用于肺癌的生物标记物、相关的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及活性形式的人源半胱天冬酶蛋白，优选地为人源半胱天冬酶?4或半胱天冬酶?1，或者由人源半胱天冬酶蛋白的同源基因(优选地为人源半胱天冬酶?4(例如鼠源半胱天冬酶?11蛋白)的同源基因)编码的活性形式的蛋白质在诊断和/或预后和/或监控肿瘤(特别是肺癌)的进程的方法中作为生物标记物的用途。
【专利说明】
用于肺癌的生物标记物、相关的方法和试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及活性形式的人源半胱天冬酶蛋白，优选地为人源半胱天冬酶-4或半胱 天冬酶-1，或者由人源半胱天冬酶蛋白的同源基因（优选地为人源半胱天冬酶_4(例如鼠源 半胱天冬酶-11蛋白）的同源基因）编码的活性形式的蛋白质在诊断和/或预后和/或监控肿 瘤(特别是肺癌）的进程的方法中作为生物标记物的用途。
【背景技术】
[0002] 肺癌为工业化国家中的主要死因之一，其以不良预后和低存活率为特征(Jett等 人.，1983;Pinto等人.，2011)。肺癌的危险因素之一为暴露于(吸入)致癌物(Valavanidis 等人.，2008)，虽然还没有明确定义肿瘤生长的细胞和分子机制。
[0003] 肿瘤性疾病的发生/发展与免疫系统之间的严格相关性(Coussens等人·，2013; Pinto等人.，2011; Zitvogel等人.，2012)是近年来科学的兴趣。慢性炎症是许多呼吸系统 疾病(包括肺癌）的共同特征。众所周知，肿瘤发展/进程与促进肿瘤细胞的生长超出抗-月中 瘤免疫控制的免疫抑制环境有关(Coussens等人.，2013)。尽管有经典的化疗，目前似乎在 治疗肿瘤中发挥着越来越重要的作用的概念是介入，尤其是对肿瘤微环境的免疫系统进行 "药理操纵"。
[0004] 迄今为止，目前最广泛使用的免疫治疗由白细胞激活以便获得抗肿瘤免疫应答 (Coussens等人.，2013)组成。然而，为肿瘤生长基础的慢性炎症中所涉及的特异性分子的 识别和细胞机制似乎在鉴定能够调控肿瘤生长的药物靶标方面具有最大的学术影响。
[0005] 肺上皮细胞、巨噬细胞(ΜΦ)和组织树突细胞(DC)是防御外部攻击的第一道防线， 且它们负责随后的适应性免疫应答(Pinto et等人.，2011)。对这些细胞的持续损害促进和 维持了以释放称为警报器的分子(包含IL-lcuIL-Ιβ、高迀移率族蛋白bl(HMGBl))为特征的 慢性炎症应答(Paul-Clark等人.，2012)。该警报器的合成/释放由称为炎性体的多-蛋白系 统根据半胱天冬酶-1依赖性经典通路(Latz等人.，2013)和半胱天冬酶-11依赖性非经典通 路(Kayagaki等人.，2013)精确调控。半胱天冬酶-1激活将IL-Ιβ前体和IL-18前体转变为它 们的活性形式(Lamkanfi和011^，2012)。相反地，半胱天冬酶-11促进11^-1€1和腿681的释放 (Ng和Monack，2013)。半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11均能够诱导细胞死亡 (pyropoptosis)，不同于细胞凋亡的细胞死亡，因为其诱导了在肿瘤环境中能促进有利于 肿瘤生长的免疫抑制状态的促炎症应答(Lamkanfi和Dixit，2012)。
[0006] 炎性体络合物受称为Nod样受体(NLR)和更一般地称为病原体识别受体(PRR)的胞 浆蛋白的活性调控，该病原体识别受体(PRR)能够识别在半胱天冬酶-1依赖性通路的上游 发挥作用的外源性配体(病原体相关的分子模式:PAMP)和内源性配体(危险相关的分子模 式:DAMP)(Caffrey和？^2 86抑1(1，2012)。迄今为止，识别出22种11?。虽然胞浆内的11^3受 体确实是迄今为止研究最深入的，但其在癌症中的作用似乎仍存在争议(Zitvogel等.， 2012)。事实上，NLRP3在结肠癌中发挥着保护作用，因为其基因缺失促进了与结肠上皮细胞 中的更高水平的慢性炎症相关的肿瘤生长(Allen等.，2010)。而且，NLRP3似乎对某些经典 的化疗药物(如阿霉素和5-氟尿嘧啶）的活性是必不可少的(Ghiringhelli等.，2009)。形成 鲜明对比的是，在肺转移和纤维内瘤的鼠源模型中，NLRP3激活促进了肿瘤生长(Chow等.， 2012a)，从而促进募集具有免疫抑制活性的细胞，如髓源性抑制细胞(MDSC)，该髓源性抑制 细胞(MDSC)不仅抑制细胞毒性T淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞:CTL)活性，而且还抑制天然 杀伤细胞(NK)。另外，尽管对肿瘤生长是非必要的（Chow等.，2012b)，NLRP3似乎参与由石棉 和二氧化硅(间皮瘤的催动因素)诱导的肺部炎症(Dostert等.，2008)。
[0007] 半胱天冬酶-11，人源半胱天冬酶-4的鼠源类似物，是激活非经典炎性体通路的关 键性酶(Ng和Monack，2013)。由于促炎性条件和尤其是通过致病性感染的细胞坏死，这种酶 能够诱导成熟形式的IL-la的水解，并诱导细胞外基质中HMGB1的释放(Ng和Monack，2013)。 迄今为止，在文献中有所描述的是，在细菌感染期间，通过诱导包含TIR-结构域的适配蛋白 的干扰素-KTRIF)转导通路以I型干扰素依赖性方式激活半胱天冬酶-11，该转导通路构成 激活某些Toll样受体(TLR)(如TLR4和TLR3)的基础(Bortoluci和Medzhitov，2010)。鼠源半 胱天冬酶-11和类似的人源半胱天冬酶-4在癌症(特别是肺癌）中的作用仍然是完全未知 的。因此，根据日益新兴的文献，炎性体生物学的几个方面仍未经探索，尤其是在肺肿瘤学 领域，在肺肿瘤学领域中慢性炎症似乎是肿瘤生长的催动因素(Coussens等人.，2013)。
[0008] 专利申请W02008/009028涉及用于确定患有肺腺癌的受试者的预后的方法，该方 法包括对几种细胞因子的表达进行定量，这几种细胞因子中的一些与鼠源半胱天冬酶-11 或人源半胱天冬酶-4不相关。
[0009] 此外，在M.Yamauchi等人.，（2010)中，描述了通过分析基因表达谱来鉴定人类原 发性肺肿瘤上皮细胞中的139个吉非替尼敏感基因（也包含半胱天冬酶4基因）。
[0010] 在专利申请W02010/064702中，描述了用于通过分析227个基因（包含半胱天冬酶- 1基因和半胱天冬酶-4基因）的基因表达的变化来诊断肺癌的方法。然而，之前从未描述或 暗示过活性形式的人源半胱天冬酶蛋白作为参与肺癌的生物标记物的用途。而且，既不知 晓也没有暗示鼠源半胱天冬酶-11或人源半胱天冬酶-4的促炎性细胞因子效应器(如IL-1 α)和肺癌之间的关系。
【发明内容】
[0011] 作者已经惊奇地发现，半胱天冬酶，尤其是鼠源半胱天冬酶-11 [NCBI登记号 CAA73531.1](SEQ ID No.4)和人源类似物半胱天冬酶-4[NCBI登记号NP_001216.1](SEQ ID No. 1)，以及鼠源半胱天冬酶-1 [NCBI登记号小鼠：NP_033937.2(NM_009807.2) ] (SEQ ID No.3)和人源半胱天冬酶-l[CAA46153.1](SEQIDNo.2)，参与了肺癌中的肿瘤生长。
[0012] 而且，尽管这些酶的激活因子的分子配体仍然是未知的，但本发明的作者已鉴定 出新的参与肺肿瘤生长的"激活信号通路"，其有利于鉴定新的治疗性和诊断性靶标。在通 过暴露于致癌物诱导的氧化应激过程中，产生了 8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OH-dG)，其反过来 被胞浆内受体AIM2 [NCBI登记号：小鼠：ΝΡ_001013801 · 2] (SEQ ID No · 5)、人源[NP_ 004824.1](SEQ ID No.6)(炎性体络合物的组分）识别。
[0013] AM2在小鼠中结合至半胱天冬酶-11且在人类中结合至半胱天冬酶-4，该活性形 式诱导了警报器的释放，如IL-la[NCBI 10登记号：小鼠：NP_034684[GI :47059075] ](SEQ ID Νο·7);和人源[NP_000566[GI:27894330]](SEQ ID Νο·8:)，和IL-10[NCBI登记号小鼠： NP_032387.1[GI:6680415]](SEQ ID Νο·9)和人源：NP_000567.1[GI:10835145]](SEQ ID No·10)和HMGBl[NCBI登记号：小鼠 AAI10668[GI 84040262]](SEQIDNo·ll);人源：CAG 33144.1[GI 48145843](SEQIDNo.l2)，从而促进肺肿瘤生成。而且，在人源肺癌组织中， A頂2结合至半胱天冬酶-4是非常显著的。进一步证实我们所陈述的是观察到，相比于具有 完整的且活性的半胱天冬酶-11的小鼠（C57B1/6小鼠），在不具有功能性半胱天冬酶-11的 小鼠（129Sv小鼠）或半胱天冬酶-1/11敲除的小鼠中，或者随后通过针对半胱天冬酶-11或 IL-la(半胱天冬酶-11的效应器）的特异性单抗使半胱天冬酶-11中和，观察到肺肿瘤生长 的发展显著降低。
[0014] 这些作者还确定了半胱天冬酶-l(p20kDa)的激活与肺癌之间的关系。
[0015] 因此，作者不仅确定了参与肺癌发生的新"通路"，而且确定了用于开发针对高死 亡率疾病(如肺癌）的未来治疗策略的新药物靶标。此外，与促炎性细胞因子(如IL-la和IL-1β)的存在有关、已知在肿瘤组织中处于非常高的水平的人类中的胱天蛋白酶-4的激活代 表了用于肺癌的新的诊断工具以及可能的预后工具。
[0016] 因此，在用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的进程的方法中使用的生物标记 物是本发明的一个实施方式，该生物标记物属于至少由以下物质组成的组：
[0017] a)活性形式的人源半胱天冬酶蛋白；
[0018] b)其变体、同源物、衍生物或功能性片段；
[0019] c)由所述人源半胱天冬酶蛋白基因的同源基因编码的活性形式的蛋白质。
[0020] 所述人源半胱天冬酶蛋白优选地为人源半胱天冬酶-4蛋白（SEQ ID No. 1)或人源 半胱天冬酶-1蛋白（SEQ ID No.2)。人源半胱天冬酶-4基因的同源基因为例如鼠源半胱天 冬酶-11基因。
[0021 ]所述肿瘤优选地为肺肿瘤，更优选地为肺恶性上皮肿瘤。
[0022] 本发明的另一个实施方式为用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的进程的体 外方法，该方法包括以下步骤：
[0023] a)对从受试者分离出来的样品中的如以上限定的生物标记物进行确定和/或定 量，和
[0024] b)与适当的对照进行比较。
[0025] 对生物标记物进行的定量可以对应于生物标记物的量的测量，或对应于生物标记 物的量的改变的测量，更特别地对应于生物标记物的量的增加或减少。增加可能与肿瘤的 恶化有关。减少可能与肿瘤的改善有关，或者与受试者的恢复有关。
[0026] 如果将在步骤a)中测量的量的改变与所述标记物的适当对照进行比较，所测试的 样品中的所述生物标记物的量的改变对应于增加，则步骤a)的受试者可能经历了肿瘤的恶 化。
[0027] 如果将在步骤a)中测量的量的改变与所述标记物的适当对照进行比较，所测试的 样品中的所述生物标记物的量的改变对应于减少，则步骤a)的受试者可能经历了肿瘤的改 善，或者恢复。
[0028] 在一个优选的实施方式中，该方法还包括对至少一种其它肿瘤标记物进行检测 和/或定量，并与适当的对照样品进行比较。优选地，所述其它标记物为如上所限定的生物 标记物的促炎性细胞因子效应器，更优选地所述促炎性细胞因子为IL-la、IL-li3、IL_18或 HMGBlo
[0029] IL-lα优选地以SEQIDNo·8或7为特征。
[0030] IL-lβ优选地以SEQIDNo·10或9为特征。
[0031] IL-18优选地以SEQIDNo·14或13为特征。
[0032] HMGBl优选地以SEQIDNo·12或ll为特征。
[0033] 所述细胞因子和所述细胞因子基因的同源基因编码的蛋白质的变体、同源物、衍 生物或功能性片段包含在上述细胞因子的定义中。
[0034] 在根据本发明的方法中，肿瘤优选地为肺癌，更优选地为肺恶性上皮肿瘤。
[0035] 从受试者分离出来的样品优选地为生物流体、细胞样品和/或组织样品。
[0036] 本发明的另一个实施方式为用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的进程的试 剂盒，该试剂盒包括
[0037] -用于检测和/或测量至少一种如上所限定的生物标记物的量和/或用于测量至少 一种如上所限定的生物标记物的量的改变的装置，和任选地
[0038]-控制装置。
[0039]控制装置可以用于比较生物标记物的量的增加与适当的对照的值。例如参照已知 标准从正常受试者或者从正常人群均可以获得对照值。
[0040] 用于检测和/或测量至少一种如上所限定的生物标记物的量和/或用于测量至少 一种如上所限定的生物标记物的量的改变的装置优选地为至少一种抗体、其类似物或其功 能性衍生物。所述抗体、其类似物或其功能性衍生物对所述生物标记物可以是特异性的。
[0041] 根据本发明的试剂盒还可以包括常见的辅助成分，如缓冲液、载体、染料等，和/或 使用说明。
[0042] 在根据本发明的试剂盒中，肿瘤优选地为肺癌，更优选地为肺恶性上皮肿瘤。
[0043]本发明的另一个实施方式为如上所限定的生物标记物的特异性抑制剂，用于预防 和/或治疗肿瘤，其中所述抑制剂优选地为抗体、疫苗、siRNA或低分子量药物。
[0044] 所述肿瘤优选地为肺癌，更优选地为肺恶性上皮肿瘤。
[0045] 本发明的另一个实施方式为用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的发展的体 外或离体方法，其特征在于确定生物标记物的存在，该生物标记物选自生物样品中的：
[0046] a)活性形式的人源半胱天冬酶蛋白；
[0047] b)生物样品中其变体、功能性衍生物或功能性片段。
[0048] 根据一个优选的实施方式，在本发明的方法中，人源半胱天冬酶蛋白为人源半胱 天冬酶-4(SEQIDNo.l)蛋白或人源半胱天冬酶-l(SEQIDNo.2)蛋白。
[0049] 在另一个优选的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：
[0050] a)对从受试者分离出来的样品中的所述生物标记物进行确定和/或定量，和
[0051] b)将其与给定的对照进行比较。
[0052] 本发明的另一个实施方式为对至少一种其它肿瘤标记物进行确定和/或定定量， 并与适当的对照样品进行比较。
[0053]在本发明的一个优选的实施方式中，其它标记物为如上所述的生物标记物的促炎 性细胞因子的细胞因子效应器，优选地所述促炎性细胞因子为IL-la、IL-li3、IL_18或 HMGBl〇
[0054] 本发明的另一个实施方式为一以确定了预后和/或监控肿瘤的发展和/或进程过 程中生物样品中的所述生物标记物的存在的增加和/或减少为特征的方法。
[0055] 根据本发明，从受试者分离出来的样品为生物流体、细胞样品和/或组织样品。
[0056] 本发明的另一个实施方式为用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的发展和/或 进程的试剂盒，该试剂盒包括：
[0057]-用于确定和/或用于测量至少一种生物标记物的量和/或用于测量至少一种生物 标记物的量的改变的装置，和任选地 [0058]-控制装置。
[0059] 本发明的另一个目的为生物标记物的特异性抑制剂在预防和/或治疗肿瘤中的用 途，其中所述抑制剂优选地为抗体、合成肽、氨基酸和/或核苷酸序列、疫苗、siRNA或低分子 量药物。
[0060] 根据一个优选的实施方式，所述抑制剂为选自：抗-半胱天冬酶-1抗体、抗-半胱天 冬酶-4抗体、抗-IL-la抗体、抗-IL-Ιβ抗体、抗-IL-18抗体或抗-HMGB1抗体或其片段的抗 体。
[0061 ] 根据一个优选的实施方式，所述抑制剂为选自：Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO(y-VAD-CH0)和Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CMK(Ac-Y-VAD-cmk)的人源半胱天冬酶-1的合成肽抑制剂。 [0062]根据一个优选的实施方式，所述抑制剂为具有以下肽序列：GILEGICGTV HDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRG(SEQIDNo·15)能够干扰半胱天冬酶-4 的活性部分的氨基酸序列。
[0063]根据一个优选的实施方式，所述抑制剂为使用以下肽抗原对实验用动物进行免疫 之后获得的疫苗和/或抗体：
[0077]根据一个优选的实施方式，所述抑制剂为选自能够干扰半胱天冬酶-4SEQ ID N.29(NCBI参考序列:NM_001225.3)的mRNA序列的核苷酸序列的siRNA。
[0078] 在本发明中，"适当的对照"或"合适的对照"可以为从健康受试者分离出来的或者 从患有另一种肿瘤的患者中分离出来的样品中的经过定量、测量或评估的量。
[0079] 在用于监控肿瘤的进程的方法的情况下，适当的对照的量或合适的对照样品的量 可以为在开始治疗之前的各个时间点、在治疗等过程中的各个时间点从相同受试者中分离 出来的样品中的经过定量、测量或评估的量。
[0080] 在根据本发明的体外或离体方法中，阶段a)优选地通过免疫组织化学、细胞学、 ELI SA、流式细胞术或荧光光谱测定法来实施。
[0081] 在本发明中，术语"检测"是指对表明样品中存在蛋白或者样品中所述目标蛋白的 绝对量或相对量的信号的任何方法的任何使用。该方法可以与例如通过免疫组织化学染 色、ELISA、细胞悬浮、细胞学、焚光、放射活性、比色法、重量分析、X-射线衍射或吸附、磁力、 酶活性提供信号的蛋白或核酸染色方法以及类似方法相结合。
[0082] 在本发明中，术语"定量"可以理解为对各个蛋白质的量或浓度或水平进行的测 量，优选地以半定量或定量的方式。可以直接或间接测量生物标记物。如在说明书中所使用 的，术语"量"是指但不限于蛋白质的绝对量或相对量，以及与蛋白质相关的或者可以由这 些蛋白质产生的任意其它值或参数。所述值或参数包括通过蛋白质的物理和化学性质获得 的信号强度值、通过直接测量获得的信号强度值，例如免疫分析、质谱或核磁共振中的强度 值。而且，这些值或参数包含通过间接测量获得的那些。
[0083]术语"变体"是指基本上与如上所限定的生物标记物蛋白同源的蛋白。通常，变体 包括氨基酸的增加、缺失或替换。术语"变体"还包括蛋白质的各种异构体和来源于翻译后 修饰(如，例如糖基化、磷酸化或甲基化)的蛋白质类。
[0084]术语"衍生物或功能性片段"是指以如上所述的生物标记物的相同功能(例如具有 结合AM2和/或诱导警报器(如IL-la和HMGB1)的释放的能力）为特征的蛋白质或蛋白质片 段。
[0085]当提及抗体时，术语"片段"包含scFv(双链抗体、三链抗体和四链抗体)片段、Fab 片段和F(ab'）2片段。
[0086] 本发明还涉及用于预防癌症的方法，该方法包括鉴定或检测如上所限定的生物标 记物。当鉴定出存在这种生物标记物时，可以对患者进行治疗。
[0087] 如本发明中所描述的生物标记物可以用于预防癌症。
[0088]参考以下附图以非限制性实施例对本发明进行描述。
【附图说明】
[0089] 图1.小鼠中肺癌诱导的实验方案。
[0090] 图2.通过苏木精和伊红（H&E)染色（图2A)、Ki-67 (图2B)和K-Ras (图2C)分析肺冰 冻切片。这些肺切片是从用致癌物质NMU处理的患有肺癌的小鼠获得的。（图2D)对用NMU处 理的小鼠的肺中的肿瘤生长（表示为肿瘤面积/总面积）进行定量。数据表示为平均值± SEM〇
[0091] 图3.相比于仅显示出非活性形式(p46kDa)的空白（未处理)小鼠，活性形式的半胱 天冬酶_ll(p20kDa)在不同的时间点存在于患有癌症的小鼠的肺中。
[0092] 图4 . A. C 5 7 B1 / 6小鼠相对于12 9 S v小鼠中的肿瘤生长（A) ; B .相比于对照小鼠 (CTR)，用中和IL-1 α的活性的抗体(Ab)处理的C57B1 /6小鼠中的肺癌生长。
[0093]图5. C57B1/6肺荷瘤小鼠中半胱天冬酶-1 (p20kDa)的激活（图5B)，但空白小鼠（图 5A)和129Sv小鼠（图5C)中的半胱天冬酶-1 (p20kDa)没有激活。
[0094]图6.相比于C57B1/6动物，基因缺失半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11(半胱天冬酶-1/11敲除）的小鼠中肿瘤病变减少（图6六）（#邙〈0,0005，*#吨〈0,0001)，数据堪比在1293￥ 动物中获得的数据（图6B)。用半胱天冬酶-1已知的特异性抑制剂(Ac-Y-VAD-cmk，Sigma Aldrich，cat·N.SML-0429，Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲基酮；或or y-VAD-CHO，Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO，Santa Cruz技术，美国，cat · N. sc-3069)药物性抑制减少了暴露于NMU的 C57B1/6小鼠中的肿瘤病变（图6C) (*p〈0.05，**p〈0.01)，即使这种伤害比不上半胱天冬酶-1 /11敲除和129Sv小鼠中所观察到的伤害(图6D)
[0095]图7.相比于对照动物或用对照同种型（兔子IgG)处理的动物，给药能够抑制半胱 天冬酶-11的活性的抗体显著降低了（*P〈〇.05)肿瘤块。
[0096]图8.免疫沉淀反应实验。图8A)半胱天冬酶-11结合A頂2炎性体络合物；图8B)A頂2 结合至8-OH-dG。
[0097]图9.A.从患有肺癌的患者中获得的肺组织匀浆中存在半胱天冬酶4的前体(p48-kDa)和活性形式(p20kDa)(A)。相同患者的肺"健康"部分用Η鉴别，而肿瘤部分用LC鉴别。 [0098]图9Β.患有肺癌的患者的肺组织匀浆中存在半胱天冬酶-1的前体(p46_kDa)和活 性形式(p20kDa)。
[0099]图10 . A.相比于健康个体(H)，患有癌症的患者(LC)中存在IL-1 α的活性部分；图 10Β.通过ELISA对E-?α进行定量，表示为pg/mg所分析的肺组织，C.健康的和具有肺癌的人 肺的组织匀浆中的IL-Ιβ的含量。
[0100]图11.对健康的(H)和具有肿瘤病变(LC)的肺组织匀浆进行免疫沉淀反应实验。半 胱天冬酶-4结合AIM2炎性体络合物。
[0101] 图12.表示对文献中所报道的（A)与这些作者现在所发现的（B)进行比较的流程 图。A.已知的是由于感染了病原体，经典炎性体依赖性半胱天冬酶-1通路被激活。促炎性细 胞因子，如 IL-Ιβ 和 IL-18[NCBI 登记号：小鼠：NP_032386.1](SEQ ID No. 13);人源： [AAH07461.1 (SEQ ID No. 14)]的释放提供了放大促炎性应答的级联事件，从而使得宿主能 够促进病原体清除。相反地，在肿瘤环境中，（B)由于AIM2-依赖性炎性体络合物的预致敏， 小鼠中的半胱天冬酶-11和人类中的半胱天冬酶-4参与了炎性应答的诱导。响应于对羟基 核苷(8-OH-dG，氧化应激的标记物）的A頂2识别这种机制被激活。
【具体实施方式】
[0102] 实施例
[0103] 材料和方法
[0104] 肺恶性上皮肿瘤的鼠模型.对C57B1/6小鼠（Harlan实验室，意大利)和129SV小鼠， 以及半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11敲除的小鼠 （Charles River实验室，意大利）（雌性，6-8周龄)气管内（i .t.)滴注致癌物质（N-亚硝基-N-甲基-脲(匪U)，具有烷基化和致突变活 性）。按照以下给药方案和剂量，每7天给药一次NMU，共给药三次:第0天，50yg/小鼠；第8天， 1 〇yg/小鼠和第15天，1 Oyg/小鼠（图1)。在一些实验中，将抗-1L-1 α抗体(Ab) (2yg/大鼠 i ·ρ· ;eBioscience公司，美国），或者半胱天冬酶-1抑制剂(Ac-Y-VAD-cmk: 10ug/小鼠 i ·ρ·， Sigma Aldrich公司，美国），或者抗-半胱天冬酶-11抗体（10ug/小鼠 ，i ·ρ· ; Santa Cruz公 司，美国）对用NMU处理的C57B1/6小鼠给药。根据图1中所示的方案，在不同的时间点（从第 一次NMU给药的3-7-30天)处死动物。将肿瘤病变表示为肿瘤病变面积/肺总面积的比。
[0105] 肺恶性上皮肿瘤的人源样品.按照胸外科手术和肺切除手术在患有上皮样起源的 III期肿瘤、非小细胞肺癌类型的腺癌的患者中获得人类样品。从宏观上离肿瘤区域很远的 肺部获得健康部分，用Η表示。人源组织由Department of Thoracic Surgery of the Azienda Ospedaliera Universitaria San Giovanni di Dio e Ruggi d'Aragona，萨勒 诺，意大利提供(获得知情同意）。
[0106] 免疫印迹分析.用由胶原酶（lU/ml)和DNAse I(20μg/ml)组成的消化液对老鼠肺 部和人源样品进行消化。蛋白测定后，将样品上样（50yg/样品）到12%聚丙烯酰胺凝胶上， 然后转移至硝化纤维膜。采用抗-半胱天冬酶-4(Santa Cruz公司，美国）、抗-半胱天冬酶-1 (Santa Cruz公司，美国）、抗-半胱天冬酶_ll(Santa Cruz公司，美国）、抗_IL_la(R&D System公司，英国）抗体。通过GAPDH识别进行上样对照。
[0107] 在另一组实验中，通过使用能够结合一抗（半胱天冬酶-11、或半胱天冬酶-4、或 A頂2)和特异性抗原的磁珠对人源和鼠源的组织匀浆进行免疫沉淀反应。在第二阶段，通过 采用合适的抗体对被一抗识别的具有A頂2或8-OH-dG的靶标的共探测进行评估以检测A頂2 或8-OH-dG的存在或不存在。
[0108] ELISA.按照试剂盒制造商（eBioscience公司，美国）提供的说明，对人源和鼠源肺 组织勾楽在IL_la和IL-Ιβ的存在进彳丁测试(获得知情同意）。
[0109] 免疫组织化学分析.将用NMU处理的小鼠的左叶固定在0CT介质(TedPe 1 la公司，米 兰，意大利）中，然后切成7_12μπι冰冻切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色以突出与经过免疫 荧光染色以鉴别肺癌病变中K-ras的存在(Cell Signalling公司，英国）的冰冻切片相关的 形态特征，和/或突出与根据二氨基联苯胺的方法(DAB)经过免疫组织化学分析以检测由 Ki_67(肿瘤标记物，Invitrogen公司，意大利）和HRP二抗组成的免疫络合物的冰冻切片相 关的组织的形态特征。将Ki-67(抗大鼠 IgG)的对照同种型用作阴性对照。
[0110] 统计分析.将结果表示为平均值土SEM。视情况采用单因素方差分析和/或学生t检 验对各组之间的差异进行统计分析。认为P-值小于0.05为统计学显著。
[0111] 结果
[0112] 1.半胱天冬酶-11参与小鼠的肺癌生长。
[0113] 在C57B1/6小鼠中，用NMU进行处理产生了肿瘤病变，如通过对肿瘤增殖标记物(如 Ki-67 (图2B)和K-Ras (图2C))呈阳性的肺冰冻切片（图2A)所表明的。在用匪U处理的小鼠 中，肿瘤块生长(计算为肿瘤面积和总面积之间的比）具有指数型（图2D)。
[0114] 一个非常有趣的发现(本发明的目的）为观察到，相比于没有显示出酶(P20kDa)的 活性形式而只有非活性形式(p48kDa)的空白（未处理)小鼠，从NMU给药后第3天一直到4周， 半胱天冬酶-11是活性的（图3)。
[0115]为了突出半胱天冬酶-11在肺肿瘤生长中的作用，采用缺失半胱天冬酶-11的 129Sv小鼠 （Kayagaki等人·，2011)。用MIU处理过的129Sv小鼠形成了极小的肿瘤块（7天： 0.043±0.013;30天：0.055±0.012)，相比于接受相同处理的C57B1/6小鼠（7天：0.101 土 0.013;30天：±0.123 0.016)(图4六;*邙〈0.01;#邙〈0.005)。此外，参与释放警报器（如11^-la(Ng和Monack，2013))的半胱天冬酶-11，用NMU和用抗-IL-la抗体同时处理的C57B1/6动 物显示出显著降低的肿瘤病变（7天：0.056±0.013，口〈0.05;0.047±0.016,30天$〈0.005) (图4)，完全堪比在缺失半胱天冬酶-11的129Sv小鼠中所观察到的肿瘤发展(7天:0.043土 0.013;30天:0.055±0.012)。该发现强有力地证实了半胱天冬酶-11在小鼠中的肺肿瘤生 长中的作用。
[0116] 由于已经报道了半胱天冬酶-11可以通过半胱天冬酶-1的激活而诱导非经典炎性 体通路的激活(Case等.，2013)，在我们的实验模型中我们还观察到，相比于空白小鼠，半胱 天冬酶-1在不同的时间点（3-7-30天)被激活，如图5B对5A所示。还有趣地观察到，在用NMU 处理的129Sv小鼠中半胱天冬酶-1没有被激活，这表明半胱天冬酶-1的活性和肺肿瘤生长 中存在的功能性半胱天冬酶-11之间密切相关。
[0117] 为了支持这一点，基因缺失半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11(半胱天冬酶-1/11敲 除）的小鼠显示出比C57B1/6动物小的肿瘤病变(#*p〈0 · 0005，##p〈0 · 0001)(图6A)。而 且，这些数据堪比在暴露于NMU的129Sv动物中获得的那些（图5C)，由此表明半胱天冬酶-11 对肺癌发生发挥着关键的作用。此外，为了支持以上陈述，用已知的特异性半胱天冬酶-1抑 制剂(Ac-Y-VAD-cmk:y-VAD)处理暴露于NMU的C57B1/6动物。如图6C所示，在用y-VAD处理的 动物中降低了肿瘤病变(*P〈〇.05,**p〈0.01)，尽管这种损伤不可与在半胱天冬酶-1/11敲 除和129Sv小鼠中所观察到的损伤相比（图6D)。这些数据证实了半胱天冬酶-11的主要活 性，即在肺癌发生过程中调控半胱天冬酶-1的活性。而且，相比于对照或经过处理的具有对 照同种型(兔IgG)的动物，用能够抑制半胱天冬酶-11活性的抗体处理小鼠显著减小了（*p〈 0.05)肿瘤块（图7)。
[0118] 在文献中众所周知的是，半胱天冬酶-11能够通过NLRP3(炎性体组分之一)诱导半 胱天冬酶_l(Case等人.，2013)。由于在我们的实验模型中，C57Bl/6(图3)中的半胱天冬酶-11的激活与活性半胱天冬酶-1有关(图5)，而在缺失半胱天冬酶-11的129Sv小鼠中，半胱天 冬酶-1是非活性的（图5C)，对来自空白和用NMU处理的小鼠 C57B1/6的肺组织匀浆的样品进 行免疫沉淀反应。进行该实验以确定半胱天冬酶-11结合至炎性体组分(如NLRP3和AM2)。 免疫印迹分析显示半胱天冬酶-11能够结合AM2,而不结合NLRP3(在该免疫沉淀反应分析 中没有揭示:未示出数据）（图8A)。而且，观察到结合至半胱天冬酶-1 (Schroder和Tschopp， 2010)和半胱天冬酶-11 (如本文中所表明）的A頂2的激活由羟基鸟嘌呤衍生物(8-OH-dG)诱 导（图8)。具体地，通过对从空白或NMU-处理的C57B1 /6小鼠中获得的肺组织匀浆的AM2免 疫沉淀物的免疫印迹进行的8-OH-dG检测显示出，相比于空白小鼠，8-OH-dGs被结合至具有 肺肿瘤的小鼠中的A頂2(图8B)。该发现从未在文献中报道过，且该发现提供了小鼠肺癌发 生过程中参与非经典炎性体通路的半胱天冬酶-11的新的作用机制。
[0119] 2.半胱天冬酶-4在肺恶性上皮肿瘤的人源肿瘤组织中是活性的。
[0120] 为了使本研究到翻译水平，对半胱天冬酶-11的人源类似物（即半胱天冬酶-4)的 作用进行了分析。相比于健康的组织，半胱天冬酶-4在来自7名患者的经分析的所有肿瘤组 织中是活性的（图9A)。而且，在相同的组织中，发现在肿瘤部分比在健康部分中半胱天冬 酶-1被更多地激活（图9B)。因此，人类中存在的这些酶的活性相似于在小鼠中所观察到的 活性。此外，在肿瘤组织中IL-la(图10A和B，林p〈0.005)和IL-Ιβ(图1(?，邙〈0.05)的存在比 在正常组织中高。类似于在小鼠中所观察到的，半胱天冬酶4与AM2有关，如通过对人源健 康肺组织匀浆和具有肿瘤病变的肺组织匀浆进行的免疫沉淀反应实验及其随后的免疫印 迹分析所表明（图11)。
[0121] 这些数据首次示出了活性形式的半胱天冬酶蛋白（特别是半胱天冬酶-4(人类中） 和半胱天冬酶-1)和由各个人源半胱天冬酶基因的同源基因编码，特别是由人源半胱天冬 酶-4,优选地半胱天冬酶_11(小鼠中）基因的同源基因编码的活性形式的蛋白质参与了肺 肿瘤发生。
[0122] 相比于在文献中所报道的小鼠中（图12的组A)，本作者示出了，除了半胱天冬酶-11/4在肿瘤生长中的作用，半胱天冬酶-4反过来被结合至8-OH-DG(鸟嘌呤核苷羟基化的衍 生物)的A頂2激活，这是由于作为炎性体激活基础的氧化应激，其反过来可促进由致癌物诱 导的肿瘤生长(图12的组B)。
[0123]文献目录
[0124] Allen,I.C.,TeKippe,E.M.,ffoodford,R.-Μ.Τ.,Uronis,J.M.,ΗοΙΙ,Ε.Κ., Rogers，A.B.，Herfarth，H.H.，Jobin，C.，和Ting，J.P._Y.(2010).The NLRP3inflammasome functions as a negative regulator of tumorigenesis during colitis-associated cancer.J.Exp.Med.207,1045-1056.
[0125] Bor to luc i，K · R ·，和Medzhi tov，R · ( 2010 ) · Contro 1 of inf ec t i on by pyroptosis and autophagy:role of TLR and NLR.Cell.Mol.Life Sci.CMLS 67,1643-1651.
[0126] Caffrey，D.R.，和Fitzgerald，Κ·Α· (2012) .Select Inflammasome Assembly.Science 336,420-421.
[0127] Case，C.L.，Kohler，L.J.，Lima，J.B.，Strowig，T.，de Zoete，M.R.，Flavell， R. A.，Zamboni，D.S.，和Roy，C.R.(2013).Caspase-llstimulates rapid flagellin-independent pyroptosis in response to Legionella pneumophila.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,1851-1856.
[0128] Chow，M.T.，Sceneay，J.，Paget，C.，Wong，C.S.F.，Duret，H.，Tschopp，J.，IVlollcr， A ·，和Smyth，M.J.(2012a)·NLRP3suppresses NK ce11-mediated responses to carcinogen-induced tumors and metastases.Cancer Res.72,5721-5732.
[0129] Chow，M· T ·，Tschopp，J ·，Μδ1Ι%Α ·，和Smyth，M· J · (2012b) · NLRP3promotes inflammation-induced skin cancer but is dispensable for asbestos-induced mesothelioma.Immunol.Cell Biol.90,983-986.
[0130] Coussens，L.M·，Zitvogel，L.，和Palucka，A.K.(2013).Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation:a magic bullet?Science 339,286-291.
[0131 ] Damiani，L.A.，Yingling，C.M·，Leng，S·，Romo，P·Ε·，Nakamura，J.，和Belinsky， S. A.(2008).Carcinogen-induced gene promoter hypermethylation is mediated by DNMTland causal for transformation of immortalised bronchial epithelial cells.Cancer Res.68,9005-9014.
[0132] Dostert，C·，P6tri11i，V·，Van Bruggen，R.，Steele，C.，Mossman，B·T·，和 Tschopp,J.(2008). Innate immune activation through Nalp3inflammasome sensing of asbestos and silica.Science 320,674-677.
[0133] Ghiringhel1i，F·，Apetoh，L·，Tesniere，A·，Aymeric，L·，Ma，Y·，Ortiz，C·， Vermaelen，K.，25Panaretakis，T.，Mignot，G.，Ullrich，E.，等人·（2009) .Activation of the NLRP3inflammasome in dendritic cells induces IL-1beta-dependent adaptive immunity against tumors.Nat.Med.15,1170-1178.
[0134] Jett，J·R·，Cortese，D·A·，和Fontana，R.S.(1983)·Lung cancer : Current concepts and prospects.CA.Cancer J.Clin.33,74-86.30
[0135] Kayagaki,N.,Warming,S.,Lamkanfi,M.,Vande ffalle,L.,Louie,S.,Dong,J., Newton，K ·，Qu，Y.，Liu，J.，Hel dens，S·，等人.（2011). Non-canon i cal inf lammasome activation targets caspase-11.Nature 479,117-121.
[0136] Kayagaki,N.,ffong,Μ.T., Stowe , I.B.,Ramani,S.R.,Gonzalez,L.C.,Akashi-Takamura，S.，Miyake，K.，Zhang，J.，Lee，W.P.，MuszyAski，A.，等人·（2013) .Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.Science 341， 1246-1249.
[0137] Lamkanfi，M·，和Dixit，V·M·(2012)·Inflammasomes and their roles in health and disease.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.28,137-161.
[0138] Latz，E.，Xiao，T.S.，和Stutz，A.(2013).Activation and regulation of the inflammasomes.Nat.Rev.Immunol.13,397-411.
[0139] Ng，T.M.，和Monack，D.M.(2013).Revisiting caspase-llfunction in host defense.Cell Host Microbe 14,9-14.10
[0140] Paul-Clark，M·J·，George，P·M·，Gatheral，T·，Parzych，K·，Wright，W·R·， Crawford，D.，Bailey，L.K.，Reed，D.M.，和Mitchell，J.A.(2012).Pharmacology and therapeutic potential of pattern recognition receptors. Pharmacol.Ther.135, 200-215.
[0141] Pinto，A.，Morello，S.，和Sorrentino，R.(2011).Lung cancer and Toll-like receptors.Cancer Immunol.Immunother.CII 60,1211-1220.
[0142] Schroder，K.，和Tschopp，J.(2010).The inflammasomes.Cell 140，821_832.
[0143] Valavanidis，A.，Fiotakis，K.，和Vlachogianni，T.(2008).Airborne particulate matter and human health: toxicological assessment and importance of size and composition of particles for oxidative damage and carcinogenic mechanisms .J. Environ.Sci. Health Part C Environ.Carcinog.Ecotoxicol. Rev.26, 339-362.20
[0144] Zitvogel，L.，Kepp，0.，Galluzzi，L.，和Kroemer，G.(2012)·Inflammasomes in carcinogenesis and anticancer immune responses.Nat. Immunol.13,343-351.
[0145] Yamauchi M.Yamaguchi R.等人·，PL0S 0ne，Vol.7(9)，e43923-e43923(2012).
【主权项】
1. 一种用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的发展的体外或离体方法，其特征在于 确定生物标记物的存在，所述生物标记物选自生物样品中的： a) 活性形式的人源半胱天冬酶蛋白； b) 其变体、功能性衍生物或功能性片段。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述人源半胱天冬酶蛋白为人源半胱天冬酶_4蛋 白（SEQ ID No.l)或人源半胱天冬酶-1蛋白（SEQ ID No.2)。3. 根据权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤： a) 对从受试者分离出来的样品中的如权利要求1或2中所限定的生物标记物进行确定 和/或定量，和 b) 将其与给定的对照进行比较。4. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，还包括对至少一种其它肿瘤标记物进行 确定和/或定量并与适当的对照样品进行比较。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述其它标记物为根据权利要求1或2所述的生物 标记物的促炎性细胞因子效应器，优选地所述促炎性细胞因子为IL-la、IL-li3、IL_18或 HMGBl〇6. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述方法确定了预后和/或 监控肿瘤的发展和/或进程过程中生物样品中的所述生物标记物的存在的增加和/或减少。7. 根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述从受试者分离出来的样品为生物 流体、细胞样品和/或组织样品。8. -种用于诊断和/或预后和/或用于监控肿瘤的发展和/或进程的试剂盒，包括： -用于确定和/或测量至少一种如权利要求1或2中所限定的生物标记物的量和/或用于 测量至少一种如权利要求1或2中所限定的生物标记物的量的改变的装置，和任选地 -控制装置。9. 一种如权利要求1或2中所限定的生物标记物的特异性抑制剂，用于预防和/或治疗 所述肿瘤，其中所述抑制剂优选地为抗体、合成肽、氨基酸和/或核苷酸序列、疫苗、siRNA或 低分子量药物。10. 根据权利要求9所述的特异性抑制剂，其中所述抑制剂为选自：抗-半胱天冬酶-1抗 体、抗-半胱天冬酶-4抗体、抗-IL-la抗体、抗-IL-Ιβ抗体、抗-IL-18抗体或抗-HMGB1抗体或 其片段的抗体。11. 根据权利要求1或2使用的生物标记物、根据权利要求3-7中任一项的体外或离体方 法、根据权利要求8的试剂盒、根据权利要求9使用的抑制剂，其中所述肿瘤为肺癌。12. 根据权利要求11使用的生物标记物、根据权利要求11的方法、根据权利要求11使用 的抑制剂，其中所述肺癌为肺恶性上皮肿瘤。
【文档编号】G01N33/574GK106030308SQ201580009282
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月19日
【发明人】奥尔多·平托, 瑞塔·帕特里齐亚·阿基诺, 罗莎琳达·索伦蒂诺, 米凯拉·泰尔利齐
【申请人】免疫制药股份责任有限公司