使用补体C5a受体调节剂治疗神经系统病症的制作方法

专利名称:使用补体C5a受体调节剂治疗神经系统病症的制作方法
发明领域本发明涉及使用具有调节C5a受体活性的能力的新的环状多肽以及肽模拟化合物治疗神经系统病症。所述化合物优选作为C5a受体的拮抗剂，以及对多形核白细胞、单核细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞上的C5a受体是活性的。在本发明的优选的实施方式中，神经系统病症是神经退行性疾病(neurodegenerative disease)、神经免疫失调、由血脑屏障功能异常引起的疾病以及中风。
发明背景所有引用文献包括任何专利或专利申请，在此引入说明书作为参考。不经允许，任何引用的文献不构成现有技术。所述参考文献的论述表明了作者要求以及申请人保留对所述引用文件的准确性以及相关性提出异议的权利。很容易理解，虽然在此引用了一些现有技术出版物，但这种参考并非承认任何这些文献构成了在澳大利亚或任何其它国家的所述技术领域：
中公共常识的一部分。
G蛋白偶联受体在人体内普遍存在，包括已知细胞受体类型的大约60％，并介导非常广泛范围的内源性配体的跨细胞膜信号转导。它们参与多种类型的生理和病理生理过程，包括但不限于与心血管、中枢和周围神经系统、生殖、新陈代谢、消化、免疫、炎症和生长失调相关的过程，以及与其它的细胞调节和增殖失调相关的过程。选择性调节G蛋白偶联受体功能的物质具有重要的治疗性应用。由于这些受体在信号转导中的极其重要的作用，因此逐渐地认识到它们可以作为重要的药物靶位(G protein-coupledReceptors，IBC Biomedical Library Series，1996)。
研究最深入的G蛋白偶联受体之一是C5a受体。C5a是已知最有效的趋化剂之一。它具有多种活性，包括(a)募集嗜中性粒细胞和巨噬细胞到损伤位点；(b)改变嗜中性粒细胞和巨噬细胞的形态；(c)诱导嗜中性粒细胞脱粒；(d)增加钙转移、血管通透性(浮肿)和嗜中性粒细胞粘附；(e)诱导平滑肌收缩；(f)刺激炎性介质的释放，包括组胺、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、前列腺素和白细胞三烯；(g)刺激溶菌酶释放；(h)促进氧自由基的形成；和(i)增强抗体产生(Gerard and Gerard 1994)。
限制C5a的促炎症作用的物质具有抑制急性和慢性炎症以及其伴随的疼痛和组织损伤的潜在作用。因为这种化合物作用于上述多种炎症介质的上游，而且抑制许多这些介质的形成，比那些直接抑制这些介质或其受体活性的物质在减轻或预防炎症症状可能具有更有效的效果。
我们在先前的申请No.PCT/AU98/00490中描述了一些人C5a的C-末端类似物的三维结构，而且利用这些信息来设计结合人C5a受体(C5aR)的新化合物，其作为C5a的激动剂或拮抗剂。以前认为对于受体结合和拮抗剂活性，假定的拮抗剂可能既需要C末端精氨酸和C末端羧化物。实际上，我们示出对于高亲和力结合C5aR或者对于拮抗剂的活性而言，末端羧化物基团通常不是必需的。而我们发现了一个迄今没有认识到的结构特征，一个转角构象，是高亲和力结合嗜中性粒细胞上的人C5a受体的关键识别特征。如在我们的国际申请PCT/AU01/01427中所述，我们利用这些发现来设计能够使疏水基团装配成与C5a受体相互作用的疏水阵列的约束性结构模板(constrained structural template)。这些说明书的全部公开内容在此并入参考。
运动失调构成了一个严重的健康问题，尤其是在老年人中。这些运动失调经常是大脑损伤或神经退行性病症的结果。涉及基底神经节、导致运动失调的失调包括帕金森氏病(parkinson’s disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’s chorea)和威尔逊疾病Wilson’s disease)。而且，运动障碍经常是由大脑局部缺血和其它神经紊乱的后遗症。
神经退行性病症是慢性进行性病症，通常伴有运动和/或认知能力的明显下降。一些疾病，如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏舞蹈病、额颞性痴呆(皮克病(Pick’s disease))、Lewy体形成痴呆(dementia with Lewy bodyformation)、帕金森氏病、朊病毒相关病症如克-雅二氏病和新变异的克-雅二氏病、和肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS；亦称Lou Gehrig’s病)与蛋白在大脑内的聚集沉积有关。其它的，如多发性硬化，涉及自身免疫机制。由创伤、感染、先天性代谢缺陷、脑出血或脑血栓引起的脑损伤是严重残疾的非常常见原因，所述残疾包括麻痹和/或认知缺损。运动神经元疾病包括一组严重的神经系统失调，每种失调的特征在于运动神经元的进行性退化。运动神经元疾病可能影响上运动神经元，其介导着从大脑到髓质或到脊髓的传导，和/或下运动神经元，其介导着从脊髓到机体肌肉的传导。痉挛和过度反射表明了对上运动神经元的损害。那些丧失其神经分布的进行性萎缩和肌无力表明了对下运动神经元的损害。这组中的病症包括肌萎缩性脊髓侧索硬化；进行性延髓性麻痹；包括幼儿型和青少年型的脊髓性肌萎缩；库-韦二氏综合症；杜兴氏麻痹；韦-霍二氏病；和良性病灶肌萎缩(benign focal amyotrophy)。所有这些病症都非常痛苦，不仅治疗的选择受到限制并且非常昂贵，而且现行没有有效的治疗方法。因此急需改善这些病症的治疗方法，尤其是发展更多有成本效益的治疗方法。
一类少见的遗传失调，多聚谷氨酰胺重复疾病家族(polyglutaminerepeat disease family)，表现出称为早现遗传(anticipation)的现象，其中父母可能没有表现出症状，但是他们孩子的50％发展出所述疾病。这个家族包括亨廷顿舞蹈病及其它神经退行性疾病，包括脊髓和延髓肌萎缩、脊髓小脑性共济失调的若干形式、和齿状红核苍白球路易斯核萎缩(dentatorubral pallidoluysian atrophy)。这些病症特征在于特定基因中的三核苷酸重复，其在相应蛋白中编码多聚谷氨酰胺序列，该蛋白导致不可溶聚集物形成；但是，上述起因蛋白在其它方面是无关的，而且没有已知功能。所述蛋白聚集物诱导病理学的机制仍不清楚。
亨廷顿舞蹈病的症状包括舞蹈病(由运动协调丧失而引起的胳膊和腿的急跳运动)、语言、舌咽、专注及记忆困难以及精神病学症状如抑郁。在每下一代，发病年龄下降，疾病严重程度增加。
亨廷顿舞蹈病的特征蛋白，亨廷顿蛋白(hungtingtin)没有已知功能。编码亨廷顿蛋白的基因的第一个外显子含有一系列能够在代与代之间自然扩增的三核苷酸CAG(谷氨酰胺)重复序列。如果所述扩增超过35个重复这一临界值，就会破坏亨廷顿蛋白的正常功能。导致的神经毒性作用杀死大脑皮层和纹状体神经元，对记忆、高级认知功能、和运动协调产生灾难性的作用。可以观察到特征性纹状体损伤。
所有人都携带该基因，但是如果所述三核苷酸重复数在5和35之间，那就没有影响；但是，超过这个数值，该基因就变得不稳定，就会自然扩增。该重复数与发病年龄非常相关；在200个重复时，1或2岁的儿童就可能会有症状出现，而这些孩子会在孩童时期早期死去。与此相比，具有35到39个重复的个体并不总是发展成失调，而且其中趋向出现所述疾病的人群也在生命晚期出现。如果该缺损基因是父性遗传，则就会较早地发展成失调而且很快会变得严重。
肯尼迪病(Kennedy disease)(脊髓和延髓肌萎缩)大约影响着每50,000个人中的1个，是这种疾病家族的另一个成员，而且起因于导致雄激素受体蛋白中多聚谷氨酰胺重复或扩增的突变(La Spada，1991)。所述疾病，在人类中是X-连锁的，通常在男性40几岁时发生，而且导致运动神经元丧失、肌萎缩和睾丸病变。已经表明结合雄激素受体的睾酮可能在控制所述疾病进程中起重要作用。女性具有显著较少的循环睾酮，这可能影响了神经变性比率。
帕金森氏病的四种典型症状是颤动、僵直、行动不能和体位改变。帕金森氏病还通常伴随着抑郁、痴呆和总体认知下降。帕金森氏病发病率为总人口数的1/1,000，而年龄超过60岁时发病率增加到1/100。黑质中多巴胺能神经元的退化和随后的纹状体中多巴胺间质浓度的降低对帕金森氏病的发展很关键；在临床症状显示之前，大约80％的来自黑质的细胞要被破坏。
目前治疗帕金森氏病的策略是基于递质替代治疗(L-二羟苯乙酸(L-多巴))、抑制单胺氧化酶(如Deprenyl)、多巴胺受体激动剂(如溴麦角环肽和阿扑吗啡)及抗胆碱能药(如benztrophine和邻甲基苯海拉明)。但是，这些疗法，特别是递质替代治疗，并不能达到稳定的临床效果。长期的递质替代治疗之后会出现“开关”症状，而且这种疗法还会带来手足徐动症和舞蹈病的不随意运动、恶心和呕吐。此外，目前的疗法还不能治疗潜在的神经退行性失调，所以尽管患者接受治疗但仍表现出持续的认知下降。
尽管在该技术领域：
近来有所进展，但仍需要对运动失调、尤其是亨廷顿舞蹈病和帕金森氏病以及神经退行性病症如ALS的改良治疗方法。特别地，需要减少给药次数而降低和/或减少严重副作用、和/或控制或逆转潜在的神经退行性失调的有效疗法。
虽然，普遍认为炎症机制可能涉及许多神经退行性病症的发病机理，所述病症包括亨廷顿舞蹈病、额颞性痴呆(皮克病)、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和年龄相关神经变性(痴呆)以及由中风或创伤引起的急性脑损伤，而较少注意到这些病症中补体的可能作用。亨廷顿舞蹈病、额颞性痴呆(皮克病)和阿尔茨海默氏病中补体激活作用已有研究，而且已知所述补体成分在正常和病变大脑里都广泛表达。已经在亨廷顿舞蹈病患者的大脑中检测到所述补体途径的一些成分上调，所述成分包括补体激活剂C1r、C4和C3、补体调节剂C1抑制剂、丛生蛋白(clusterin)、MCP、DAF和CD59和所述过敏毒素C3a和C5a的受体。已表明在所述亨廷顿舞蹈病尾核的神经元中聚集的亨廷顿蛋白突变体可能与C1q结合，于是引发了经典的补体途径的激活(Singhrao et al et al，1999)。
但是，迄今没有证据表明C5a受体的抑制剂，特别是这种受体的低分子量拮抗剂可以用于治疗涉及炎症的神经性或神经退行性病症。
发明概述我们现在惊奇的发现C5a受体的低分子量拮抗剂，一种小的环肽，能够预防或减轻由新陈代谢-局部缺血诱导的神经元细胞死亡动物模型中的神经损伤。这种动物模型作为模型系统用于多种神经系统病症，尤其是与纹状体损害有关的病症。我们还在ALS动物模型中证明了存活率提高和延迟运动机能丧失。
第一方面，本发明提供了一种治疗涉及炎症的神经性或神经退行性病症的方法，包括给需要这种治疗的患者施用有效量的C5a受体抑制剂的步骤。优选的所述病症是与补体途径活性增加有关的病症。
优选的抑制剂是一种化合物，其(a)是C5a受体的拮抗剂，(b)基本上没有激动剂活性，和(c)是一种式I所示的环肽或肽模拟物化合物
其中A是H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-酰基、NH-苯甲酰基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基、或O-芳基。
B是烷基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基团、或如L-苯丙氨酸或L-苯基甘氨酸的D-或L-氨基酸的侧链，但不是下列物质的侧链甘氨酸、D-苯丙氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-色氨酸、L-同型色氨酸、L-酪氨酸、或L-同型酪氨酸。
C是一种小取代基，如D-、L-或同型氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、或硫代脯氨酸的侧链，但优选不是如异亮氨酸、苯丙氨酸或环己基丙氨酸的大取代基。
D是中性D-氨基酸的侧链，所述中性D-氨基酸如D-亮氨酸、D-同型亮氨酸、D-环己基丙氨酸、D-同型环己基丙氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-同型-正亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-四氢异喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸，但优选D不是如甘氨酸或D-丙氨酸侧链的小取代基、如D-色氨酸的大平面侧链或如D-精氨酸或D-赖氨酸的大的带电侧链。
E是大取代基，如选白L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-同型色氨酸的氨基酸的侧链，或是L-1-萘基或L-3-苯并噻吩基丙氨酸(L-3-benzothienylalanine)，但不是下列物质的侧链D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-2-萘基L-四氢异喹啉、L-环己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨酸(L-fluorenylalanine)、或L-组氨酸；F是L-精氨酸的侧链、L-同型精氨酸的侧链、L-瓜氨酸的侧链、或L-刀豆氨酸的侧链、或其生物异构体(bioisostere)的侧链，即其中保留末端胍或脲基团的侧链，但所述的碳主链被具有不同结构的基团取代，但其侧链整体上如母基团(parent group)那样与靶蛋白反应；以及X是-(CH2)nNH-、或(CH2)n-S-，其中n是从1到4的整数，优选2或3；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或-CH2-CHCOCHRNH-，其中R是任何常见或不常见氨基酸的侧链。
在C中，所述羟脯氨酸和硫代脯氨酸的顺式和反式形式都可以使用。
优选A是乙酰胺基团、氨甲基、或者取代的或未被取代的磺胺基团。
优选其中A是取代的磺胺，所述取代基是1到6、优选1到4个碳原子的烷基链，或是苯基或甲苯甲酰基团。
在一个特别优选的优选方案中，所述化合物具有针对C5aR的拮抗剂活性，并且基本上没有C5a激动剂活性。
所述化合物优选是位于人和哺乳动物细胞上的C5a受体的拮抗剂，包括但不限于人多形核白细胞、单核细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。所述化合物优选有效地和选择性地结合C5a受体，更优选在亚微摩尔浓度时具有有效的拮抗剂活性。更优选所述化合物具有IC50＜25μM的受体亲合力，和IC50＜1μM的拮抗剂效能(potency)。
最优选所述化合物是国际专利申请号为PCT/AU02/01427中描述的化合物1(PMX53；AcF[OP-DCha-WR])、化合物33(PMX273；AcF[OP-DPhe-WR])、化合物60(PMX95；AcF[OP-DCha-FR])或化合物45(PMX201；AcF[OP-DCha-WCit])，或HC-[OPdChaWR；(PMX205)或HC-[OPdPheWR](PMX218)。图1中描述了这些环肽的结构。
在一个优选的实施方案中，所述化合物能够穿过血脑屏障。在一个特别优选的实施方案中，所述化合物是PMX205或PMX53。
在本发明一个优选形式中，所述病症是与纹状体损伤和/或多聚谷氨酰胺重复有关的神经退行性病症。
在本发明这种形式中，所述病症更优选自亨廷顿舞蹈病、脊髓和延髓肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、齿状红核苍白球路易斯核萎缩、纹状体损伤、和与I型戊二醛酸尿有关的急性纹状体坏死。
在本发明另一优选形式中，所述病症是运动神经元疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化；进行性延髓麻痹；脊髓性肌萎缩，包括幼儿型和青少年型；库-韦二氏综合症；杜兴氏麻痹；韦-霍二氏病；和良性病灶肌萎缩。
在本发明第三个优选形式中，所述病症是涉及神经变性和/或缺血性损伤的失调，包括但不限于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、威尔逊疾病、和由大脑局部缺血和其他神经紊乱引起的后遗症，包括与血脑屏障功能紊乱有关的疾病。已知纹状体区域是大脑最常受中风影响的区域，3-NP模型是中风的有用模型，因为3-NP诱发大脑缺氧。特别感兴趣的帕金森型病症是帕金森氏病、药物诱发的帕金森氏综合征(Parkinsonism)、脑炎后帕金森氏综合征、中毒(例如MPTP、锰或一氧化碳)诱导的帕金森氏综合征和外伤后帕金森氏病(拳击醉酒样综合症(punch-drunk syndrome))。其它治疗可能有效的运动失调包括进行性的核上性麻痹、亨廷顿舞蹈病、多系统萎缩、皮质基底退化、威尔逊疾病、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatzdisease)(伴有大脑铁累积的神经变性)、进行性苍白球萎缩、多巴-应答性张力障碍-帕金森氏综合症(Dopa-responsive dystonia-Parkinsonism)、僵直、阿尔茨海默氏病及其他导致异常运动或体位的基底神经节失调。
所述抑制剂可以和其它治疗这些病症一或多种药物联合使用。例如，包括海藻糖、copaxone、短的单链寡核苷酸、肌酸、二甲胺四环素和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的多种药物已经表明可以用于治疗亨廷顿舞蹈病。Riluzone，一种谷氨酸途径拮抗剂，被批准用于治疗ALS，并且肌酸、重组人IGF-1和睫状神经营养因子都处在治疗这种病症的临床试验阶段。最近表明可以通过抑制异常的SOD1基因来治疗ALS的家族性形式，该疗法使用RNA干涉组合基因疗法导入正常的SOD1基因(Raoul et al.，2005；Ralphet al.，2005)。但是，这种方法很可能多年后才能到临床应用。抗雄激素药物亮丙瑞林(leuprorelin)正处于治疗脊髓和延髓肌萎缩的试验阶段(Katsunoet al，2003)。递质替代物L-二羟苯乙酸(L-多巴)、单胺氧化酶抑制剂如Deprenyl、多巴胺受体激动剂如溴麦角环肽和阿扑吗啡及抗胆碱能药如benztrophine和邻甲基苯海拉明目前已用于治疗帕金森氏病。
本发明的组合物可以配制为口服、肠胃外、吸入、鼻内、直肠或经皮使用，但优选口服或肠胃外制剂。预期本发明的化合物如果不是全部至少大多数在存在新陈代谢酶如肠道、血液、肺部或细胞内酶的情况下是稳定的。本领域技术人员可以通过已知常规方法容易地检测这种稳定性。
任选地，所述制剂可包括促进所述化合物转移穿过血脑屏障的物质或载体。一些这种物质在本领域中是已知的，例如甘露醇这样的渗透活化物质。
适合通过任何所需途径给药的制剂可以通过标准方法来制备，例如通过参考熟知的教科书如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy、Vol.II，2000(20thedition)，A.R.Gennaro(ed)，Williams & Wilkins，Pennsylvania。
同时本发明并不以任何方式局限于任何特定动物或物种的治疗，特别期待本发明的方法可以用于人类医学治疗，而且用于兽医治疗，尤其群居动物如猫和狗，牲畜如牛、马和羊，和动物园动物，包括非-人灵长类动物、大型牛科动物、猫科动物、有蹄类动物和犬科动物。
所述化合物可以任何适合的剂量和通过任何适合的途径来施用。优选口服、经皮或鼻内给药，因为这些途径更方便并且更容易接受。有效剂量取决于所要治疗病症的性质，和治疗个体的年龄、体重和潜在的健康状况。这些可以按照主治医师或兽医师的意见自行判断。适合的剂量水平可以通过本领域内熟知的方法通过试错法实验容易地确定。
图1显示了本发明优选化合物的结构。
图2显示了PMX53在3-NP大鼠模型上的效果的试点研究结果。
A体重变化；B食物消耗；C神经学/行为学得分；D假操作(A)、未治疗(B)和PMX53-治疗(C)的大鼠纹状体的典型甲苯紫(cresyl violet)染色切片，显示在该区域内的坏死程度。
图3显示了经口服填喂法施用PMX53或对照药物的实验结果。
A第7天体重变化；B第7天食物消耗；C神经学/行为学得分；D假操作(A)、未治疗(B)、PMX53治疗(C)和PMX205治疗(D)第7天的大鼠纹状体的典型甲苯紫染色切片，显示在该区域内的坏死程度。
图4显示了实施例2的深入研究所获得的结果。
A第7天体重变化；B第7天食物消耗；C神经学/行为学得分；D通过分析大鼠大脑的尼氏染色切片而测定的病变大小。
图5显示了来自实施例2中的大鼠大脑切片的组织学和组织化学检验结果。
(a)苏木精和伊红染色(b)萘基酯酶染色
(c)TUNEL染色用于检测凋亡。
图6显示了来自实施例2中的大鼠大脑切片的免疫组织化学检验结果图7显示本发明的化合物在ALS转基因大鼠模型中的治疗效果。
(a)运动机能丧失发作时间(b)百分比存活率(c)显示了每组中相对于时间运动症状出现的大鼠百分比(d)在首次体重减轻和运动症状出现之间的延迟。
图8显示了i.v.注射后本发明化合物在大脑中的水平。
发明详述本发明通过参考下列常规方法和实验性实例来描述。
关于本说明书应当清楚地理解“包含”意思是指“包括但不限于”。
本文中使用的单数形式的“一”和“该”包括复数形式，除非本说明书的上下文清楚地规定了其它意思。因此，例如，提及″一种酶″包括这种酶的复数，和提及″一种氨基酸″是指一或多种氨基酸。
当表示一个数值范围时，应清楚地理解这个范围涵盖了所述范围的上下限，和介与这些界限内的所有数值。
除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域：
的技术人员所理解的相同意思。虽然任何与本文中描述相似或等同的材料和方法可以用于实施或试验本发明，而这里描述的是优选的材料和方法。
本文中使用的简写如下C5aR C5a受体Cit 瓜氨酸dCha D-环己胺Dphe D-苯丙氨酸
IL-6 细胞介素-6ip 腹膜内i.v. 静脉内LPS 脂多糖MPO 髓过氧化物酶3-NP 3-硝基丙酸PBS 磷酸盐缓冲液PMN 多形核粒细胞PMSF 苯甲基磺酰氟po 经口sc 皮下TdT 末端脱氧核苷酸转移酶TNF-α 肿瘤坏死因子-α本说明书全部使用通用的单字母和三字母代码来表示氨基酸。
用于本说明书目的，术语″烷基″是指直链的、支链的、或环状的、取代的或未被取代的1到6个、优选1到4个碳的烷基链。最优选的烷基是甲基。术语″酰基″是指取代的或未被取代的的1到6个、优选1到4个碳原子的酰基。最优选的酰基是乙酰基。术语″芳基″是指取代的或未被取代的同型环状或杂环芳基，其中优选所述环具有5元或6元。
″常见″氨基酸是选自由甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸的L-氨基酸。
″非常见“氨基酸包括但不限于D-氨基酸、同型-氨基酸、N-烷基氨基酸、去氢氨基酸、不是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的芳香族氨基酸、邻-、间-或对-氨基苯甲酸、鸟氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、γ-谷氨酸、氨基丁酸、L-芴基丙氨酸、L-3-苯并噻吩基丙氨酸和α，α-双取代的氨基酸。
通常，本文中使用的术语″治疗″等是指作用于个体、组织或细胞以获得所需的药理学和/或生理学效果。所述效果可以是预防性的即完全或部分预防疾病或其病征或症状，和/或可以是治疗性的即部分或完全治愈疾病。
本文中使用的″治疗″涵盖脊椎动物、哺乳动物、尤其是人中疾病的任何治疗或预防，并且包括预防所述疾病在易感所述疾病的个体上发生，但还没有被诊断出具有所述疾病；抑制所述疾病，即停滞其进展；或减轻或改善所述疾病的影响，即引起所述疾病影响的消退。
本发明包括用于改善所述疾病的多种药物组合物的应用。本发明一个实施方案的所述药物组合物由具有式I的化合物、其类似物、衍生物或盐和一或多种药学上有活性的物质制备、或式I的化合物和一或多种药学上有活性的物质组合来制备成适合于施用给个体的形式，使用载体、赋形剂和添加剂或辅剂(auxiliary)进行。
经常使用的载体或辅剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇及其他糖类、滑石粉、牛乳蛋白质、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂，如无菌水、醇、甘油和多元醇。静脉内载体包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其他药学上可接受的载体包括水溶液、无毒的赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲液等等，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams&Wilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society ofGreat Britain，2002；http://bnf.rhn.net)中所述，其内容在此并入参考。根据本领域的常规技术可以调节所述药物组合物的多种成分的pH值和准确浓度。参见Goodman andGilman′s The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.，1985)。
优选以剂量单位的方式制备和施用所述药物组合物。固体剂量单位包括片剂、胶囊、和栓剂。治疗个体时，根据所述化合物的活性、给药方式、所述失调的特点和严重程度、个体的年龄和体重，可以使用不同的每日剂量。在一些情况下，还可以适当使用较高或较低的每日剂量。每日剂量的施用既可以单一剂量单位的形式或以几个较小剂量单位的形式一次施用也可以一定间隔多次施用分剂量(subdivided dose)。
可以局部或全身施用治疗有效剂量的本发明的药物组合物。用于这种使用的有效量当然取决于所述疾病的严重程度和个体的体重和综合情况。典型地，体外使用的剂量可以对用于原位施用所述药物组合物的量提供指导，并且动物模型可以用来确定所述治疗细胞毒性副作用的有效剂量。多种情况描述在如Langer，Science，2491527，(1990)中。用于口服的制剂可以是硬明胶胶囊的形式，其中所述活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合。同时也可以是软明胶胶囊的形式，其中所述活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮液通常含有活性材料，其与适于制备所述水性悬浮液的赋形剂混合。这种赋形剂可以是悬浮剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或增湿剂，其可以是(a)天然存在的磷脂如卵磷脂；(b)氧化烯与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸；(c)氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethylenoxycetanol)；(d)氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或(e)氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。
所述药物组合物可以是无菌的可注射含水或含油悬浮液的形式。这种悬浮液可以使用如上述的适合分散剂或增湿剂和悬浮剂根据已知方法配制。所述无菌可注射制品也可以是于非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如溶剂1，3-丁二醇溶液。所述可以使用的可接受载体和溶剂可以是水、Ringer′s溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的、不挥发油类通常可以作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何刺激性少的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可以用于注射剂的制备。
式I的化合物也可以以脂质体输送系统的形式施用，如小单层脂质体，大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可以由多种磷脂，如胆固醇、十八胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明式I化合物的剂量水平通常具有大约0.5mg到大约20mg每公斤体重的程度，优选的剂量范围在大约0.5mg到大约10mg每公斤体重每日(从大约0.5g到大约3g每患者每日)。同载体材料组合用于制备单个剂量的活性成分的量可以变化，依赖于治疗的宿主和特定的施用方式。例如，意欲给人口服施用的制剂可含有大约5mg到1g活性化合物和适当并方便量的载体材料，其可以在组合物总数的大约百分之5到95变化。剂量单位形式通常含有介于大约5mg到500mg的活性成分。
然而，应能够理解对于任何特定患者的特定剂量水平将依赖于多种因素，包括使用的特定化合物的活性、年龄、体重、健康情况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合和正在接受治疗的特定疾病的严重程度。
另外，本发明的一些化合物可以与水或常规有机溶剂形成溶剂化物。这种溶剂化物包含在本发明的范畴内。
本发明的化合物可以另外与其它治疗性的化合物组合以提供一种有效组合。倾向于包括任何化学上相容的药学活性物质的组合，只要所述组合并不消除本发明化合物的活性。
一般方法肽合成根据在我们较早的申请No.PCTAU98/00490和No.PCT/AU02/01427中详细描述的方法制备式I的环肽化合物，所述申请以其全部公开内容并入本文参考。尽管本发明参考相应的线性肽是Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg的化合物AcF-[OPdChaWR](PMX53)进行特异阐述，但应清楚理解本发明不限于这种化合物。
公开在国际专利申请No.PCT/AU98/00490中的化合物1-6、17、20、28、30、31、36和44和第一次公开在国际专利申请PCT/AU02/01427中的化合物10-12、14、15、25、33、35、40、45、48、52、58、60、66和68-70对位于人嗜中性粒细胞上的C5a受体具有明显的拮抗剂效力(IC50＜1μM)，最优选PMX205、PMX53和PMX273、PMX201和PMX218。
我们发现迄今为止被检测的式I的所有化合物都具有广泛相似的药理学活性，尽管由于其特定取代基不同导致了每个化合物的物理化学性质、效力和生物利用率多少有所变化。
下面所述的一般测试用于初始筛选候选的G蛋白-偶联受体的抑制剂，尤其是C5a受体的抑制剂。
药物制备和制剂如上述合成人C5a受体拮抗体AcF-[OPdChaWR](AcPhe[Orn-Pro-D-环己基丙氨酸-Trp-Arg])，用反相HPLC纯化，并通过质谱分析法和质子NMR光谱学完全定性。于蒸馏水中制备用于口服剂型的C5a拮抗剂。
受体结合分析用如前述(Sanderson et al，1995)分离的新鲜人PMN进行分析，使用的缓冲液为50mM HEPES、1mM CaCl2、5mM MgCl2、0.5％牛血清白蛋白、0.1％杆菌肽(bacitracin)和100μM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。在4℃进行分析，缓冲液、未标记的人重组C5a(Sigma)或测试肽、由Hunter/Bolton方法制备的标记125I-C5a(～20pM)(New England Nuclear，MA)和PMN(0.2×106)依次加入到具有终容积为200μL/孔的Millipore Multiscreen分析平板(HV0.45)上。在4℃温育60分钟后，过滤所述样品并用缓冲液洗涤平板一次。对滤膜进行干燥，穿孔并用LKBγ计数器计数。通过含有1mM肽或100nM C5a来评估非特异性结合，其典型导致10-15％的总结合。
用Dunnett post-test使用非线性回归和统计学分析数据。
针对拮抗剂活性的髓过氧化物酶释放分析如前述(Sanderson et al，1995)分离细胞并与细胞松弛素B温育(5μg/mL，15分钟，37℃)。将含有0.15％明胶和测试肽的Hank′s Balanced Salt溶液加入到96孔平板(总体积100μL/孔)中，随后加入25μL细胞(4×106/mL)。为了评估每种肽拮抗C5a的能力，在37℃下细胞与每种肽温育5分钟，随后加入C5a(100nM)并继续温育5分钟。然后将50μL的磷酸钠(0.1M，pH6.8)加入每孔中，将平板冷却到室温，并在每孔中加入25μL的新鲜的等体积的二甲氧基联苯胺(5.7mg/mL)和H2O2(0.5 1％)。在10分钟时加入2％的叠氮化钠终止反应。在Bioscan 450平板读数器在450nm处测量吸光度，用对照值(没有肽存在的情况下)校正，并通过非线性回归分析。
动物和细胞模型已确定3-硝基丙酸(3-NP)，一种琥珀酸脱氢酶抑制剂，在啮齿动物和灵长类动物中诱导运动、损伤和/或认知作用，这些是亨廷顿舞蹈病的特征(Brouillet et al，1999；Palfi et al，1996；Blum et al，2001)。3-NP通过产生新陈代谢诱导的缺氧选择性地在纹状体区域诱导神经元死亡。此模型用于评价治疗亨廷顿舞蹈病及其他病症的候选药物。因为3-NP诱导选择性纹状体损害，提示此系统可以用作急性纹状体坏死的模型，该症状常见于患有I型戊二酸尿症的婴儿中，I型戊二酸尿症是有机酸代谢的先天性障碍(Strauss andMorton，2003)。因为3-NP对于血脑屏障的作用，谷氨酸能兴奋毒性(glutamatergic excitotoxicity)、谷氨酸转运和多巴胺能毒性，表明这是可以用于中风、血脑屏障功能紊乱、神经退行性或神经免疫学紊乱和神经元/胶质细胞死亡研究的有用模型(Nishino et al，2000)。在此模型中纹状体损害中已经检测到C3/C4受体的表达(Shimano et al，1995)。
表达SOD1 G93A，一种超氧化物歧化酶1(SOD1)突变体的转基因大鼠是一种用于ALS的公认模型，其广泛用于测试候选治疗化合物。表达SOD1 G93A的转基因大鼠在大约115天时出现后肢无力。在这些动物上看到的病理学与在突变体SOD1小鼠模型中观察到的相似，在疾病后期具有非常明显的星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白EAAT2的丧失，证明其在ALS病原学中EAAT2功能紊乱的作用。这种转运蛋白是维持低的胞外谷氨酸水平的主要方式，而其丧失导致胞外谷氨酸增加，引起运动神经元的兴奋毒性退化。最早的EAAT2表达变化在运动神经元丧失前检测到(Howland et al，2002)。
已有两种亨廷顿舞蹈病的转基因小鼠模型，一种具有敲入的人亨廷顿蛋白基因115-三核苷酸重复序列(Mangiarini et al，1996)，另一种在其自身亨廷顿蛋白基因内具有敲入的人基因的关键的首个外显子的拷贝。
还描述了一种细胞模型，其中Neuro2a细胞表达截短的N末端亨廷顿蛋白，含有60或150与增强的绿色荧光蛋白融合的谷氨酰胺(Wang et al，1999)。
最近报道了一种用于肯尼迪病(脊髓和延髓肌萎缩)的小鼠模型表现了大部分这种人类疾病的症状，包括肌无力和不育症(McManamny et al(2002)。
还描述了一种用于脊髓小脑共济性失调-1小鼠模型(Klement，I.A.et al.Cell95，41-53(1998)。
一般实验方法除非另有说明，本研究中用于诱导所用3-NP神经毒性的方法与Blum etal(2001；2002)的相似，除了我们使用了42mg/kg/天用7天而不是56mg/kg用5天。简要地，制备于PBS(0.1 M，pH7.4)中的90mg/mL的3-NP溶液并用5M NaOH调节到pH7.4。将充满这种溶液的Alzet渗透微泵(model2ML1，输送10μL/hr，7天)植入12周龄的雄性Lewis大鼠，以便每只大鼠接受正好42mg/kg/天。
把大鼠放在单独的笼子里。用克他命(ketamine)、甲苯噻嗪和唑拉西泮(zolazapam)麻醉这些大鼠。通过肩胛间的切口把泵s.c.插入每只大鼠的背部，切口用缝合夹(wound clip)闭合。随后从麻醉中恢复，在随后7天每天检测食物摄取、体重和神经系统。还通过对所述组的性质不知情的观测者，根据一般标准在几个点进行神经学和行为学评价。
大鼠被分成下面几组测试组 在3-NP(Day-2)施用之前2天直至实验结束，在饮用水中施用测试剂及s.c.注射或通过口服填喂法治疗假操作组 假操作对照；没有3-NP未治疗组 给予3-NP但没有其它治疗比较组 在饮用水中给予infliximab(在0天以5mg/kg单次i.v.注射)或布洛芬(ibuprofen)(30mg/kg)得分如下肌张力障碍无肌张力障碍 -01条后肢的间歇性肌张力障碍 -1
2条后肢的间歇性肌张力障碍 -2持久性的后肢肌张力障碍 -3步态正常步态 -0不协调的步态和摆动 -1躺卧轻度躺卧 -1(动物侧躺着的但当受刺激时显示出不协调的运动)接近死亡的躺卧 -2笼抓用前爪能抓住笼 -0不能用前爪能抓住笼 -1升高平台检测能在平台停留10秒 -0不能在平台停留10秒 -1总得分 8完成这些研究后，用甲苯噻嗪和克他命深度麻醉大鼠。然后用大约100mL的亚硝酸钠溶液灌注大鼠除去血液，随后用大约400mL的甲醛溶液原位固定大脑。在进行组织学研究之前，小心地摘取大脑并保存在甲醛溶液中至少3天。用甲苯紫给切片染色并用光学显微镜检查。
实施例1PMX53作用的试点研究初步实验已经表明42mg/kg/天的剂量施用7天可重现的诱导该模型。为了测试PMX53对该模型系统中的作用，进行试点研究。在这个研究中，用PMX53治疗的大鼠与假操作和未经治疗的对照比较。总共使用了12只大鼠，如下假操作 2未经治疗 5PMX53 5在给予3-NP两天之前开始以2mg/kg的剂量用饮用水每日施用PMX53。在第0、3、6和8天时s.c.给与这些PMX53-治疗动物1mg/kg的剂量，因为它们没有进食，因此认为它们可能没有饮水。在随后的实验中，通过填喂法给予动物每日剂量，在第2天开始，以避免这种潜在的影响因素。在这个最初实验中，7天后除去泵并在轻度氟烷麻醉下缝合皮肤，并在随后7天里每日检查所述大鼠。
所述结果显示在图2A-2D。这表明未经治疗和PMX53治疗的大鼠都显示了体重和食物消耗的下降，随后恢复，而所述假操作大鼠在所述实验期间显示出持续生长(图2A和2B)。PMX53治疗大鼠在5-7天时明显出现较少的体重减轻(P＜0.05，n＝5；图2A)，但在5-7天时食物摄取明显增加(P＜0.05，n＝5；图2B)。未经治疗的大鼠在第4天开始输注3-NP期间神经学/行为学得分急剧增加，并在第7天时达到峰值，随后在第12天时减少到稍微提高的水平(即停止输注后5天)。相比，PMX53治疗的大鼠在得分上只略微增加，在第7天又达到峰值，随后在12天时减少到只稍微提高的水平。PMX53治疗大鼠在4-9天时的神经学/行为学得分明显降低(P＜0.05，n＝5；图2C)。假治疗的大鼠在实验期间得分上没有明显变化。
组织学上，未经治疗大鼠的大脑纹状体切片在这些初步研究显示出细胞坏死和病变，与前述发表的研究结果一致(图2D)。然而，PMX53治疗的大鼠与对照相比较在所述纹状体区域显示出较少的坏死细胞。
因为发现7天后所有的大鼠开始康复，所以在组间出现最大差异期间停止随后的实验，即第一个7天后没有必要除去所述泵。
实施例2使用其它物质比较比较PMX53与式I的另一种化合物，PMX205(氢化肉桂酸-[OpdChaWR](HC-[OPdChaWR])和已知的消炎剂布洛芬和infliximab的作用。大鼠的分组和每组数量如下假操作 4未经治疗 6PMX53 4PMX205 4布洛芬 5Infliximab 4通过填喂法每日施用PMX53(10mg/kg/天)和 PMX205(10mg/kg/天)并且用饮用水施用布洛芬(30mg/kg/天)，在给予3-NP两天之前开始。在0天时以单剂量5mg/kg静脉内输注infliximab。
所述结果显示在图3A-3D中。图2A和2B显示了7天后体重增加和食物消耗的程度与在实施例1中观察到的相似。对于神经学/行为学得分，PMX53和PMX205都具有针对3-NP的不利作用的显著保护作用，而infliximab即便有也是很小，并且布洛芬直到5天时才显示出作用(图3C)。
如图3D中所示，未经治疗大鼠大脑的纹状体区域切片的组织学检查显示出明显的细胞坏死和肉眼可见的病变，与在实施例1中观察到的程度相比更大。用PMX53治疗过的大鼠在所述纹状体区域显示出较少的坏死细胞，这与实施例1中PMX53-治疗大鼠的切片相似。
这个实验可扩展包括更多动物和本发明的其它化合物，PMX201。另外，通过检测用Nissl染料染色的大脑切片图并且使用计算机软件分析计算病变大小来计算在大脑病变大小。动物的分组如下未经治疗 26PMX53 21PMX205 19PMX201 3infliximab 10布洛芬 12所述结果概括在图4中，并且显示了所有三种测试的PMX化合物改善了3-NP的不利作用。PMX53和PMX205的作用在所有四个测试参数上都是在统计学显著的；然而，用PMX201治疗的动物数目受所述化合物有效性的限制，因此数目太少不能评估显著性。因为可以获得更多的化合物PMX201，所以将重复这部分实验。
实施例3PMX53类似物的作用如实施例2所述以相同方法测试式I的如下化合物PMX205HC-[OPdChaWR]PMX273AcF-[OPdPheWR]PMX201AcF-[OPdChaW瓜氨酸]PMX218HC-[OPdPheWR]在第2天开始，所有的药物通过填喂法以10mg/kg/天的剂量施用。如果发现这个剂量是有效的，为了确定剂量-应答关系再检测3mg/kg/天和1mg/kg/天或更少剂量。还测定了PMX53的剂量-应答关系。
还比较这些物质的作用同infliximab(以5mg/kg的单剂量在0天时静脉内注射)和通过饮用水给予的布洛芬(30mg/kg)的作用。
实施例4对实施例2的样品进行组织学和组织化学检测对实施例2中所用的大鼠脑组织石蜡切片进行苏木精和伊红染色并在显微镜下检测。明显病变周围和内部的炎性细胞的广泛侵润，如图5a所示，并且这被用萘基酯酶染色的嗜中性粒细胞特异染色所证实，如图5b所示。
TUNEL(TdT-介导的dUTP缺口末端标记)分析(Gavrieli，Y.，et al.(1992)J.Cell.Biol.119，493)测量核DNA片段化，其是凋亡的一项重要生化标志。该方法已经用于证明韦-霍二氏病，一种脊髓肌萎缩形式中运动神经元的凋亡(Simic et al，2000)。因此使用标准试剂盒对大脑切片染色以进行TUNEL分析(ApopTag Plus/TUNEL method；Chemicon)。含有感兴趣区域大脑纹状体切片被固定到载玻片上并脱蜡。然后用蛋白酶K(20μg/mL)预处理该切片，并用含有3％过氧化氢的内源过氧化物酶淬灭。然后加入平衡缓冲液，随后用TdT酶反应1小时。然后洗涤样品，并加入抗洋地黄毒苷缀合物反应30分钟。然后加入过氧化物酶底物(二氨基联苯胺)，并显色超过6分钟。然后用0.5％甲基绿复染样品并用Permount封片。在每个步骤间用PBS(0.1M，ph7.4)洗涤切片。图5c显示所述病变明显含有凋亡细胞。
在所有情况下，用C5a受体拮抗剂PMX53和PMX205的治疗完全预防了嗜中性粒细胞渗润并降低凋亡程度。
实施例5免疫组织化学分析对实施例2的大鼠大脑切片也用针对多种补体成分的特异性抗体染色。一种标准试剂盒(IHC Select；Chemicon)用于染色C3、C9和C5a受体切片。
对于C5a受体(C5aR)染色，初级单克隆抗体，小鼠抗-大鼠C5aR购自HyCult Biotechnology。该抗体已示出特异于大鼠C5a受体(Rothermel et al.，2000)。将含有感兴趣区域的大脑纹状体切片固定到载玻片并脱蜡。用柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)在80℃处理切片40分钟以暴露抗原。然后用血清阻断载玻片，随后用所述初级抗体1∶100稀释液温育2小时。然后用3％过氧化氢淬灭内源过氧化物酶，并加入二级抗体(兔抗-小鼠IgG)反应2小时。然后用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶温育切片，再用二氨基联苯胺温育6分钟，或直到显色。然后用Permount封片。在每个步骤间用PBS洗涤所有切片。
对于C3染色，兔抗-大鼠C3抗体购自Bethyl Laboratories。该多克隆抗体已经在一定程度上被定性(Julian etal.，1992)。对于C9染色，兔抗-大鼠C9抗血清得自BP.Morgan教授(University of Wales College of Medicine，Cardiff)。该抗体已被完全定性(Linington et al.，1989)。如上述使用这些抗体，除了所述抗体以1∶10浓度温育并使用山羊抗-兔IgG二级抗体。典型的结果举例说明在图6中，显示C5a受体的染色。暗-染色的细胞可能是激活的小胶质细胞，其表达C5a受体，并发现于所述病变的边缘。假治疗动物则不具备可检测的染色。
在所述病变的边缘周围还观察到补体成分C3和C9和C5a受体的强烈上调。这表明补体激活和伴随的C5a受体表达的提高是这一模型病理学的关键过程，因此解释了本发明的C5a受体拮抗剂的明显治疗作用。在不明显创伤后的这些大鼠大脑中补体的明显上调，即线粒体局部缺血，其导致细胞死亡，说明大脑中补体激活和上调可能是多种脑创伤，如中风、创伤和神经退行性病症中存在的一种共同途径。
实施例63-NP模型中的进一步研究假定补体C5a结合上调的脑细胞(神经元和神经胶质)上的C5a受体，并促进炎性细胞浸润，最后形成病变(脑细胞坏死/凋亡)。在当前进行的实验中，在整个7天当中在不同时间点检测这个模型中所用的大鼠，以便观察大脑中补体激活是否发生在可检测到明显的病变之前。
其它研究正在进行以确定C5a拮抗剂是否能够逆转病理学。我们目前自3-NP施用开始后2天起将PMX205(10mg/kg/天po)给予大鼠。
纹状体细胞培养物或来自该纹状体的大脑切片在体外在3-NP存在的情况下温育以诱导出细胞损伤。然后加入C5a拮抗剂到该培养物中以评估其预防这种损伤的能力。预期这可以用作初步筛选分析以选择用于进一步体内测试的候选物质。
实施例7C5a受体拮抗剂在ALS模型中的作用携带一个拷贝的突变体SOD-1基因(G63A)的转基因Sprague-Dawley大鼠购自the Howard Florey Institute for Physiology and Medicine，Melbourne，Australia。这些大鼠自发出现一种急性形式的运动神经元疾病(MND；肌萎缩性侧索硬化(ALS))，在大约110-140天龄的时候出现，其与在人类病症中所见非常相似。实际上，G63A突变与10-20％的ALS家族形式的人类患者中所见的是相同的突变。
这提供了一种合适的模型来研究C5a受体拮抗剂的效用。在开始研究中，使用PMX53(n＝6)、PMX205(n＝2)治疗雄性大鼠，或者用水单独处理未经治疗的疾病对照组(n＝10)。当这些大鼠70天龄时开始治疗。以大约1mg/kg/天的剂量用饮用水施用药物。包括一组3只野生型(WT)Sprague-Dawley大鼠(G63)作为假操作组动物。然后每日监测大鼠运动失调迹象，使用下列指标后肢(左肢和右肢的得分)没有异常明显肌无力(当抓住尾部时倾斜或颤抖)极端肌无力(不能背屈)肢麻痹步态无异常步态异常，蹒跚等等正位反射(当背部放置时翻正自身的时间)0秒(不能成功地背部放置)＜1秒(或大鼠不能立即翻正自身)＜5秒5-10秒＞10秒 --＞此时安乐死同时每日记录体重。当正位反应得分达到4时，或比峰值体重减少＞20％时安乐死处死大鼠。
安乐死后，每只大鼠用盐水(100mL)灌注，然后用甲醛固定组织。然后切除大脑、脊髓和双下肢后侧腓肠肌肌肉，样品用于组织学、组织化学和电子显微镜检测。
结果示于图7。如图7A所示，自101天龄时未经治疗的未治疗大鼠开始显示运动机能丧失的迹象，平均发病年龄在116±4天。用PMX53治疗的大鼠平均发病年龄是124±10天，而PMX205治疗的大鼠平均发病年龄在138±7天。因此PMX205治疗组的发病年龄明显延迟，并比PMX53治疗组发病年龄稍所延长。在大量动物上重复了该实验证实PMX205的效果。
图7B显示不同组大鼠对时间的百分比存活率。而且，两只PMX205治疗大鼠的死亡率明显延迟。与未经治疗动物相比，PMX53治疗组也许有一些小的改善。
图7C显示不同组大鼠出现运动症状对时间的百分比。作为显示在图7C中的存活率结果，两只PMX205治疗大鼠的运动发病明显延迟。与未经治疗动物相比，PMX53治疗大鼠也许有一些小的改善。
图7D显示了在C5a拮抗剂治疗的大鼠中，第一次体重减轻与第一次可见的运动机能丧失之间的间隔时间增加。这个结果尤其在PMX205治疗大鼠中更为明显。这提示药物治疗大鼠存活率的增加可能与疾病进程的延迟有关。
这些结果表明C5a受体拮抗剂在这种转基因大鼠MND模型中具有治疗效果。特别是该数据表明PMX205比PMX53具有更大的效力和/或潜力。在其它疾病模型中同样观察到这两种化合物具有相应趋势。因此制备大批量的PMX205以在该模型中作进一步研究。
实施例8对用C5a受体拮抗剂治疗的转基因大鼠的组织的研究对实施例7的脊髓和大脑样品进行组织学分析来测定在脊髓和皮层运动区里运动神经元的数目，以便确定C5a受体拮抗剂是否减少运动神经元的死亡由此而延长存活率。使用电子显微镜技术检测后肢腓肠肌肌肉终板退化迹象，以便确定C5a拮抗剂是否具有防止肌肉本身退化。如实施例5所述，用针对不同补体成分的抗体包括C5a受体的抗体对切除的脊髓和皮层运动区进行免疫化学染色，以说明补体上调是否与这种疾病的发病机理有关。
实施例9用PMX205治疗的时间效果在实施例7里我们显示了在预期的疾病症状出现之前施用C5a受体拮抗剂大约1-2月获得了有益的效果。雄性SOD-1大鼠(n＝12)组从28天龄时施用PMX205(在饮用水中，1mg/kg/天)，以检测早期治疗是否能够提高治疗应答。
症状出现后在不同阶段检测施用药物大鼠的作用，以便看看是否药物治疗可以逆转活性疾病。
还检测了雌性大鼠。
实施例10PMX化合物能穿过血脑屏障吗 为了确定PMX化合物是否能够穿过血脑屏障，麻醉雌性Wistar大鼠(250-300g)，然后通过股静脉静脉内注射3mg/kg的PMX53(AcF-[OPdChaWR])、PMX205(HC-[OPdChaWR])、PMX201(AcF-[OpdChaWCit])或PMX200(HC-[OPdChaWCit])。然后放置大鼠15分钟，此时自尾部取血进行血浆收集，然后通过心脏穿刺用150mL盐水灌注大鼠以从大脑中除去血液。然后剖出大脑。制备血浆和大脑样品用于药物动力学分析，并测定每个样品中PMX化合物的水平。结果示于图8，在大脑中测定的水平表示为血液中水平的百分比。
静脉施用后15分钟，所有用PMX化合物治疗的大鼠显示了大脑吸收的程度。施用了PMX53、PMX205或PMX201的大鼠显示出相似的吸收水平(～7％)，而PMX200显示出较低程度的吸收。
这些结果表明全身施用后，C5a受体拮抗剂能够穿过血脑屏障，而且通过瓜氨酸取代去掉该化合物末端精氨酸的正电荷，并不影响吸收。此外，通过用氢化肉桂酸或者瓜氨酸取代来提高PMX化合物的亲脂性也不改变吸收。这综合一致的、相对高水平的PMX化合物的摄取(除了PMX200的例外)可能表明了用于穿过血脑屏障的特异转运蛋白机制。
通过多种途径施用(i.v.，i.p.，s.c.，p.o等)后，通过制备详细的化合物到大脑的药物动力学吸收图谱，进一步研究了PMX化合物穿过血脑屏障的吸收。这包括在施用后的不同时间点取样。在施用该化合物后还在不同时间取脑脊液样品。大脑取样之前还检测了长期地给大鼠施用PMX化合物后所述化合物在大脑中的累积。
实施例11在其它细胞和动物模型中的测试如上所述，为了进一步研究本发明的化合物对亨廷顿舞蹈病的作用，可以使用一种Neuro2a细胞模型用于体外研究和转基因小鼠模型用于体内研究。小鼠模型已知用于肯尼迪病(脊髓和延髓肌萎缩)和脊髓小脑性共济失调-1。
使用Neuro2a细胞模型可在体外初步筛选式I的化合物。测试化合物的合适剂量可以使用常规试错实验容易地确定。
使用一或多个转基因小鼠模型还在体内测试了发现在这个模型或3-NP模型中有效的化合物。
食物摄取和体重减轻的发现表明本发明的化合物示出最小的毒性，并且PMX53正在进行类风湿性关节炎和牛皮癣的临床试验。本领域技术人员能够容易地设计适当的临床试验方案来测试式I的化合物在治疗本文所列的神经性和神经退行性病症中的效力和安全性。
虽然为了清楚和理解的目的，本发明进行了详细描述，但是对于本领域技术人员而言，很明显在不脱离本说明书揭示的发明构思的范围内可以对本文所述的实施方案和方法进行多种修饰和改变。
本文中引用的参考文献列在如下，并并入本文参考。
参考文献Blum D.，Gall D.，Cuvelier L. and Schiffmann S.Neuropharmacol andNeurotoxicol 2001，12 1769-1772.
Blum D.，Gall D.，Galas M-C.，d′Alcantara P.，Bantobungi K.，andSchiffmann S.J.Neuroscience 2002，22 9122-9133.
Fairlie D.P.，Wong A.K.，West M.W.Curr.Med.Chem.，1998，5，29-62.
Fairlie D. P.，Abbenante G. and March D.Curr.Med.Chem.，1995 2672-705.
Gavrieli Y.，Sherman Y.and Ben-Sasson S.A.Identification ofprogrammed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA.J CellBiol 1992 119 493-501Gerard C and Gerard N.P.Ann.Rev.Immunol.，199412775-808.
Howland D. S.，Liu J.，She Y.，Goad B.，Maragakis N. J.，Kim B.，Erickson J.，Kulik J.，DeVito L.，Psaltis G.，DeGennaro L. J.，Cleveland D.W.，Rothstein J.D.Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in atransgenic rat model of SOD 1 mutant-mediated amyotrophic lateralsclerosis(ALS).Proc Natl Acad Sci USA 2002 991604-1609Julian J.，Carson D.D.，Glasser S.R.Polarized rat uterine epitheliumin vitroconstitutive expression of estrogen-induced proteins.Endocrinology.1992，130(1)79-87.
Katsuno M.，Adachi H.，Doyu M.，Minamiyama M.，Sang C.，KobayashiY.，Inukai A.，Sobue G Leuprorelin rescues polyglutamine-dependentphenotypes in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophyNat.Med.2003，9 768-773.
Klement I.A.，Skinner P.J.，Kaytor M. D.，Yi H.，Hersch S.M.，Clark H.B.，Zoghbi H.Y.，and Orr H.T. Ataxin-1 NuclearLocalization andAggregationRole in Polyglutamine-Induced Disease in SCA1 Transgenic Mice.Cell(1998)9541-53.
Konteatis Z.D.，Siciliano S.J.，Van Riper G.，Molineaux C.J.，PandyaS.，Fischer P.，Rosen H.，Mumford R.A.，and Springer M.S.J. Immunol.，1994 153 4200-4204.
La Spada A.R.，Wilson E.M.，Lubahn D.B.，Harding A.E.，FischbeckKH.Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbarmuscular atrophy. Nature 352，77-79(1991).
Mangiarini L.，Sathasivam K.，Seller M.Exon 1 of the HD gene with anexpanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurologicalphenotype in transgenic mice. Cell 87， 493-506(1996).
McManamny P.，Chy H.S.，Finkelstein D.I.，Craythorn R.G.，Crack P.J.，Kola I.，Cheema S.S.，Horne M.K.，Wreford N.G.，O′Bryan M.K.，deKretser D.M.and Morrison J.R.A mouse model of spinal and bulbarmuscular atrophy.Human Molecular Genetics 11(18)2103(2002)Nishino N.，Hida H.，Kumazaki M.，Shimano Y.，Nakajima K.，ShimizuH.，Ooiwa T.and Baba H.The striatum is the most vulnerable region in thebrain to mitochondrial energy compromisea hypothesis to explain the specificvulnerability.Journal of Neurotrauma 2000，17 251-260.
Palfi S.，Ferrante R.J.，Brouillet E.，Beal M.F.，Dolan R.Guyot M.C.，Peschanski M.，and Hantraye P.Chronic3-Nitropropionic Acid Treatment inBaboons Replicates the Cognitive and Motor Deficits of Huntington′s DiseaseJ.Neuroscience 1996，16 3019-3025.
Ralph G.S.，Radcliffe P.A.，Day D.M.，Carthy J.M.，Leroux M.A.，Lee D.C.P.，Wong L.F.，Bilsland L.G.，Greensmith L.，Kingsman S.M.，Mitrophanous K.A.，Mazarakis N.D.&Azzouz M.Silencing mutant SOD1usingRNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALSmodel Nature Medicine，Advance online publication doi10.1038/nm1205，March 2005Raoul C.，Abbas-Terki T，Bensadoun J.C.，Guillot S，Haase G.，Szulc J.，Henderson C.E.，&Aebischer P. Lentiviral-mediated silencing of SOD1through RNA interference retards disease onset and progression in a mousemodel of ALS Nature Medicine，Advance online publication，doi10.1038/nm1207，March 2005Ross C.A.Polyglutamine pathogenesisemergence of unifyingmechanisms for Huntington′s disease and related disorders.Neuron 2002，35819-822.
Rothermel E.，Gotze O.，Zahn S.，Schlaf G.Analysis of the tissuedistribution of the rat C5a receptor and inhibition of C5a-mediated effectsthrough the use of two MoAbs.Scand J Immunol.2000，52(4)401-10.
Sanderson S.D.，Kirnarsky L.，Sherman S.A.，Vogen S.M.，Prakesh 0.，Ember J.A.，Finch A.M.and Taylor S.M.Decapeptide agonists of humanC5athe relationship between conformation and neutrophil response J.Med.Chem.，1995 38 3669-3675.
Shimano Y.，Kumazaki M.，Sakurai T.，Hida H.，Fujimoto I.，Fukuda A.and Nishino N. Chronically administered3-nitropropionic acid producesselective lesions in the striatum and reduces muscle tonus.Obesity Research1995，3 779S-784SSimic G.，Seso-Simic D.，Lucassen P.J.，Islam A.，Krsnik Z.，Cviko A.，Jelasic D.，Barisic N.，Winblad B.，Kostovic I.，Kruslin B.Ultrastructuralanalysis and TUNEL demonstrate motor neuron apoptosis inWerdnig-Hoffmanndisease J Neuropathol Exp Neurol 200059398-407Singhrao S.K.，Neal J.W.，Morgan B.P.and Gasque P.IncreasedComplement Biosynthesis By Microglia and Complement Activation onNeurons in Huntington′s Disease.Experimental Neurology 1999，159362-376.
Strauss K.A.and Morton D.H.Type 1 glutaric aciduria，Part 2 A modelof acute striatal necrosis.Amer.J.Medical Genetics (Semin.Med.Genet.)2003，121C 53-70Tyndall J.D.A.and Fairlie D.P. Macrocycles mimic the extendedpeptide conformation recognized by aspartic，serine，cysteine and metalloproteases Curr.Med.Chem.2001，8，893-907.
Wang G.H.，Mitsui K.，Kotliarova S.，Yamashita A.，Nagao Y.，Tokuhiro S.，Iwatsubo T.，Kanazawa I.，Nukina N.Caspase activationduringapoptotic cell death induced by expanded polyglutamine in N2a cells.Neuroreport 199910(12)，2435-2438.
Zoghbi H.Y.and Orr H.T.Glutamine repeats and neurodegenerationAnn.Rev.Neurosci.200023，217-247.
权利要求
1.一种治疗涉及炎症的神经性或神经退行性病症的方法，包括给需要上述治疗的个体施用有效量的C5a受体抑制剂的步骤。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中所述病症与补体途径活性提高相关。
3.权利要求
1或2所述的方法，其中所述抑制剂是一种化合物，其(a)是一种C5a受体的拮抗剂，(b)基本上无激动剂活性，和(c)是式I的环肽或肽模拟化合物， 其中A是H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-酰基、NH-苯甲酰基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基、或O-芳基；B是烷基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基团，或D-或L-氨基酸的侧链，但不是下列物质的侧链甘氨酸、D-苯丙氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-色氨酸、L-同型色氨酸、L-酪氨酸或L-同型酪氨酸；C是D-、L-或同型-氨基酸的侧链，但不是异亮氨酸的侧链、苯丙氨酸的侧链或环己基丙氨酸的侧链；D是中性D-氨基酸的侧链，但不是甘氨酸或D-丙氨酸的侧链、大的平面侧链或大的带电侧链；E是大的取代基，但不是下列物质的侧链D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-2-萘基-L-四氢异喹啉、L-环己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨酸、或L-组氨酸；F是L-精氨酸的侧链、L-同型精氨酸的侧链、L-瓜氨酸的侧链、L-刀豆氨酸的侧链、或其生物异构体的侧链；和X是-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n是从1到4的整数；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或-CH2-CHCOCHRNH-，其中R是任何常见或不常见氨基酸的侧链。
4.根据权利要求
3所述的方法，其中n是2或3。
5.根据权利要求
3或4所述的方法，其中A是乙酰胺基团、氨甲基基团、或取代的或未被取代的磺胺基团。
6.根据权利要求
5所述的方法，其中A是取代的磺胺，并且该取代基是1到6个碳原子的烷基链、或苯基或甲苯甲酰基团。
7.根据权利要求
6所述的方法，其中该取代基是1到4个碳原子的烷基链。
8.根据权利要求
3到7任一项所述的方法，其中B是L-苯丙氨酸或L-苯基甘氨酸的侧链。
9.根据权利要求
3到8任一项所述的方法，其中C是下列物质的侧链甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、或硫代脯氨酸。
10.根据权利要求
3到9任一项所述的方法，其中D是下列物质的侧链D-亮氨酸、D-同型亮氨酸、D-环己基丙氨酸、D-同型环己基丙氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-同型-正亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-四氢异喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸。
11.根据权利要求
3到10任一项所述的方法，其中E是选自由L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-同型色氨酸组成的组中的氨基酸的侧链，或是L-1-萘基丙氨酸或L-3-苯并噻吩基丙氨酸。
12.根据权利要求
1到11任一项所述的方法，其中所述抑制剂是具有针对C5aR的拮抗剂活性并无C5a激动剂活性的化合物。
13.根据权利要求
1到12任一项所述的方法，其中所述抑制剂在亚微摩尔浓度具有有效的拮抗剂活性。
14.根据权利要求
1到13任一项所述的方法，其中所述化合物具有IC50＜25μM的受体亲和性和IC50＜1μM的拮抗剂效力。
15.根据权利要求
1到14任一项所述的方法，其中所述化合物选自由在PCT/AU02/01427中描述的化合物1到6、10到15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33到37、39到45、47到50、52到58和60到70所组成的组中。
16.根据权利要求
14所述的方法，其中所述化合物是PMX53(AcF[OP-DCha-WR])、PMX205(HC-[OPdChaWR])、PMX273(AcF[OP-DPhe-WR])、PMX201(AcF[OP-Dcha-WCit])或PMX218(HC-[OPdPheWR])。
17.根据权利要求
16所述的方法，其中所述化合物是PMX205或PMX53。
18.根据权利要求
1到14任一项所述的方法，其中所述化合物能够穿过血脑屏障。
19.根据权利要求
1到18任一项所述的方法，其中所述病症是与纹状体损伤和/或多聚谷氨酰胺重复有关的神经退行性病症。
20.根据权利要求
19所述的方法，其中所述病症选自亨廷顿舞蹈病、脊髓和延髓肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、齿状红核苍白球路易斯核萎缩、纹状体损伤和与I型戊二酸尿相关的急性纹状体坏死。
21.根据权利要求
1到18任一项所述的方法，其中所述病症是运动神经元疾病。
22.根据权利要求
20所述的方法，其中所述病症选自肌萎缩性侧索硬化；进行性延髓麻痹；脊髓肌萎缩，包括婴儿和青少年型；库-韦二氏综合症；杜兴麻痹；韦-霍二氏病；和良性病灶肌萎缩。
23.根据权利要求
1到18任一项所述的方法，其中所述病症是一种与神经变性和/或缺血性损伤有关的疾病。
24.根据权利要求
23所述的方法，其中所述病症选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、威尔逊疾病和作为脑缺血及其他神经系统疾病的后遗症而发生的病变，包括与血脑屏障功能紊乱相关的疾病。
25.根据权利要求
1到18任一项所述的方法，其中所述病症是运动失调。
26.根据权利要求
23所述的方法，其中所述病症选自进行性核上性麻痹、亨廷顿舞蹈病、多系统萎缩症、皮质基底退化、威尔逊疾病、哈-斯二氏病(伴有大脑铁累积的神经变性)、进行性苍白球萎缩、多巴-应答性张力障碍-帕金森氏综合症、痉挛、阿尔茨海默氏病及其他引起异常运动或姿势的基底神经节疾病。
27.根据权利要求
1到26任一项所述的方法，其中所述抑制剂可以与一或多种用于治疗所述神经性或神经退行性病症的其它药物联合使用。
28.根据权利要求
27所述的方法，其中其它药物是infliximab或是C3a的抑制剂。
29.C5a受体抑制剂在制备用于治疗涉及炎症的神经性或神经退行性病症的药物中的用途。
30.根据权利要求
29所述的用途，其中所述病症与补体途径活性的提高有关。
31.根据权利要求
29或30所述的用途，其中所述化合物是如权利要求
3到18中任一项所定义的化合物。
专利摘要
本发明涉及使用具有调节C5a受体活性的能力的新的环状多肽以及肽模拟化合物治疗神经系统病症。所述化合物优选作为C5a受体的拮抗剂，并对于多形核白细胞、单核细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞上的C5a受体具有活性。本发明的优选神经系统病症是神经退行性疾病、神经免疫失调、由血脑屏障功能异常引起的疾病以及中风。
文档编号A61P25/28GK1997384SQ20058001650
公开日2007年7月11日 申请日期2005年3月21日
发明者特伦特·马丁·伍德拉夫, 斯蒂芬·马克斯韦尔·泰勒 申请人:普罗米克斯有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan