一种硅壳荧光磁性纳米粒及制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种硅壳荧光磁性纳米粒及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因和药物转运领域，具体地涉及一种硅壳荧光磁性纳米粒。
本发明还涉及上述硅壳荧光磁性纳米粒的制备方法。 本发明还涉及上述硅壳荧光磁性纳米粒的应用。
背景技术：
血脑屏障的存在成为中枢神经系统疾病治疗的瓶颈。目前临床上普遍 采用的脑内插管、脑室注射等神经外科学方法，易造成颅内感染、不利于 长期用药。因此采用非开颅法跨血脑屏障的药物转运研究日益成为当前脑 类疾病治疗的研究热点。纳米粒与毛细血管壁有较强的吸附力，在局部产 生较高的浓度梯度，容易渗透到很细的毛细管内，在透过血脑屏障方面有 巨大潜力。因此，采用注射方法治疗神经系统疾病具有重大的潜在应用价
值。目前聚山梨脂80包被的纳米粒具有较好的透过血脑屏障的能力，但同 时也显示了一定的毒性。
Kim报道了硅壳荧光磁性纳米粒(Fe304@Si02(FITC))的制备及其穿 越血脑屏障的研究。由于纳米粒表面未经任何修饰，在表面的FITC等有 机荧光分子一旦接触到细胞或组织时，有可能会导致潜在的毒性作用。此 外，包覆在二氧化硅内部的有机染料还会产生可能泄露导致的毒性和光不 稳定性。

发明内容
本发明的目的在于提供一种硅壳荧光磁性纳米粒。 本发明的又一目的在于提供制备上述硅壳荧光磁性纳米粒的方法。 为实现上述目的，本发明提供的硅壳荧光磁性纳米粒，以直径5纳米 ~50纳米的超顺磁性Fe304为内核，包埋在二氧化硅形成的硅壳中间；该
4硅壳中同时包埋有荧光物质；该硅壳的表面分别修饰有氨基或酯基的聚酰 胺-胺树状大分子。
所述的硅壳荧光磁性纳米粒，其中，所述内核Fe304磁性物质中有钴、
镍、锰中的一种或几种氧化物。
所述的硅壳荧光磁性纳米粒，其中，所述荧光物质为荧光素异硫氰酸 酯或罗丹明异硫氰酸酯。
本发明提供的制备上述表面修饰有氨基的聚酰胺-胺树状大分子的硅
壳荧光磁性纳米粒，其主要步骤为
1) 将聚酰胺-胺树枝状大分子溶于无水甲醇中，磁力搅拌下加入异氰
酸丙基三乙氧基硅烷(ICP)，异氰酸丙基三乙氧基硅垸与聚酰胺-胺树枝 状大分子的摩尔比为1:0.5-1.5，室温避光搅拌24-36小时；
2) 将步骤1得到的产物加入到Fe3CMgSi02的无水甲醇溶液中，避 光搅拌24-48小时，用磁铁从反应溶液中分离出灰棕色的固体，所得固体 采用倾注法用无水乙醇和无水甲醇洗涤，真空干燥，得到表面修饰有氨基 的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒
(Fe304@Si02(FITC)-PAMAM)。
本发明提供的又一种制备方法，用丙烯酸甲酯(MA)将上述制备的 Fe304@Si02(FITC)-PAMAM表面的氨基酰胺化，得到表面修饰有酯基的聚 酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒(Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA);其主要步骤为
将表面修饰有氨基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒分 散在无水甲醇中，加入丙烯酸甲酯(丙烯酸甲酯与硅壳荧光磁性纳米粒表 面氨基的比例应大于10)，避光搅拌24-48小时，用磁铁从反应溶液中分 离出灰棕色的固体，所得固体采用倾注法用无水乙醇洗涤，真空干燥，得 到表面修饰有酯基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒。
所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子包括所有商品化的半代 和整代及其对硅球的直接修饰。
所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子包括在硅球上所有逐代 合成的半代和整代的聚酰胺-胺树状大分子。以及能产生氨基和酯基的所有 试剂。本发明首次分别将胺端基和酯端基的聚酰胺-胺树状大分子共价键和在硅壳荧光磁性纳米粒的表面，同时载体内部镶嵌的荧光染料不仅可以用于荧光示踪又可以作为模型药物研究。该载体表面由于覆盖聚酰胺-胺树状分子，具有大量可供修饰的官能团，可用于连接更易于靶向血脑屏障的抗体而具有成为靶向药物载体的潜力。研究结果表明两种材料通过颈总动脉注射，可以穿越血脑屏障，并且其体外细胞吞噬实验表明它们可以进入脑胶质瘤细胞，从而使其在治疗脑部疾病及细胞内标记、转运方面具有巨大的潜力。


图1是本发明Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM的透射电子显微镜(TEM)图。
图2是本发明Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA的TEM图。
图3是载体的热失重分析(TGA)图；其中
a是公知产品Fe304@Si02(FITC);
b是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM;
c是本发朋Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA;
图中的横坐标为温度，纵坐标为重量百分数。从图中可以看出a、 b、c的失重百分数逐渐增加从而证明硅壳荧光磁性纳米粒的表面官能团的正确键和。
图4是载体在不同pH值下的zeta电势图；其中a是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM;b是本发明Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA;c是公知产品Fe304@Si02(FITC);
图中的横坐标为pH值，纵坐标为电位值。从图中可以看出硅壳荧光磁性纳米粒表面修饰后zeta电势相应改变也证明载体表面官能团的正确键和。
图5是载体内部镶嵌的荧光素FITC在模拟体液中的释放曲线；其中翻是公知产品Fe304@Si02(FITC);A是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM;*是本发明Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA;
图中的横坐标为时间，纵坐标为FITC累计释放百分数。结果表明硅壳荧光磁性纳米粒表面修饰官能团后可减缓内部FITC的释放速率。图6是动脉给药载体；其中.-A是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA;
B是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM后大鼠脑切片的激光共聚焦显微镜图(图中的R是右脑、L是左脑；图中a为单纯激发DAPI的荧光谱图，b为单纯激发FITC的荧光谱图，c为a和b二者的叠加谱图)。可观察到两种载体在鼠脑中均有分布。
图7是脑胶质瘤细胞与载体；其中
A是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM;
B是本发明Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA共孵育4小时后经DAPI染色的荧光显微镜图(图中a为单纯激发DAPI的荧光图，b为单纯激发FITC的荧光图，c为a和b的叠加图)。可观察到载体紧紧包围在蓝色细胞核的周围，已经进入到脑胶质瘤的内部。
图8是载体；其中
A是本发明Fe304@Si02(FITC)-PAMAM;
B是本发明Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA进入脑胶质瘤细胞的电镜图。
具体实施例方式
本发明提供了表面分别修饰有氨基或酯基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒。为叙述上的方便，将表面修饰有氨基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒用Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM的表示(如图l所示)。将表面修饰有酯基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒用Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA表示(如图2所示)，其中MA代表丙烯酸甲酯。
树状分子修饰的硅壳荧光磁性纳米粒，由于在二氧化硅外面修饰了一层树状分子，这类纳米粒具有好的光稳定性和生物相容性，不仅用来实现高效、稳定的体内外组织或细胞的标记和造影，同时由于内部可以包覆、外部氨基可以共价或物理结合药物、DNA等，因此可用作基因和药物载 体。
本发明的树状分子修饰的硅壳荧光磁性纳米粒， 一种外表面是氨基， 而另一种是酯基。不同的表面官能团修饰用来评估对血脑屏障的穿透能 力。
本发明制备硅壳荧光磁性纳米粒的方法中
采用共沉淀法制备Fe304，在FeCl3.6H20、 (NH4)2Fe(S04)2'6H20、 NH3.H20和油酸的存在下，制得了油酸包被的Fe304磁性纳米粒子。
采用的是油包水微乳液法制备Fe304@Si02(FITC)，将Fe304粉末溶解 在环己烷中，加入曲拉通X-IOO、正己醇、H20、正硅酸乙酯(TEOS)，搅 拌后加入氨水，通过TEOS的水解和縮聚，形成二氧化硅包覆的磁性内核。 再加TEOS和FITC-APS的乙醇溶液，反应形成FITC镶嵌的二氧化硅包 覆层。
Fe304@Si02(FITC)-PAMAM的制备，采用了聚酰胺-胺树状大分子对 Fe30過Si02(FITC)的修饰，是通过具有双官能团的异氰酸丙基三乙氧基硅 垸(ICP)作连接臂，先用ICP—端的异氰酸基与聚酰胺-胺树状大分子连接， 再将另一端的硅乙氧基与Fe30過Si02(FITC)表面的羟基反应，得到氨端基 的Fe304@Si02(FITC)-PAMAM。
Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA的制备，采用了丙烯酸甲酯(MA)， 对Fe304@Si02(FITC)-PAMAM的PAMAM氨基进行酰胺化加成反应，得 到酯端基的Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA。
本发明提供的氨基或酯基的Fe304@Si02(FITC)-PAMAM，由于在硅壳 荧光磁性纳米粒(Fe304@Si02(FITC))表面共价键合了一层聚酰胺-胺树状 大分子树状大分子，有效的覆盖了硅壳表面的FITC分子，避免了其对周 围环境的接触所导致的毒副作用。同时阻止了纳米粒包覆的FITC的外泄， 保持了FITC的光稳定性。
本发明提供的氨基和酯基的Fe304@Si02(FITC)-PAMAM，在进行颈总 动脉注射后，能有效地穿越血脑屏障，特别是酯基的 Fe304@Si02(FITC)-PAMAM具有更大的优势。为非破坏性穿越血脑屏障，
标记和治疗脑部疾病开辟了一条新的途径。在对9L脑胶质瘤细胞的标记实验中，氨基和酯基的Fe304@Si02(FITC)-PAMAM均能有效地标记9L细 胞，为从分子水平研究细胞提供了一个有效的方法。
实施例1
Fe304的制备
采用Lopez-Lopez et al法合成油酸包被的Fe304磁性纳米粒子将 3.04g FeCl3-6H20与2.65g (NH4)2Fe(S04)2.6H20混合(Fe3, Fe2+=2:1.2)，溶 于40ml水中，剧烈搅拌下，迅速加入8mlNH3'H20和0.8ml油酸，N^呆 护下反应l小时，升温至95t:，冷却，调pH至5 6，用永磁铁从反应溶 液中分离出黑色的Fe304固体，所得固体采用倾注法用水洗涤三次后，乙 醇洗三次，真空干燥。
实施例2
Fe304②Si02(FITC)的制备
室温下将15mg Fe304粉末溶于231 ml环己烷中，搅拌下加入60g曲 拉通X-100、 48ml正己醇、10.2ml H20、 1.2ml正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌 6小卩寸。然后加入3 ml氨水，反应24小时，加入900ial TEOS和600^1 FITC-APS乙醇溶液，搅拌24小时。用永磁铁从反应溶液中分离出红棕色 的Fe30過Si02(FITC)固体，所得固体采用倾注法用无水乙醇洗五次，无水 甲醇洗一次，再分散在40ml无水甲醇中。
实施例3
ICP-PAMAM的制备
室温下将91mg 2.0代聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子溶于6ml无水 甲醇中，磁力搅拌下加入7iLil(0.028mmo1)异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ICP)， 避光搅拌24小时。
实施例4
Fe304@Si02(FITC)-PAMAM的制备
室温下将上述ICP-PAMAM的溶液加入到Fe304⑥Si02(FITC)的甲醇
溶液中，避光搅拌48小时。用永磁铁从反应溶液中分离出 Fe304@Si02(FITC)-PAMAM固体(其透射电镜图见图1)，所得固体采用 倾注法用无水乙醇洗三次，无水甲醇洗两次后，真空干燥。 实施例5Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA的制备
室温下将n0mg Fe304@Si02(FITC)-PAMAM固体分散在170ml无水 甲醇中，适当超声助溶。缓慢滴加25ml(0.277mol)丙烯酸甲酯(MA)， 避光搅拌24小时。用永磁铁从反应溶液中分离出 Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA固体(其透射电镜图见图2)，所得固体 采用倾注法用无水乙醇洗五次，真空干燥。
本发明产品 Fe304@Si02(FITC)-PAMAM 禾B Fe304@Si02 (FITC)-PAMAM-MA的热失重及zeta电势的表征见图3、 4。
实施例6
载体中FITC的释放实验
分别将10mg的Fe304@Si02(FITC), Fe304@Si02(FITC)-PAMAM, Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA溶解于3ml模拟体液中，迅速移入透析 袋中，在具塞广口瓶中放入10ml同样的模拟体液作为外相。释放实验在 摇床中进行，振荡频率为80转/分钟，温度维持在37'C。在不同的时间间 隔，取2ml外相溶液，并迅速补充2ml模拟体液以保持外相总体积不变。 在激发波长495nm处用荧光分光光度计分析载体中释放出FITC的量。其 释放曲线见图5。
实施例7
动物实验
1)大鼠颈动脉注射通过颈总动脉灌注的方法将载体注入大鼠体内
大鼠以10%水合氯醛1.2ml/kg，腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈正中切口， 暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，电凝颈外动脉的两个细小分 支，在颈外动脉的第一个分支前结扎，在结扎处的远心端电凝。将颈外动 脉反折并从其插管通过颈外动脉用蠕动泵将载体的生理盐水溶液 (26mg/kg体重)注入颈内动脉，注射完载体后再注入少量生理盐水，取 出导管，颈外动脉注药处结扎，缝合。
2)取脑组织及后固定注射药物半小时后，大鼠以10%水合氯醛 1.2ml/kg，腹腔注射麻醉，仰卧固定，沿胸廓下沿打开胸腔，在心尖处用 眼科剪剪一个小开口，将灌注针由左心室插入总动脉，固定灌注针，打开 灌注泵，以30ml/min灌注生理盐水，同时按摩肝脏，待肝脏发白后，相同速度用冷丙酮继续灌注5min，调慢流速至5ml/min，继续灌注至各组织 发硬为止(约20 30min)，断头取脑置于冷丙酮中24~48小时后，弃去 丙酮，换30%的蔗糖溶液后固定至组织沉于瓶底。
3) 组织冰冻切片将组织从蔗糖溶液中取出后，蒸馏水清洗干净， 切成适宜大小的块置于冰台上。液氮中速冻10秒，用包埋剂OCT包埋组 织，置切片机中预冻l小时，切成厚度为lOpm的薄片，展于载玻片上。
4) 组织切片的DAPI染色组织切片用PBST溶液(含曲拉通X-IOO) 洗两次，每次5分钟。加入DAPI溶液，37。C孵育15分钟，吸去DAPI 溶液，用PBS洗3次，每次3-5分钟，甘油封固。
5) 分析:'激光共聚焦显微镜下观察大鼠的各组织切片见图6。 实施例8
细胞实验
1) 细胞培养9L细胞(大鼠脑胶质瘤细胞)使用DMEM培养基(含 10%的小牛血清蛋白，100U/ml的青霉素，100U/ml链霉素)，在37。C含 有5%C02的保湿培养箱中培养24小时。
2) 荧光倒置显微镜观察载体在细胞内分布的实验首先将9L细胞接 种于24孔板，孵育24小时。而后将Fe304@Si02(FITC)-PAMAM和 Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA载体分别用培养基配成浓度为0.05 mg/ml的溶液，分别向24孔板不同孔内加含载体的培养基，共同孵育。4 小时后吸弃含载体的培养基，用PBST溶液将细胞洗涤三遍，4%多聚甲醛 溶液固定15分钟，再用PBST溶液将细胞洗涤三遍。加入DAPI溶液染色 15分钟，吸去DAPI溶液，用PBS洗3次，荧光倒置显微镜观察载体在 细胞内分布见图7。
3) 透射电子显微镜观察载体进入细胞实验
将Fe304@Si02(FITC)-PAMAM和Fe304@Si02(FITC)-PAMAM-MA载 体分别用培养基配成浓度为0.05 mg/ml的溶液与9L细胞共孵育4小时， 终止培养吸弃含载体的培养基，分别用戊二醛、多聚甲醛、娥酸固定，一 系列的乙醇溶液脱水，环氧树枝包埋，用超薄切片机切片后用透射电子显 微镜观察载体进入细胞情况见图8。
ii
权利要求
1、一种硅壳荧光磁性纳米粒，以直径50纳米～250纳米的超顺磁性Fe3O4为内核，包埋在二氧化硅形成的硅壳中间；该硅壳中同时包埋有荧光物质；该硅壳的表面分别修饰有氨基或酯基的聚酰胺-胺树状大分子。
2、 如权利要求1所述的硅壳荧光磁性纳米粒，其中，所述内核Fe304 磁性物质中有钴、镍、锰中的一种或几种氧化物。
3、 如权利要求1所述的硅壳荧光磁性纳米粒，其中，所述荧光物质 为荧光素异硫氰酸酯或罗丹明异硫氰酸酯。
4、 一种制备权利要求1所述硅壳荧光磁性纳米粒的方法，其主要步 骤为1) 将聚酰胺-胺树状大分子溶于无水甲醇中，磁力搅拌下加入异氰酸 丙基三乙氧基硅烷，异氰酸丙基三乙氧基硅垸与聚酰胺-胺树状大分子的摩 尔比为1:0.5-1.5,室温避光搅拌24-36小时;2) 将步骤1得到的产物加入到Fe304⑥Si02的无水甲醇溶液中，避 光搅拌24_48小时，用磁铁从反应溶液中分离出灰棕色的固体，所得固体采用倾注法用无水乙醇和无水甲醇洗涤，真空干燥，得到表面修饰有氨基 的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒。
5、 一种制备权利要求1所述硅壳荧光磁性纳米粒的方法，用丙烯酸 甲酯将权利要求4制备的硅壳荧光磁性纳米粒表面的氨基酰胺化，其主要 步骤为将表面修饰有氨基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒分 散在无水甲醇中，加入丙烯酸甲酯，丙烯酸甲酯与硅壳荧光磁性纳米粒表 面氨基个数的比例大于10,避光搅拌24-48小时，用磁铁从反应溶液中分 离出灰棕色的固体，所得固体采用倾注法用无水乙醇洗涤，真空干燥，得 到表面修饰有酯基的聚酰胺-胺树状大分子的硅壳荧光磁性纳米粒。
6、 如权利要求4或5所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子 包括所有商品化的半代和整代及其对硅球的直接修饰。
7、 如权利要求4或5所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子 包括在硅球上所有逐代合成的半代和整代的聚酰胺-胺树状大分子。以及能产生氨基和酯基的所有试剂。
8、 权利要求1所述的硅壳荧光磁性纳米粒在制备治疗脑部疾病药物 中的应用。
9、 权利要求1所述的硅壳荧光磁性纳米粒在制备作为细胞标记药物 中的应用。
全文摘要
一种氨基或酯基树枝状分子修饰的硅壳荧光磁性纳米粒，采用共沉淀法制备超顺磁性Fe₃O₄内核，通过正硅酸乙酯(TEOS)的碱性水解形成二氧化硅包埋的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)，同时将荧光染料(荧光素异硫氰酸酯，FITC)共价包埋在二氧化硅层内便于载体示踪或作为一种模型药物。该载体不仅可以荧光示踪，其外表面由于覆盖聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子，具有大量可供修饰的官能团，用于连接更易于靶向血脑屏障的抗体而具有成为靶向药物载体的潜力。研究结果表明两种材料通过颈总动脉注射，可以穿越血脑屏障。而且酯基的比氨基的硅壳荧光磁性纳米粒更易穿越血脑屏障。此外，该类载体还可用于细胞标记。
文档编号H01F1/10GK101671554SQ20081011980
公开日2010年3月17日 申请日期2008年9月10日 优先权日2008年9月10日
发明者于景娴, 玲 叶, 库姝婷, 慧 杨, 楠 王, 迎 王, 赵焕英, 琳 高 申请人:首都医科大学