专利名称：单核苷酸多态性的实时pcr检测的制作方法
单核苷酸多态性的实时PCR检测技术领域
本申请要求在2010年10月4日提交的第61/389,412号美国临时专利申请，在2010年10月7日提交的第61/390，701号美国临时专利申请，以及在2011年6月13日提交的第13/158，593号美国专利申请的优先权，通过引用将这些申请的全部内容包含于此。
本公开描述了使用单核苷酸多态性(SNP)特异性的CataCleave 探针对SNP的实时PCR检测。
背景技术：
人类基因组计划(HGP)的完成已经为更好地了解在给定人类种群内的基因多样性以及该多样性与基因疾病的起始和诱因如何相关铺平了道路。例如，称为单核苷酸多态性(SNP)的个体之间的单核苷酸差异可能是造成表型的巨大差异的原因，其在某些情况下可以预测谁将患某种疾病或者谁将对这些疾病的特定治疗做出反应。药物基因组学领域正在快速地接近根据病人基因组成定制药物治疗。对病人的DNA中的基因突变的快速和可靠的检测可以指导医师的临床诊断和药物治疗的选择。这在肿瘤学中尤其正确，其中，致癌基因的编码区域内的离散突变的存在可以有力地预测癌症的易感性和预后。
例如，在大多数的医疗实践中，对在BRCA的肿瘤抑制基因中的有害突变的存在的基因检测现在是常规的。有害的BRCA-1突变可以大大增加妇女在早期(更年期之前)患乳房癌和/或卵巢癌的风险以及患宫颈癌、子宫癌、胰腺癌和结肠癌的风险。有害的BRCA-2突变可以另外增加胰腺癌、胃癌、胆囊和胆管癌以及黑色素瘤的风险。在包括TP53、PTEN、STK11/LKB1、⑶H1、CHEK2、ATM、MLH1和MSH2的若干其他基因中的突变已经与遗传性乳房和/或卵巢肿瘤有关。
伴随出现核酸扩增，可以将任何DNA序列的低至单个的分子复制足够的次数以允许SNP序列分析。可以通过诸如DNA测序、荧光探针检测、质谱分析法或DNA微阵列杂交(例如，第5，885，775号、第6，368，799号美国专利)的各种技术检测SNP。然而，由于总体差的灵敏度、成本、时间消耗或者对PCR后处理的需要，这些方法中的许多方法仍然不适于高通量应用。此外，现有的SNP检测方法具有不可接受的高水平的假阳性和/或假阴性的结果。
由于上述的原因，现有技术未满足在DNA扩增的同时对SNP进行精确的实时检测的需要。 发明内容
技术问题
描述了用于在实时PCR中使用包括DNA和RNA序列的特异性探针的快速检测SNP的方法和试剂盒。该方法能够有助于以经济和可靠的方式对单个PCR片段进行一个或多个SNP的高通量检测。
在一个实施例中，公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，包括以下步骤:提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品；提供可以退火到靶DNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下，在探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加，其中，信号的增加表明靶DNA中存在多态性。在一个方面中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNAiDNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。 在另一个实施例中，公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤:提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品；提供可以退火到靶DNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下，在探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA = DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时降低，其中，信号的降低表明靶DNA中存在多态性。在另一个实施例中，公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤:提供靶RNA ;提供可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火；提供包括可检测的标签以及与靶RNA的cDNA基本上互补的DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列包含与在疑似`SNP序列的位置处的相应的cDNA序列完全互补的序列；在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、位点特异性RNA酶H活性和探针的存在下，在探针中的RNA序列可以与RT-PCR DNA片段中的互补序列形成RNA:DNA异源双链体的情况下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段；以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加，其中，信号的增加表明靶RNA的cDNA中存在多态性。在一个方面中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNAiDNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。在另一个实施例中，公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤:提供将被检测具有多态性的靶RNA的存在的样品；提供可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下，在探针中的RNA序列可以与在多态性的位置包含野生型DNA序列的RT-PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段；以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时降低，其中，信号的降低表明靶RNA中存在多态性。在另一个实施例中，公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含:可以退火到靶DNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；以及扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。在另一个实施例中，公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含:可以退火到靶DNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置处包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；以及扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。在另一个实施例中，公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含:可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火；探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；以及反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。在另一个实施例中，公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含:可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火，第二扩增弓I物在多态性序列的位置的下游退火；探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；以及反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。多态性可以是单核苷酸多态性(SNP)。靶DNA可以是基因组DNA。靶RNA可以是基因组RNA或转录的mRNA。 探针的DNA序列和RNA序列可以是共价连接的。
探针上的可检测标签可以是诸如FRET对的荧光标签。PCR片段或探针可以连接到固体载体。扩增聚合酶活性可以是热稳定的DNA聚合酶的活性,位点特异性RNA酶H活性可以是热稳定的RNA酶H的活性或者热启动热稳定的RNA酶H的活性。在某些实施例中，在相同的分子上发现逆转录酶活性和扩增聚合酶活性。前述的实施例具有许多优点，包括能够实时检测靶核酸中的SNP的存在。该检测方法快速、准确并适于高通量应用。还描述了用于检测在不同的基因座处的SNP的方便、用户友好和可靠的诊断试剂盒。
技术方案
除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域内常规的分子生物学技术。这样的技术对本领域技术人员来讲是公知的，并且在文献中被充分地解释。参见，例如，Ausubel 等作者，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 公司，NY, N.Y.(1987-2008),包括所有增刊；Sambrook 等人，Molecular Cloning:ALaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。
除非另有定义，否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的意思相同的意思。本说明书也提供了对术语的定义，以有助于解释本申请的公开内容和权利要求书。如果定义与别处的定义不一致，则将以本申请中所阐述的定义为准。
术语“多态性”是指在不同的基因组或个体之间或之中出现两个或更多的替换的基因组序列或等位基因。
术语“多态的”是指在种群中发现特定的基因组序列的两个或更多的变体的情况。
术语“多态性位点”是变异发生的基因座。多态性位点通常具有至少两个等位基因，每个等位基因在选择的种群中以显著的频率出现。在被称为单核苷酸多态性(SNP)的情况下，多态性基因座可以是小至一个的碱基对。将首先被确定的等位基因形式任意地指定为参考、野生型、常见或主要形式，将其他的等位基因形式指定为替换的、次要的、少见的或变异的等位基因。
术语“基因型”是指对包含在个体或样品中的基因的等位基因的描述。
术语“单核苷酸多态性”(“SNP”)是指在等位基因之间变化的一个核苷酸的位点。单核苷酸可以被改变(取代)、移除(删除)或添加(插入)到多核苷酸序列。插入或删除SNP可以导致翻译移码。单核苷酸多态性可以落入基因的编码序列内、基因的非编码区域内或基因之间的基因间区域内。由于基因编码的简并性，在编码序列内的SNP将不必然改变产生的蛋白质的氨基酸序列。两种形式都导致相同的多肽序列的SNP称作同义的(有时称作沉默突变)，但是如果产生不同的多肽序列，则它们是非同义的。非同义的变化可以是错义或者无义，其中，错义变化导致不同的氨基酸，而无义变化导致提前的终止密码。“功能SNP”是在基因表达中 或基因产物的表达或功能中产生变化的SNP，因此最能够预测可能的临床表型。由功能SNP导致的基因功能的变化可以包括编码的多肽的变化、mRNA稳定性的变化以及转录和翻译因子与DNA或RNA的结合等。未在蛋白质编码区域内的SNP仍然可以对基因拼接、转录因子结合或非编码RNA序列产生影响。
根据实施例，本领域技术人员理解，SNP具有两种替代的等位基因，每种对应于可以存在于染色体中的核苷酸。因此，SNP由四种核苷酸(A、C、G、T)中的两种核苷酸表征。示例将是SNP在每条染色体上的给定位置处具有等位基因C或等位基因T。这表示为C >T或C/T。更常出现的等位基因首先出现(在这种情况下是C)，并被称作主要的、常见的或野生型等位基因。不常出现的取代常见等位基因的替代等位基因(在这种情况下是T)称作次要的、少见的或变异的等位基因。野生型和变异的等位基因可以分别称作常见的或少见的等位基因。由于人类是二倍体生物体(意思是每条染色体有两个拷贝)，所以每个个体在SNP处具有两个等位基因。这些等位基因可以是两个拷贝的相同的等位基因(CC或TT)，或者它们可以是不同的等位基因(CT)。CC、CT和TT被称作基因型。这些之中，CC和TT由具有两个拷贝的相同的等位基因表征，并称作纯合基因型。基因型CT在每条染色体上具有不同的等位基因，是杂合基因型。具有纯合基因型或杂合基因型的个体分别被称作纯合子和杂合子。SNP的选择实施例提供了一种检测任何靶核酸序列中的一个或多个SNP的新型方法。通过参照SNP的生物信息学数据库，极方便确定SNP在目标基因中的位置。dbSNP是来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的 SNP 数据库。SNPedia是来自于混合组织的维基-风格的数据库。OM頂数据库以文本的形式描述了多态性和例如疾病之间的联系，而HGVbaseG2P允许用户可视地询问实际的概要水平的相关数据。还可以在国际单体型图计划(International HapMap Project)找到关于SNP的珍贵的信息，其中，国际单体型图计划在整个人类基因组中寻找大约每5kb —个信息性SNP的基因型。对具有来自尼日利亚、欧洲和中国/日本的祖先的人群进行基因分型，以确定人类DNA序列变异的共同图案(单体 型)并使得该信息可以在公共领域内可免费地获得。该信息将有助于发现影响常见疾病和药物响应的序列变异。构建人类单体型图是迈向个体化治疗的重要步骤。用于基因分型的引物的选择一旦选择了基因和相关的SNP，制备用于靶核酸序列的基因分型的引物寡核苷酸和探针。“靶DNA或靶RNA”或“靶核酸”或“靶核酸序列”是指待分析的并包含目标多态性位点的核酸的区域。靶核酸序列在PCR反应或逆转录-PCR反应中用作用于扩增的模板。靶核酸序列可以包括自然产生的分子和合成的分子。示例性靶核酸序列包括但不限于基因组DNA或基因组RNA。 如这里所使用，术语“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸可以被修饰或可以包含被修饰的碱基。寡核苷酸是包含2至60个核苷酸的单链核苷酸聚合物。多核苷酸是包含两个或更多的核苷酸的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是包括退火的寡核苷酸的双链DNA，其中，第二链是具有第一寡核苷酸的反向互补序列的寡核苷酸，多核苷酸也可以是包含脱氧胸苷的单链核酸聚合物、单链RNA、双链RNA或RNA/DNA异源双链体。核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化核酸、从诸如线粒体或叶绿体的亚细胞器获得的核酸以及从可以存在于生物试样上或生物试样中的DNA或RNA病毒或者微生物获得的核酸。核酸可以由单一类型的糖配基组成，例如，如在RNA和DNA的情况下，或者可以由不同的糖配基的混合物组成，例如，如在RNA/DNA嵌合体的情况下。如这里所使用，术语“寡核苷酸”与“引物”或“多核苷酸”交换地使用。术语“弓I物”是指在PCR反应中用作DNA合成起始位点的寡核苷酸。引物通常是大约15至大约35个核苷酸长并杂交到与靶序列互补的区域。可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如，化学合成)来合成和制备寡核苷酸。寡核苷酸也可以通过商业来源方便地购得。本领域技术人员将容易地优化并确定在PCR反应中与目标多态性位点侧接的引物。商业购得的引物可以用于扩增特定SNP的目标特定基因。许多计算机程序(例如,Primer-Express)可容易地用于设计理想引物组。对于本领域技术人员来说明显的将是，可以相应地基于提供(或者使用登录号公开地获得)的核酸信息来制备引物和探针。
术语“退火”和“杂交”被交换地使用，并表示一个核酸与另一个核酸的碱基对相互作用，导致形成双链体、三链体或其他更高级的结构。在某些实施例中，初级相互作用是通过沃森/克里克以及胡斯坦型氢键的碱基特异性，例如，A/T和G/C。在某些实施例中，碱基堆积和疏水作用也可以有助于双链体的稳定。基本上互补是指序列上充分互补以退火并形成稳定的双链体的两条核酸链。
本领域技术人员将知道如何设计与目标多态性位点侧接的PCR引物。合成的寡核苷酸的长度通常在20和26个碱基对之间，具有大约55°C的熔点(TM)。可以在由国际单体型图计划创建的分配文件中找到用于引物设计的旁侧序列。这些文件包含大量的关于每个SNP的信息，包括观察的等位基因和每个侧面的IOOObp的NCB1-遮蔽序列。
核酸模板的制备
在一些实施例中，样品包括纯化的核酸模板(例如，mRNA、rRNA及其混合物)。从样品提取和纯化RNA的程序在本领域内是公知的。例如,可以使用TRIzol 试剂(Invitrogen)提取法从细胞分离RNA。然后，使用例如Nanodrop 分光光度计和Agilent2100生物分析仪确定RNA的量和质量。
在其他实施例中，样品是细胞裂解液，通过使用pH为大约6至大约9的裂解缓冲液、浓度为大约0.125%至大约2%的两性离子洗漆剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物和诸如蛋白酶K(大约lmg/ml)的蛋白酶裂解细胞来产生所述细胞裂解液。在55°C温育15分钟之后，在95°C处理10分钟使蛋白酶K失活，以产生适合于高效PCR或逆转录PCR分析的“基本上无蛋白质”的裂解液。
在一个实施例中，Ix裂解试剂包含12.5mM Tris乙酸盐或Tris-HCl或HEPES (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(PH = 7-8)、0.25% (w/v) CHAPS,0.3125mg/ml 叠氮化钠和lmg/ml的蛋白酶K。
这里使用的术语“裂解液”是指具有裂解的细胞碎片和核酸的液相。
如这里所使用，术语基本上无蛋白质是指大部分蛋白质经蛋白酶的水解切割而失活的裂解液。蛋白酶可以包括蛋白酶K。在细胞裂解过程中加入蛋白酶K使核酸酶迅速失活，否则核酸酶会降解靶核酸。可以对“基本上无蛋白质”的裂解液进行除去失活的蛋白质的处理，或者可以不进行该处理。
如这里所使用，术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞。
在一个实施例中，术语“细胞”可以指诸如细菌的微生物，细菌包括但不限于革兰氏阳性细菌、革兰氏 阴性细菌和耐酸细菌等。在某些实施例中，可以使用表面的擦拭取样(swab sampling)来收集待测“细胞”。在其他实施例中，“细胞”可以指病原生物体。
在其他实施例中，试样包括病毒核酸，例如，逆转录病毒核酸。在某些实施例中，试样可以包括慢病毒核酸，例如，HIV-1或HIV-2。
如这里所使用，“两性离子洗涤剂”指表现出两性离子特性(例如，不具有净电荷、无导电性和电泳迁移率、不与离子交换树脂结合、破坏蛋白质-蛋白质相互作用)的洗涤剂，其包括但不限于CHAPS、CHAPSO和三甲铵乙内酯衍生物，例如，三甲铵乙内酯衍生物优选是以商品名 Zwittergent (Calbiochem, San Diego, CA)和 Anzergent (Anatrace 公司，Maumee，0H)出售的磺基三甲铵乙内酯。在一个实施例中，两性离子洗涤剂是CHAPS (CAS号:75621_03_3 ；可从SIGMA-ALDRICH购得，产品号为C3023-1G)，CHAPS是3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的缩写(在第4，372，888号美国专利中被更详细地描述)，具有结构:
权利要求
1.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，包括以下步骤: a)提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品； b)提供能够退火到靶DNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火； c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补； d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA = DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及 e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加， 其中，信号的增加表明靶DNA中存在多态性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA = DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，探针的RNA核酸序列包含与靶DNA中的多态性互补的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，多态性是单核苷酸多态性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，探针的DNA和RNA序列是共价连接的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，探针上的可检测标签是荧光标签。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，荧光标签包含荧光共振能量转移对。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，PCR片段被连接到固体载体。
9.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品； b)提供能够退火到靶DNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火； c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补； d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA = DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及 e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时减小， 其中，信号的减小表明靶DNA中存在多态性。
10.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供将被检测具有多态性的靶RNA的样品； b)提供能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火； c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补， 探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补； d)在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的逆转录PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段；以及 e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加， 其中，信号的增加表明靶RNA中存在多态性。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA = DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，探针的RNA核酸序列包含与在靶RNA中的多态性的位置处的cDNA互补的RNA序列。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，多态性是单核苷酸多态性。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，靶RNA是转录的mRNA。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，探针的DNA序列和RNA序列是共价连接的。
16.根据权利要求10所述的方法，其中，探针上的可检测标签是荧光标签。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，荧光标签包含荧光共振能量转移对。
18.根据权利要求10所述的方法，其中，探针或PCR片段连接到固体载体。
19.根据权利要求10所述的方法，其中，RNA酶H活性是热启动热稳定的RNA酶H的活性。
20.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供将被检测具有多态性的靶RNA的样品； b)提供能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火； c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补； d)在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的逆转录PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段；以及 e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时减小， 其中，信号的减小表明靶RNA中存在多态性。
21.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含: a)能够退火到靶DNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火； b)探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补； c)扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，探针的RNA核酸序列包含与在靶DNA中的多态性互补的序列。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，多态性是单核苷酸多态性。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，探针的DNA序列和RNA序列是共价连接的。
25.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，探针上的可检测标签是荧光标签。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，荧光标签包含荧光共振能量转移对。
27.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，探针或PCR片段连接到固体载体。
28.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含: a)能够退火到靶DNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火； b)探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置处包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补； c)扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。
29.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包含: a)能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火； b)探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；以及 c)反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中，探针的RNA核酸序列包含与在靶RNA中的多态性的位置处的cDNA互补的序列。
31.根据权利要求29所述的试剂盒，其中，多态性是单核苷酸多态性。
32.根据权利要求29所述的试剂盒，其中，探针的DNA序列和RNA序列是共价连接的。
33.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，探针上的可检测标签是荧光标签。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，荧光标签包含荧光共振能量转移对。
35.根据权利要求29所述的试剂盒，其中，探针或逆转录PCR片段连接到固体载体。
36.根据权利要求29所述的试剂盒，其中，在相同的分子上发现逆转录酶活性和扩增聚合酶活性。
37.一种用于 靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒，所述试剂盒包括: a)能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火； b)探针，包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；以及 c)反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。
全文摘要
公开了用于实时PCR中的多态性检测的方法和试剂盒。使用PCR引物执行对靶核酸序列的实时PCR扩增，其中，引物退火到与目标的单核苷酸多态性(SNP)侧接的序列。实时PCR反应包括标记的探针，标记的探针包括被设计为退火到在SNP位置处的DNA序列的RNA序列。然后，可以在PCR片段中的SNP和与SNP互补的探针的RNA序列之间形成RNA:DNA异源双链体。RNA酶H对RNA:DNA异源双链中的RNA序列的切割导致由标签产生的信号的强度的增加，这表明在靶核酸中存在SNP。
文档编号G06F19/22GK103154271SQ201180048810
公开日2013年6月12日 申请日期2011年10月4日 优先权日2010年10月4日
发明者詹森·欧普迪克, 约翰·哈尔威 申请人:三星泰科威株式会社