表6 20批疏血通注射液样品的滴定终点时间及抗凝血酶活性测定结果
[0化6]
[0化7]
[0058] *表中实验结果中数据为上下结构，其中居上第一个数据为滴定终点时间，单位秒 (S)，居下第二个数据为其对应滴入的凝血酶活性单位，单位U。
[0059] 实施例说明，该方法可用于测定疏血通注射液的抗凝血酶活性。根据多批次样品 的测定结果，疏血通注射液样品的抗凝血酶活性在0.94~1.33U/ml原液之间；故新标准中 初步拟定为:每1ml疏血通注射液的抗凝血酶活性不得少于0.70U。
[0060] 综上所述，本发明抗凝血酶活性测定方法的精密度、重复性良好，因此，本发明的 技术方案具有可行性。利用本发明的测定方法，可W为疏血通注射液提供一种生物学质控 方法，有助于综合评价其质量的可靠性和可控性。
[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本 发明基础上，可W对之做一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种疏血通注射液的抗凝血酶活性测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤： 所述疏血通注射液用如下方法制得：将水蛭和地龙分别用2~4倍体积的生理盐水浸 渍，反复冻融提取15~30小时，多次过滤，以体积百分数计算，将33%~84%的水蛭生理盐 水提取液与16%~67%的地龙生理盐水提取液的比例混合。 (1) 精密量取疏血通注射液适量，浓缩富集至一定浓度，作为供试品溶液； (2) 精密量取供试品溶液10~200μ1，置适宜白瓷点滴板中，加入含纤维蛋白原的三羟 甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（ΡΗ5.0~10.0)20~40(^1，搅匀，置水浴（30~45°〇温热0~ 30min； (3) 滴加每lml中含5~50单位的凝血酶溶液(边滴加边轻轻搅匀)至出现整块可挑起透 明凝胶状沉淀，记录消耗凝血酶溶液的体积； (4) 按下式计算抗凝血酶活性:U = CiVi/(C2V2);式中U-每lml疏血通原液中含凝血酶活 性单位，U/ml; 凝血酶溶液的浓度，U/ml; C2-供试品溶液的浓度，ml原液· πιΓ1; Vi-消 耗凝血酶溶液的体积，μL ;V2-供试品溶液的加入量，μL;中和一个单位的凝血酶的量，为一 个抗凝血酶活性单位。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法步骤（1)获得的供试品溶液浓缩方式包 括且不限于减压浓缩、常压浓缩、薄膜浓缩、冷冻干燥等，优选50~60°C减压浓缩。3. 如权利要求1所述方法，其特征在于该方法步骤（1)中供试品溶液的浓度范围为1.0 ~10.0ml原液· πιΓ1，更进一步优选的浓度范围为2.0~5.0ml原液· ml'4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法还包括： (1) 供试品的取样量进一步优选为50~120μ1，置适宜白瓷板中；加入的纤维蛋白原可 以是不同来源（生产厂家、品牌等），浓度可控制在0.1 %~5.0%，更进一步优选浓度为 0.3% ~0.7%〇 (2) 加入纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液pH进一步优化为6.0~8.0,且临 用配制；加入纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液量进一步优化为100~240μ1;水 域温度进一步优化为37°C ±0.5°C，温热时间优化为3~6min。 (3) 滴加凝血酶可以是不同来源(生产厂家、品牌等），浓度进一步优化为每lml含8~12 单位;滴加凝血酶溶液时，可以选用解剖针作为搅拌器材，搅拌的频率范围为〇~60次/min; 滴加的速度为每1~5min滴加1次，每次1~10μ1。
【专利摘要】本发明提供了一种可以有效测定疏血通注射液抗凝血酶活性的方法，其特征在于，采用白瓷点滴板为反应载体，控制凝血酶滴定间隔时间、凝血酶浓度、搅拌针搅拌频率，保证测定结果的稳定。本发明为疏血通注射液提供了一种生物学质控方法，有助于评价其质量的可靠性和可控性。
【IPC分类】G01N21/83
【公开号】CN105628702
【申请号】CN201610112200
【发明人】李振国, 陈艳明, 郑顺亮, 倪开岭
【申请人】牡丹江友搏药业股份有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2013年11月25日
【公告号】CN103592303A