专利名称：一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用的制作方法
一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说涉及一种重组抗菌肽，其基因工程菌制备方法及应用。
背景技术：
目前，抗菌肽(antimicrobial/antibacterial peptides,AMP/ABP)已成为免疫学和分子生物学研究的热点。抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短肽的总称，是生物先天性免疫的重要组成部分，广泛存在于各种细菌，植物，动物以及人体中。抗菌肽具有高效，广谱抗微生物的活性特点，使其对革兰氏阳性，阴性细菌存在较强的杀伤作用，此外还具有杀真菌，原虫，抗病毒活性，杀伤肿瘤细胞等特点。近年来，由于人类对抗生素的过度滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日益严重， 不断困扰着畜牧养殖业并引发食品安全问题。抗菌肽这一非专一性免疫应答产物，对于外界各种病原体均可产生免疫应答，而不存在某一特定的抗原物质，也不易导致病原菌产生耐药性。因此抗菌肽的问世推动了新型抗菌药物的开发研制。目前已经从猪体内发现了 12种以上不同的抗菌肽，这些抗菌肽具有不同的螺旋结构，分子量相对较小(小于IOkDa)，但对多种微生物有广谱杀灭作用。根据抗菌肽前体的基因结构、氨基酸序列特征，可将猪源抗菌肽分为4类防御素(Defensins)超家族、 Cathelicidins家族、Cecropins家族和NK-lysin。Cathelicidins和防御素是到目前为止在哺乳动物中所发现的两个最大群体的抗菌肽家族。20世纪90年代，在进行bactenecin5cDNA克隆时发现Cathelicidins与抗菌肽具有共同的结构特征，即N末端都含有一个Cathelin区域，所以在1995年将其命名为 Cathelicidins0研究证明编码Cathelicidins基因有4个外显子和3个内含子。前体区含有123 144个氨基酸残基，包括一个四 30个残基的信号肽和一个长约94 144个氨基酸残基的Cathelin前段。C末端区域含有长12 97个氨基酸残基的成熟肽段。前体区具有高度的同源性，猪种内同源性达100%。Cathelin前段的C端区域有4个固定的半胱氨酸，形成2个二硫键。这些基因的5'端旁侧序列含有几个调控模体，包括参与炎症反应和急性期应答的核因子(nuclear factor，NF)，如核因子白介素-6 (NF-interleukin-6)、 核因子 KB(NF-KB)、白介素-6 应答元素(interleukin-6 response element)、急性期应答因子(acute phase-response factor, APRF)禾口 γ 干扰素应答元素(Y -interferon response elements, y IRE)的位点。Cathelicidins以前肽原的形式存在，其N端为信号肽，C端是带阳离子的成熟肽段，另有带阴离子的Cathelin前段，可能用于中和阳离子肽段，使它在胞内运输、贮存时保持无活性的前肽状态，以避免细胞毒性。在多数情况下，这些抗菌肽的Cathelin区域被蛋白水解酶水解，释放出一级结构高度不同的阳离子抗菌肽。 尽管Cathelicidins前肽原确切功能还不清楚，但研究者揣测这些分子有特异的生物学功能，而不仅仅是抗菌肽的贮存形式。目前，已经至少从8种哺乳动物包括猪、水牛、兔等体内发现了 30多种
3Cathelicidins。猪的 Cathelicidins 家族包括 PR_39、Protegrinsl 5、PMAP_23，36，37。 它们都起源于骨髓细胞，组成性的以前肽(!Propeptides)形式储存在周边PMNs (中性粒细胞)颗粒中。当PMNs激活和脱颗粒时，内源性弹性蛋白酶把成熟肽从前肽中切割出来。在一些情况下，这些肽通过C端酰胺化进一步修饰。PMAP-36 (porcine myloid antimicrobial peptide, PMAP)属于猪髓源性抗菌肽， 对其结构预测和圆二色谱分析表明PMAP-36具有两亲性α螺旋结构。体外试验表明合成的抗菌肽具有很强的抗菌活性。ΡΜΑΡ-36的杀菌活性为10 50 μ mol/1且高于100 μ mol/ 1时也未发现溶解红细胞的作用。由于从天然来源制备PMAP-36低效耗时，纯化抗菌肽产量极低，且费时费力，分离纯化困难，从而导致生产成本过高，不便于大规模生产使用。而化学合成抗菌肽成本高，且制备过程中常需要添加毒性有机物，不能满足安全、绿色饲料添加剂的生产要求。本发明采用分子生物学与基因工程的手段来克服上述难题，研制开发高效的重组抗菌肽。
发明内容本发明旨在提供一种重组抗菌肽PMAP-36的基因工程菌的制备方法，该方法获得的抗菌肽表达量高，成本低，具有高效活性，易于实现产业化。本发明所述的一种重组抗菌肽PMAP-36的基因工程菌的制备方法，其操作步骤为A :PMAP-36基因的获得参照TRIzol LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组 RNA。人工合成含有限制性内切酶酶切位点的引物，在合成的上游引物中引入^CbaI酶切位点，合成的下游引物中引入HindIII酶切位点。其合成的引物序列为Sl 5' -CCGAGATCTATGGAGACCCAGAGGGCCAGCC-3‘Fl 5' -GGGTTCGAATTACCCACAACCCAAGGGTATTG-3‘在该合成的引物的存在下，用RT-PCR方法扩增抗菌肽PMAP-36基因，步骤为1) cDNA第一链的合成①在0. 2mL微量PCR管中，加入总RNA 1-5 μ g，在管中加20 μ M Fl lyL，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μ L，轻轻混勻、离心。②65°C加热lOmin，立即将微量PCR管插入冰浴中至少lmin。③然后加入下列试剂的混合物5XcDNA synthesis buffer4μ LRNase OUT 1 μ LIOmM dNTPmix2 μ L0. IMDTT1 μ LThermoscript1 μ L轻轻混勻，离心，在60°C水浴中孵育90min。④于85°C加热15min以终止反应。⑤将管插入冰中，加入RNase H 1 μ L，37°C孵育20min，降解残留的RNA。_20°C保存备用。2) cDNA 第二链扩增①取0. 2mLPCR管，依次加入下列试剂Pre-Mix25 μ L第一链cDNA 4 μ LSl (20 μ Μ) 1 μ LFl (20 μ Μ) 1 μ LddH2019 μ L② PCR 反应在 Biometra Tgradient Thermocycler 上进行，PCR 扩增参数如下 95°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸40s，进行30个循环，最后72°C总延伸lOmin，并于16°C保温。B 基因克隆并转化大肠杆菌回收PCR产物，用T4连接酶与PMD18-T载体连接，按照下列反应体系进行连接向 PCR管中依次加入约300ng的DNA回收产物，约50ng PMD18-T载体，5 μ L连接缓冲液，补充 ddH20至10 μ L，4°C连接过夜。取5μ L连接产物加入到ΙΟΟμ L大肠杆菌(Escherichia coli)T0P10感受态细胞中，涂布于LB琼脂培养基平板，37°C培养12-16小时。挑取阳性菌落，37°C，225rpm培养12 小时，用碱裂解法提取质粒，进行双酶切和PCR鉴定。最后进行基因测序。最终获得阳性重组质粒T-PMAP36。C 转化酿酒酵母扩增并抽提重组T-PMAP36质粒，分别用限制性内切酶)(bal和HindIII双酶切重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/ci。回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PVT-PMAP36，用电转的方法转入酿酒酵母S78，获得阳性转化子S78-PMAP36。D 扩大培养，表达蛋白挑取高效阳性转化子S78-PMAP36，在YPD (1 %酵母抽提物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖)液体培养基中扩大培养，当OD6tltl = 2-6时，收集菌液，离心取上清。用CM-cellulOSe23 柱层析，收集纯化样品并冷冻干燥，SDS-PAGE鉴定表达的PMAP-36蛋白。本发明的有益效果在于1.本发明采用的表达系统安全，表达量高，稳定性好，表达的产物具备高效的抗菌活性。2.该载体系统突破了目前制约抗菌肽和生物活性多肽大规模应用的诸多障碍 (如抗菌肽对宿主菌本身的毒性、多肽表达量低及易降解等)，且操作简单。表达的抗菌肽蛋白为组成型分泌表达，细胞培养过程无需额外添加有毒诱导剂，绿色安全。3.通过本发明基因工程方法生产的重组PMAP-36，较之天然提取或化学合成的方法，显著降低生产成本，适于大规模生产。本发明制得的重组抗菌肽，可替代动物日粮中的传统抗生素，改善消化道微生物系统、提供营养因子、激活动物免疫力、提高动物的生产性能；还可用于农作物病害防治、食品保鲜、防腐以及医药产品。
图 1 :PMAP-36RT-PCR 结果图，M :DNA DL2000 Marker ；1 =RT-PCR 结果；图2 酿酒酵母重组表达质粒PVT-PMAP-36的构建图；图 3 重组菌 S78-PMAP-36PCR 鉴定，双酶切鉴定图；M DNADLIOOOOMarker ；1 =PCR 鉴定；2 =XbaI和HindIII双酶切鉴定。图4 母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-3对IgG水平的影响；图5 母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-36对初乳中总蛋白水平的影响；具体实施方式以下的实施例可使本领域的专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1 :PMAP-36基因的获得和克隆构建1. PMAP-36基因的获得参照TRIZol LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组 RNA。具体步骤为1)取母猪股骨骨髓，加少许ddH20研磨。取小量样品于EP管中，加入900yL的 TRIzol试剂，用枪将其混勻，15 30°C条件下静置5min。2)加入200 μ L的氯仿至EP管中，剧烈摇动15s，混勻，15 30°C静置2 15min。3) 4°C，12000g 离心 15min。4)取无色水相(上层溶液)至新EP管中，加入预冷的异丙醇0. 5ml，混勻，-20°C 放置IOmin以上，使核酸充分沉淀，下层有机相丢弃。5)于 4°C，12000g,离心 IOmin 沉淀 RNA。6)弃上清，在沉淀中加入lmL75%的预冷的乙醇，涡旋。7) 4"C，7500g 离心 IOmin08)弃上清，沉淀在无RNase环境中室温下自然干燥。9)用 2O 3O μ L DEPC 水(或 RNase Free ddH20)溶解 RNA，使 RNA 终浓度约为 lyg/yL，-2(rC 保存备用。2. RT-PCR1) cDNA第一链的合成①在0. 2mL微量PCR管中，加入总RNA 1-5 μ g，在管中加20 μ M Fl lyL，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μ L，轻轻混勻、离心。②65°C加热lOmin，立即将微量PCR管插入冰浴中至少lmin。③然后加入下列试剂的混合物5XcDNA synthesis buffer 4μ LRNase OUT 1 μ LIOmM dNTPmix2 μ L0. IMDTT1 μ LThermoscript 1 μ L轻轻混勻，离心，在60°C水浴中孵育90min。④于85°C加热15min以终止反应。
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⑤将管插入冰中，加入RNase H 1 μ L，37°C孵育20min，降解残留的RNA。_20°C保存备用。2) cDNA 第二链扩增①取0. 2mLPCR管，依次加入下列试剂Pre-Mix25 μ L第一链cDNA 4 μ LSl (20 μ Μ)1 μ LFl (20 μ Μ)1 μ LddH2019 μ L② PCR 反应在 Biometra Tgradient Thermocycler 上进行，PCR 扩增参数如下 95 V预变性5min，94 V变性30s，56 V退火30s，72 V延伸，延伸时间依各个片段长度而变， 约为每Ikb延伸lmin，进行30个循环，最后72°C总延伸lOmin，并于16°C保温。3.重组PMAP-36克隆构建将PCR基因产物连入T载体，反应总体系为10 μ 1 :T载体(PMD18-T Simple Vector) 0. 5 μ 1, Solution I 5 μ 1，PCR基因回收产物4. 5 μ 1。以上产物于4°C条件下连接过夜后转入大肠杆菌Ε. coli Τ0Ρ10感受态中，利用T载体自身带有的抗氨苄青霉素(Amp) 的特性进行筛选，挑取阳性单菌落克隆进行菌落PCR验证。将PCR初步验证正确的阳性克隆进行细胞培养，抽提质粒，测序验证抗菌肽基因序列的正确性。实施例2 重组工程菌的构建和表达1.酿酒酵母表达载体的构建将阳性重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/ α用)(baI和HindIII进行酶切。双酶
切反应体系如下
组分剂量(20μ1体系)
pVT102U/a或目的基因载体5.0 μ
^wI限制性内切酶Ι.ΟμΙ
HindiW核酸限制性内切酶1.0μ1
''I ·■' 1 ‘ 1 1 '- ..........-W "■ ‘J "· ““ .................... 1 ■ “ '■■■ 1 ‘ .......... 1 1 ■丨 _■ ■■ ■ “·~ ■—-
IOxM buffer2.0μ1
H2OΙΙ.ΟμΙ将双酶切后的产物进行回收，抗菌肽基因与载体按5 10 1的摩尔量混合，并加入1 μ 1的Τ4 DNA连接酶和2 μ 1的10Χ连接缓冲液，16°C水浴中连接反应过夜，构建重组质粒 pVT-PMAP-36。取80 μ 1酵母细胞感受态与5 10 μ 1重组质粒(约10 μ 1)混合均勻，转入到冰预冷的0. 2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min ； 1500V,5ms电击，然后加入Iml恢复培养液，于30°C培养箱中培养池；将培养液涂布于筛选培养基(SCR)中，30°C培养至
7单菌落出现。挑取阳性克隆进行培养，提取质粒进行双酶切及PCR鉴定，鉴定阳性转化子 S78-PMAP-36(见附图 3)。实施例31.母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-36显著提高母猪初乳IgG水平IgG，、IgA和IgM是母猪初乳中主要的免疫球蛋白成分。对母猪产后0、6、12小时的初乳进行检测，发现IgG，、IgA和IgM水平均于产后0小时为最高，随着时间的延长逐渐降低。在饮食中添加了重组抗菌肽PMAP-36蛋白之后，母猪初乳中IgG水平在0、6、12小时分别上升了 75%,28. 6%和43. 4% (图4，A)。母猪初乳中IgM的水平在0、6、12小时分别上升了 8. 82%,35. 4%和36. (图4，B)。IgA的水平则没有明显的变化(图4，C)。2.母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-36可以提高初乳中总蛋白的水平免疫球蛋白是母猪初乳中主要的蛋白成分，占初乳中蛋白总量的60%左右。在上述结果的基础上，对初乳中蛋白总量的变化进行了进一步的检测。结果显示，母猪初乳中蛋白水平在产后0小时为最高，达200mg/ml以上，随着时间的延长逐渐降低。在母猪饮食中添加了抗菌肽PMAP-36之后，母猪初乳中总蛋白水平在0小时和6小时分别上升了 21. 6% and 33. 7% (图 5)。
权利要求
1.重组抗菌肽PMAP-36的工程菌以及产物的制备方法，其特征在于其操作步骤为Α. PMAP-36基因的获得和扩增参照TRIzol LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA。在人工合成引物的存在下，通过RT-PCR获得编码PMAP-36的基因片段。B.基因克隆和转化大肠杆菌回收PCR产物，用T4连接酶与PMD18-T载体连接。转化大肠杆菌TOPlO感受态细胞，经抗性培养基筛选后，获得具有正确编码序列的PMAP-36基因。C.酿酒酵母表达载体构建和转化分别用限制性内切酶)(bal和HindIII双酶切重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/ci。回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒 PVT-PMAP36，用电转的方法转入酿酒酵母S78，获得阳性转化子S78-PMAP36。D.将工程菌扩大培养，纯化蛋白
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤A中，在合成的上游引物中引入^CbaI 酶切位点，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点。其合成的引物序列为Sl 5' -CCGAGATCTATGGAGACCCAGAGGGCCAGCC-3‘Fl 5' -GGGTTCGAATTACCCACAACCCAAGGGTATTG-3‘
3.如权利要求1所述，其特征在于步骤B中的抗性培养基含有氨苄青霉素。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于在酵母表达载体的多克隆位点间插入抗菌肽卩獻 -36基因，其表达框为々0!11-]\^0-抗菌肽？獻 -36-17，其中40!11为启动子，α是α因子信号肽序列，TT是终止子。
5.如权利要求1所述，其特征在于步骤C中电转的步骤为将80μ 1酵母细胞感受态细胞与5 10 μ 1重组质粒PVT-PMAP36混合均勻，转入到冰预冷的0. 2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min ； 1500V,5ms电击，然后加入Iml恢复培养液，于30°C培养箱中培养池； 将培养液涂布于筛选培养基(SCR)中，30°C培养至单菌落出现。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D中工程菌的纯化，具体步骤为挑取高效阳性转化子S78-PMAP36，在YPD (1 %酵母抽提物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖)液体培养基中扩大培养，当0D_ = 2-6时，收集菌液，离心取上清。用CM-cellulOSe23柱层析，收集蛋白组分，冷冻干燥，获得重组PMAP36蛋白。
7.权利要求4 6任选一项的方法在生产制备抗菌肽饲料添加剂、食品保鲜、农作物病害防治以及医药产品中的应用。
全文摘要
本发明提供一种重组抗菌肽工程菌的制备方法及其应用，属于生物基因工程技术领域，包括抗菌肽基因的扩增，基因克隆，啤酒酵母转化，重组蛋白的高效表达和纯化。本发明的重组抗菌肽为猪源抗菌肽Cathelicidins家族PAMP-36，其蛋白含有如序列工D No.2所示的短肽。本发明制得的重组抗菌肽可用于生产饲料添加剂、兽药、防腐剂，以及用于制备革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌，真菌或病毒感染引发的疾病的药物。
文档编号A01P1/00GK102220255SQ20101015199
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月14日 优先权日2010年4月14日
发明者彭永鹤, 李永新, 林美娟 申请人:深圳市圣西马生物技术有限公司