专利名称：一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株苏云金芽孢杆菌。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种从土壤或死亡昆虫体内分离出来的革兰氏阳性细菌。此类菌在芽孢形成时期产生一种或多种杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins, ICPs，又被称为δ -内毒素)，可对鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、毛翅目、脉翅目、蚤目、缨翅目、食毛目、蜚蠊目、螨类、虱目、吸虫、绦虫、鞭毛虫、变形虫和草履虫等多种昆虫及原生生物产生毒素活性， 但对人畜等非靶标生物没有效果，对环境友好安全。因此苏云金芽孢杆菌作为主要的生物农药被广泛应用。该菌菌剂作为喷洒型杀虫剂主要成分的使用时间已经超过50年，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90% -95%。苏云金芽孢杆菌的不同杀虫毒素由不同种类的cry基因控制，各种cry基因已经被成功克隆，并根据不同需要，利用转基因技术转入到不同作物中，用于害虫等有害生物的防治。自1996年转Bt cry基因作物的种植开始，转Bt基因作物在世界范围内被广泛种植， 种植面积逐年增长。据2008年的统计显示，转Bt基因作物的种植面积已增长至4，600万公顷。苏云金芽孢杆菌菌剂的应用及转Bt cry基因作物的种植，在控制田间害虫方面效果显著，有利于作物的产量和质量的提高，同时减少了化学农药的使用，对农林业生产和环境保护发挥了积极的作用。然而苏云金芽孢杆菌制剂和转Bt基因作物广泛应用，也使得部分害虫对Bt产生了一定抗性，小菜蛾是至今唯一在田间发现对Bt产生抗性的害虫。同时，在实验室内已经筛选出许多昆虫的不同抗性品系。而且其抗性水平有发展的势头。Tabashnik等于1989年检测到田间种群对Bt制剂(kurstaki亚种)产生了 25倍的抗药性，首次报道了田间小菜蛾对Bt杀虫剂产生了抗药性。Tang等测定弗罗里达州田间小菜蛾对Bt制剂(BtK NRD12)的抗药性大于1500倍。Wright等报道马来西亚田间小菜蛾种群在室内筛选饲养7代后对BtA和BtK制剂的抗药性分别为330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等国家和地区也有抗Bt小菜蛾的报道。2000年Zhao等报道从美国南卡罗尼那州田间采集的对CrylC有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在实验室先用CrylC 原毒素继续汰选，然后用表达高剂量的CrylC毒素的转基因花椰菜汰选，26代后，该品系对 CrylC毒素抗性高达63100倍(2龄幼虫)。国内，冯夏等报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗药性为17. 2-30. 2 倍。李建洪等通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现小菜蛾对苏云金芽孢杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8. 9,6. 5,2. 1倍。周程爱等报道长沙地区的小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由11_4. 1倍发展到2000年的6. 2倍的低水平抗药性。余德亿等报道福建地区田间种群的小菜蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由1997年的2. 1倍和3. 1倍上升到1999年的8. 2倍和10. 1倍。郭世俭等报道浙江省杭州、萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还没有产生抗药性。王崇利等报道广东惠州田间小菜蛾种群对CrylAb和CrylAc的抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中抗水平；对CrylAa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群对CrylAb、CrylAc具有低至中等水平抗性(8_28倍)，对Btk制剂具有低水平抗性 (3. 5-7 倍)。 以上可以看出，小菜蛾对Bt产生的抗性问题已经十分突出，因此筛选到对抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害虫已迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌。一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensiS)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号.中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No :5220，保藏日期为2011年9月6日；它为革兰氏阳性好氧杆菌，长为3. 2 μ m 4. 8 μ m，宽为1. 2 μ m 1. 8 μ m，一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，伴孢晶体为菱形，有鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成白色圆形菌落，菌落扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻。本发明中一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensiS)AH-2，其菌膜试验阳性、伏普试验阳性、卵磷脂酶阳性、不利用水杨苷、不利用蔗糖、利用纤维二糖、不利用甘露糖、不利用七叶灵、甲基红阳性、脲酶试验阳性、明胶液化阳性、不利用乳糖、不利用山梨醇、利用果糖、利用阿拉伯糖、利用麦芽糖、不利用木糖、利用葡萄糖、利用几丁质酶，生长pH值为6. 9 7. 2，生长温度为10 45°C。本发明中一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) AH-2，其携带的杀虫晶体蛋白基因有 crylAc、cry2A、cry7 和 cry9。本发明一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No :5220，保藏日期为2011年9月6曰。本发明选择了鳞翅目主要害虫(小菜蛾)、鞘翅目害虫(黄粉虫)为靶标昆虫， 同时汰选得到了对Bt (Kurstaki亚种)粉剂具有高抗的抗Bt小菜蛾种群和对CrylAc毒蛋白具有高抗的抗CrylAc毒蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，本发明中苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)AH-2同时对上述鳞翅目和鞘翅目主要害虫及抗Bt及CrylAc毒蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。本发明中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) AH_2，可以利用其生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾及鞘翅目害虫黄粉虫，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，切对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院.中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No :5220，保藏日期为20 11年9月6日； 它为革兰氏阳性好氧杆菌，长为3. 2 μ m 4. 8 μ m，宽为1. 2 μ m 1. 8 μ m，一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，伴孢晶体为菱形，有鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成白色圆形菌落，菌落扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻。本实施方式中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH_2，对其进行常规生理生化鉴定，实验结果为菌膜试验阳性、伏普试验阳性、卵磷脂酶阳性、不利用水杨苷、不利用蔗糖、利用纤维二糖、不利用甘露糖、不利用七叶灵、甲基红阳性、脲酶试验阳性、明胶液化阳性、不利用乳糖、不利用山梨醇、利用果糖、利用阿拉伯糖、利用麦芽糖、不利用木糖、 利用葡萄糖、利用几丁质酶。本实施方式中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) AH-2的生长pH值为 6. 9 7. 2，生长温度为10 45°C。对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的筛选方法按以下步骤实现一、取土样 Ig加入IOOml无菌水中，30°C振荡培养30min，在75 80°C水浴中热处理14 20min，得培养液；二、采用倍比稀释法将培养液进行梯度稀释，并涂于分离培养基上，置于28 30°C 恒温培养箱中培养3 4d，然后挑选培养特征类似苏云金杆菌的菌株涂片，用石碳酸复红染色镜检，检出产生芽孢和伴孢晶体的菌株，纯化后即获得一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌；其中步骤一中分离培养基由3g的牛肉膏、5g的蛋白胨、IOg的葡萄糖、15 20g琼脂的和IOOOml的水组成，pH值为7. 0 ；步骤一中所述土样来自安徽省池州市森林中， 去掉表层杂物取土。对筛选所得一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌进行常规生理生化及携带的杀虫晶体蛋白基因的鉴定，发现与本属其它菌种有区别，确定为芽孢杆菌属的一个新菌种,命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2。对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的发酵液的制备一、取一环纯化后的菌株接种到5ml的LB液体培养基中，置于29 31°C的复式摇床中，在200r/min下培养10 12h，获得种子液；二、向500ml锥形瓶内装入IOOml的LB液体培养基，然后接种2ml的种子液，置于29 31 °C的复式摇床中，在200r/min下培养36 45h，取样涂片至伴孢晶体50 % 脱落，即获得对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的发酵液；其中LB液体培养基由IOg 的蛋白胨、5g的酵母粉、IOg的NaCl和IOOOmL的水组成，pH值为7. 0。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) AH_2 (简称为Bt. AH_2)对黄粉虫的生物测定①供试昆虫黄粉虫在实验室内，利用木屑饲养，饲养温度是15-25°C，光周期为光照黑暗 =16h 8h ；②菌株活性测定
挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30°C恒温摇床上200rpm培养48h ；离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物；称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4°C备用；③取5ml孢晶混合液与50 μ 1 5 %的TritonlOO混合均勻(TritonlOO终浓度为0.05% )，选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含 TritonlOO终浓度为0. 05% )中，浸泡IOs晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合TritonlOO (TritonlOO终浓度为0. 05%)浸泡叶片作为对照；选取2_3龄黄粉虫幼虫，每个处理10头，设3个重复，25°C下饲养3d，将幼虫转移到装有等量木屑的培养皿中饲养4d ； 记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率；④测定结果 经过测定菌株Bt. AH-2的发酵液对鞘翅目害虫黄粉虫(Tenebrio moIitor)的致死率为75% 90%。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) AH-2 (简称为Bt. AH-2)对敏感小菜蛾的生物测定①供试昆虫小菜蛾相对敏感种群在室内用干净无虫的萝卜苗和甘蓝苗饲养，期间从未施用过任何杀虫剂。小菜蛾种群在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中(R = 10cm, L = 40cm)，饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25士 1°C，相对湿度为60% 70%，光周期为光照黑暗=16h 8h。②菌株活性测定挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30°C恒温摇床上200rpm培养48h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4°C备用。取5ml孢晶混合液与50 μ 1 5 %的TritonlOO混合均勻(TritonlOO终浓度为0.05% )，选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含 TritonlOO终浓度为0. 05% )中，浸泡IOs晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合TritonlOO (TritonlOO终浓度为0. 05% )浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫， 每个处理10头，设3个重复，25°C下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。③LC5tl 测定通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2-3龄幼虫，25°C饲养48h，记录幼虫死亡情况，利用P0L0软件计算菌株的LC5tl值。④结果经过测定，Bt.AH-2对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostalla)相对敏感种群的致死中浓度(LC5tl)为4. 94mg/L。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis) AH-2 (简称为 Bt. AH-2)对抗 Bt 小菜蛾的生物测定
①供试昆虫小菜蛾抗Bt种群采自上海田间，在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中 (R= 10cm，L = 40cm)，饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25士 1°C，相对湿度为60%-70%，光周期为光照黑暗=16h 8h。 利用Bt (Kurstaki亚种)制剂进行抗性选育。对Bt粉剂已有近千倍抗性。②菌株活性测定挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30°C恒温摇床上200rpm培养48h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4°C备用。取5ml孢晶混合液与50 μ 1 5 %的TritonlOO混合均勻(TritonlOO终浓度为0.05% )，选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含 TritonlOO终浓度为0. 05% )中，浸泡IOs晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合TritonlOO (TritonlOO终浓度为0. 05% )浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫， 每个处理10头，设3个重复，25°C下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。③LC5tl 测定通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2-3龄幼虫，25°C饲养48h，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC5Q。④结果经过测定，Bt. AH-2对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostalla)抗Bt种群的致死中浓度(LC50)为7. 44mg/L。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis) AH-2 (简称为 Bt. AH-2)对抗 CrylAc 毒蛋白小菜蛾的生物测定①供试昆虫小菜蛾抗CrylAc毒蛋白种群采自深圳田间，在养虫室内，利用甘蓝苗结合养虫纱笼法在室内饲养，将蛹放入成虫饲养笼中(R= 10cm, L = 40cm)，笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25士 TC，相对湿度为 60%-70%，光周期为光照黑暗=16h Sh0其间只施用CrylAc毒蛋白进行汰选，不施用其它任何药剂。其对CrylAc毒蛋白的LC5tl大于4000mg/L，抗性高于1500倍。②菌株活性测定挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30°C恒温摇床上200rpm培养48h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4°C备用。取5ml孢晶混合液与50 μ 1 5 %的TritonlOO混合均勻(TritonlOO终浓度为0.05% )，选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含 TritonlOO终浓度为0. 05% )中，浸泡IOs晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合TritonlOO (Tritonl OO终浓度为0. 05% )浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫， 每个处理10头，设3个重复，25°C下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。③LC5tl 测定通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2-3龄幼虫，25°C饲养48h，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC5Q。④结果经过测定，Bt. AH-2对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostalla)抗CrylAc毒蛋白种群的致死中浓度(LC5tl)为5. 90mg/L。
权利要求
1. 一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，其特征在于它为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号.中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No:5220，保藏日期为2011年9月6日。
全文摘要
一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它涉及一株苏云金芽孢杆菌。它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No5220，保藏日期为2011年9月6日。本发明中苏云金芽孢杆菌AH-2，对鳞翅目和鞘翅目主要害虫及抗Bt及Cry1Ac毒蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用，可以利用其生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾及鞘翅目害虫黄粉虫，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治。
文档编号A01P7/04GK102329752SQ20111028635
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者刘春光, 张友军, 朱勋, 李云龙, 杨峰山, 杨晶, 滕淼, 薛原, 郑晓旭 申请人:黑龙江大学