专利名称：草鱼出血病免疫用增强剂、特异性饵料、注射剂及免疫新方法
技术领域：
本发明涉及提高草鱼出血病的免疫效果，具体地说是在草鱼出血病免疫过程中，应 用免疫增强剂、特异性饵料、以及草鱼亲鱼体内注射出血病疫苗的方法。
技术背景草鱼养殖业随着集约化养殖模式的推广得到了迅猛发展。然而，由于高密度养殖、 投饲频率增加，以及水体污染等问题出现，感染各种疫病几率大大升高，已给养殖业造 成了巨大损失。尤其是流行性出血病爆发经常会给一些地区养殖业带来毁灭性的打击。 因此，加强对出血病预防技术的研究，己成为我国当前草鱼养殖业健康发展的关键技术 之一。传统的用于水生动物疾病防治方法主要有两种， 一是化学药物治疗， 一是疫苗预防。 使用抗生素虽可部分地解决一时的问题，但抗生素大量使用，会破坏养殖水环境和水生 动物体内的微生态平衡，导致某些病原体产生耐药性，进而又会对人类的健康造成潜在 威胁，不符合科学发展观的要求。目前国内对草鱼苗种的免疫方式主要有3种注射、 浸浴和口服。(1)注射因易引起鱼体受伤，费时费力和不易操作，且在鱼苗阶段更难 操作，受到较大的限制；(2)浸浴也是目前常使用的一种给予途径，但存在技术上仍 需前处理和免疫效果差等难题，在经济上也受到因成本高而制约着广泛应用于生产；(3) 口服虽然是一种方便的途径，它不会受到时间、地点和水产动物的大小制约，也可减少 劳动强度，但通常疫苗混合在一般饵料易损失，进入鱼体后疫苗的抗原性易受消化液破 坏，疫苗用量大和免疫效果差，在应用上受到了限制。传统的疫苗预防法对于生长在水 体中的水生生物来说，疫苗预防接种操作上不方便，并且效果也不理想。综合上述，这 三种方式都存在着不同的局限性，因此寻求草鱼免疫更简便和有效的新方法，成为亟待 解决的研究课题。发明内容为了克服目前草鱼在苗种阶段的免疫接种存在的缺陷和免疫效果不理想，满足实际 生产需要，本发明提供草鱼出血病免疫中使用的免疫增强剂增强免疫效果；通过雌性亲鱼腹腔注射，依靠亲鱼体内产生抗体传递给仔鱼，使其产生初级抗体；草鱼苗口服免 疫的特异性饵料加强免疫；通过这些措施综合使用提高草鱼出血病免疫效果。 实现上述的目的的技术方案如下草鱼出血病免疫用增强剂包括下列重量配比的原料壳聚糖(脱乙酰基产物)90-ioo份、e-葡聚糖8-10份、维生素C 1-3份、维 生素E 1-3份。用于草鱼出血病免疫的特异性饵料包括下列重量配比的原料上述草鱼出血病免疫用增强剂 2-2.5份轮虫 55-65份蛋黄 28-35份淀粉 8-10份水 适量；草鱼出血病疫苗的用量遵照疫苗生产厂家的要求，用适量水将上述预备饵料与草鱼 出血病疫苗充分混合成流体得特异性饵料，即作为草鱼苗的开口饵料。将草鱼出血病免疫用增强剂与草鱼出血病疫苗配合使用，草鱼出血病疫苗的用量 遵照疫苗生产厂家的要求，草鱼出血病免疫用增强剂的用量占草鱼出血病疫苗注射液体 总量1%，充分混合30分钟以上得注射剂，在草鱼亲繁殖前30 45天期间，用于雌性亲 鱼腹腔注射。本发明免疫增强剂中各成份作用如下壳聚糖(脱乙酰基产物)、e-葡聚糖能刺激草鱼的免疫系统，并增强其免疫活性，是由于动物机体内的部分免疫活性细胞表面存在免疫刺激剂(如壳聚糖、葡聚糖)的受 体，当免疫刺激剂与巨噬细胞结合后，激活免疫细胞的活性，从而导致诸如促进巨噬细 胞吞噬与杀菌活性、通过补体途径刺激体液免疫反应、调节机体免疫系统对抗原性物质 的免疫应答水平等非特异性和特异性免疫过程发生，能引起特异、非特异性免疫反应的 活动增强。维生素C、维生素E可增强鱼体免疫效果。轮虫、蛋黄和淀粉混合后对疫苗具有高吸附能力，使用这种方法投喂，疫苗在水体 中溶解损失较少和更适口，从而减少疫苗用量。同时，它们又是草鱼苗的适口饵料。本发明草鱼出血病免疫用增强剂配方是通过多次实验优化得出的结果。 本发明的有益技术效果体现在下述几个方面(1) 在草鱼流行性重大疾病的免疫防治中，使用本发明免疫增强剂通过亲鱼注射和 鱼苗口服，对草鱼免疫有显著增强效果，免疫保护力比现有免疫水平可提高15%以上。(2) 选择草鱼亲鱼在人工繁殖前30 45天，雌性亲鱼腹腔注入草鱼出血病疫苗，使亲鱼在体内产生相关抗体，抗体通过母体垂直遗传给仔鱼，使仔鱼产生初步的免疫记 忆。(3) 利用轮虫、蛋黄等高吸附能力以及对鱼苗的适口性，制成特异性饵料吸附疫苗 加强免疫效果。使用这种方法投喂，疫苗在水体中溶解损失较少和更适口，从而减少疫 苗用量。选择鱼苗开口时期进行免疫，是因为鱼苗消化系统尚未健全，各种酶对疫苗的 结构破坏程度大大减弱，所以早期投喂效果更佳。(4) 本发明免疫增强剂及饵料使用简便、经济和有效。可减少免疫接种的劳动强度， 无任何不良的反应。使用本发明免疫增强剂及饵料对草鱼苗进行免疫，免疫后的草鱼苗 对出血病疾病的保护率达85%以上，有效保护时间5个月，完全满足草鱼苗种生产要求。实验一、鱼苗不同时期投喂吸附疫苗的特异性饵料相关实验情况如下1 材料与方法1. 1疫苗与免疫途径草鱼出血病疫苗为珠江水产研究所生产草鱼冻干细胞弱毒疫苗，分6个鱼苗不同时 期，从出苗的第1 6星期，每个星期作为一个试验组，投喂特异性饵料试验组和l对照 空白组，在100cmX60cmX80cm的水族箱中进行，每箱放鱼苗30尾，试验前停食ld ， 每组试验鱼在试验中连续投喂特异性馆料早晚各l次，第7组为对照组，不投喂特异性饵 料，试验完毕后，分别放入不同网箱进行正常饲养。1. 2血清制备从每组试验鱼中各随机取4尾，用切开围心腔采血片，直接用卡介苗注射器采血， 采血后置4 。C冰箱内，放20min后取出离心，3000 r/ min， 15 min吸取上层血清。 1. 3凝集反应用草鱼出血病的组织制成悬液作抗原,实验鱼的血清作抗体。将血清稀释不同倍数， 分别加入等体积病毒液充分混匀后56'C水浴2 4h ，再放置室内过夜。1.4保护力测定分别随机取网箱饲养的实验鱼，每组10尾，并设对照组在水族箱内进行攻毒试验， 注射剂量l : 10病毒组织浆0.3mL ，连续观察15d统计其死亡率，按下列公式求保护力。 保护力=(对照组死亡数-口服疫苗组死亡数)+对照组死亡数乂100% 2 结果与分析2.1试验组与对照组的草鱼苗饲养结果比较经过近4个月饲养，试验组草鱼苗比对照组生长良好，未发现异常。2.2试验组与对照组抗体凝集价比较口服本发明饵料的草鱼苗在网箱中经过一段时间饲养后，对其进行血清抗体效价测定，测得在不同时期投喂本发明饵料的草鱼苗抗体凝集价第l组为16;第2 6组均 为8;对照组为O。试验组抗体凝集价明显高于对照组。2.3试验组与对照组死亡率比较室内测定保护力结果显示,不同时朔口服本发明饵料试验鱼死亡率各组分别为0%、 0%、 10%、 0%、 10%、 10%，对照组的死亡率为100%，获平均保护力为85%以上，证明口服 本发明饵料对于预防草鱼主要疾病很有效果，且在鱼苗早期投喂效果更佳。2.4试验组与对照组生长速度比较试验期间对照和各试验组增重量测定结果所示。试验组鱼体的增重量与对照组的增 重量并没有出现显著的差异(t测验，尸>0.05)。由此说明，免疫增强剂对草鱼苗种的生 长无显著影响。3小结与讨论鱼类的消化过程虽然与高等脊椎动物相似，但两者消化系统的结构与功能有很大的 差异。鲤科鱼类无胃，不存在胃腺，缺乏胃蛋白酶。肠的消化代替胃的消化，草鱼以草 食性为主，肠短而粗；草鱼消化道的组织学研究认为，草鱼肠管各段的粘膜层中最主要 的两种细胞是单层柱状上皮细胞和杯状细胞，消化系统结构与功能的特异性是本发明草 鱼苗种阶段使用的免疫增强剂及饵料获得显著疗效的原因。本发明草鱼苗种阶段使用的 免疫增强剂及饵料经过肠壁进入鱼体内，在体内刺激鱼体产生相应抗体，这些抗体的一 部分通过粘液分布到体表。当鱼体再次接触到这类病原时，同粘液中的抗体结合而失去 感染力，从而在消化管和体表获得局部免疫。小鱼苗消化系统尚未健全，各种酶对疫苗的结构破坏程度大大减弱，所以早期投喂效果更佳。本发明中草鱼苗种使用上述免疫增强剂及其特异饵料的大面积应用情况如下应用在出血病疫苗中加入本发明免疫增强剂增强效果、在草鱼亲鱼繁殖前30 45 天雌亲鱼腹腔注射疫苗进行预免疫、本发明鱼苗开口饵料采用轮虫等吸附疫苗制成特异 馆料投喂，加强其免疫预防效果和减少疫苗用量。从2003年至今在安徽省合肥、巢湖、 芜湖、滁州等地大面积推广，共生产免疫草鱼苗8千万尾以上，草鱼苗种养殖阶段对出 血病的保护力在85%以上，有效保护时间5个月，完全满足草鱼苗种生产要求，获得了 较好的预防效果。实验二、本发明与传统的口服疫苗方法免疫草鱼出血病效果的比较如下 采用本发明中的方法，即草鱼出血病免疫中使用的免疫增强剂、草鱼苗口服免疫的 特异性馆料、以及通过草鱼雌性亲鱼腹腔注射出血病疫苗的免疫方法，与传统单纯的口 服免疫效果相比较。血清制备、凝集反应、保护力测定的方法同实验一所述的方法。结果显示在抗体凝集价差异不显著，实验室攻毒实验和大面积推广试验，草鱼出血病保护力提高存在着显著差异，平均保护力提高15%以上。 下面结合实施例对本发明作进一步地说明。实施例1:取下列重量份的原料壳聚糖(脱乙酰基产物)90克、,-葡聚糖8克、维生素C 1克和维生素E l克， 充分混合均匀，即得草鱼出血病免疫用增强剂。 取下列重量份的原料上述草鱼出血病免疫用增强剂2份、轮虫60份、蛋黄30份和淀粉8份，将上述原 料充分混合得预备饵料；将预备饵料与草鱼出血病疫苗充分混合吸附15分钟后以上得 特异性饵料，作为草鱼苗的开口饵料；草鱼出血病疫苗为珠江水产研究所生产草鱼冻干细胞弱毒疫苗，用量按生产厂家要 求。草鱼出血病免疫用增强剂用量为疫苗注射总量的1%，充分混合30分钟后，在草鱼 亲鱼繁殖前30 45天，雌性亲鱼腹腔注射，进行预免疫。实施例2:取下列重量份的原料壳聚糖(脱乙酰基产物)95克、e-葡聚糖9克、维生素C2克和维生素E2克，充 分混合均匀即得草鱼出血病免疫用增强剂。 取下列重量份的原料上述草鱼出血病免疫用增强剂2.2份、轮虫55份、蛋黄28份和淀粉9份，将上述 原料充分混合得预备饵料；将预备饵料与草鱼出血病疫苗充分混合吸附15分钟后以上 得特异性饵料，作为草鱼苗的开口饵料；其它同实施例l。实施例3:取下列重量份的原料壳聚糖(脱乙酰基产物)100克、e-葡聚糖10克、维生素C3克和维生素E3克， 充分混合均匀即得草鱼出血病免疫用增强剂。取下列重量份的原料上述草鱼出血病免疫用增强剂2.5份、轮虫65份、蛋黄35份和淀粉10份，将上 述原料充分混合得预备饵料；将预备饵料与草鱼出血病疫苗充分混合吸附15分钟后以 上得特异性饵料，作为草鱼苗免疫的开口饵料；其它同实施例l。
权利要求
1. 草鱼出血病免疫用增强剂，其特征在于包括下列重量份的原料壳聚糖90-100份β-葡聚糖 8-10份维生素C 1-3份维生素E 1-3份。
2、 用于草鱼出血病免疫的特异性饵料 草鱼出血病免疫用增强剂 轮虫淀粉 水8-10份 1-3份1- 3份。其特征在于包括下列重量份的原料:2- 2.5份 55-65份 28-35份 8-10份 适量；将上述原料充分混合得预备饵料，将预备饵料再与草鱼出血病疫苗充分混合15分 钟以上得特异性饵料，草鱼出血病疫苗的用量遵照生产厂家的要求。
3、用于草鱼亲鱼对出血病进行预免疫的注射剂及免疫新方法，其特征在于包括下 列重量份的原料草鱼出血病免疫用增强剂 1份草鱼出血病疫苗 100份；将上述原料充分混合30分钟以上得注射剂，在草鱼亲鱼繁殖前30 45天期间，用 于雌性亲鱼腹腔注射。
全文摘要
本发明涉及草鱼出血病免疫用增强剂、特异性饵料、注射剂及免疫新方法。克服了目前草鱼在苗种阶段的主要疾病免疫接种存在的缺陷。免疫增强剂配方壳聚糖、β-葡聚糖、维生素C和维生素E；草鱼苗的开口特异饵料配方取上述免疫增强剂、轮虫、蛋黄和淀粉制得预备饵料，将预备饵料与相关多联疫苗充分混合得草鱼苗的开口饵料。在草鱼出血病疫苗中加入本发明免疫增强剂可增强其免疫效果、在草鱼亲繁殖前30～45天雌亲鱼腹腔注射上述草鱼出血病疫苗和免疫增强剂进行初级预免疫、鱼苗开口饵料采用轮虫等吸附疫苗制成本发明特异饵料投喂，加强其免疫预防效果和减少疫苗用量。本发明解决了草鱼在苗种阶段的免疫接种操作困难和效果差等难题。
文档编号A23K1/18GK101269218SQ200810025020
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者磊 佘, 卢文轩, 李艳和, 潘庭双, 王永杰, 宇 陈 申请人:安徽省农业科学院水产研究所