专利名称：杏鲍菇的高硒液体培养方法
技术领域：
本发明涉及高硒材料的制备方法，具体是指杏鲍菇的高硒液体培养方法。
技术背景
硒是人和动物体内必需的微量元素，是构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硒蛋白P等多达23种功能蛋白的活性中心，具有以下功效(1)清除体内过氧化物、自由基，保护细胞结构与功能不受干扰与损害，延缓衰老；(2)加速致癌物质的代谢，促进DNA损伤修复，降低癌症发病率；(3)拮抗体内有毒物质，降低其毒性，有效保护肝脏；(4)增强机体细胞免疫功能，提高机体免疫力。但是我国有约72%的人群处于缺硒状态，日摄入硒的总量约为35 μ g，显著低于世界卫生组织(WHO)推荐的硒日摄入量50-200 μ g。因此，补充硒的有效摄入成为我国低硒地区和缺硒人群的迫在眉睫的问题。
食用菌具有繁殖时间短、生物量大、蛋白含量高等特点，同时具有传统的保健功能。申请单位对多种食用菌进行耐硒研究，发现杏鲍菇具有较好的耐硒能力和较强的富硒能力，那么生产富硒或高硒的杏鲍菇作为食品添加剂的有机硒硒源，将会是低硒地区和缺硒人群的重要而有效的补硒途径。
目前的专利主要集中在对杏鲍菇的传统保健功能的研究和开发，有限的硒营养强化工作也集中在固体培养、直接食用上，如一种用于生产富硒杏鲍菇的培养基(申请号200810079694. 7)、利用亚硒酸钠进行均勻富硒栽培杏鲍菇的方法(申请号201010580186. 4)、利用混合有机硒源进行均勻富硒栽培杏鲍菇的方法(申请号 201010580160. χ)。目前，尚未开展任何将杏鲍菇进行液体富硒培养获得高硒材料、作为食品、保健品的添加剂的形式进行研究和开发。本发明因此而来。发明内容
本发明的目的是提供杏鲍菇的高硒液体培养方法，为开发高效的补硒产品和保健品提供优质的高硒材料。
本发明的技术方案如下
—种杏鲍菇的高硒液体培养方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
(1)将杏鲍菇菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始试管菌种；
(2)将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将杏鲍菇菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的杏鲍菇菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养得到耐硒培养菌种；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始试管菌种，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养得到的耐硒培养菌种，依次类推；当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
且相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值在预定阈值内时，停止耐硒培养，并确定杏鲍菇的最佳耐受硒浓度为前一批次耐硒培养基的硒浓度和高耐硒杏鲍菇菌种；
(3)将步骤O)中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中，所述含硒液体发酵培养基的硒含量为500-1000mg/L，培养条件为温度为25 33°C， 转速为100 200转/分的最优化条件下，进行杏鲍菇液体富硒深层培养。
优选的，所述方法中当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度，使耐硒培养基的硒浓度大于前一批次耐硒培养基的硒浓度，且耐硒培养基的硒浓度小于当前批次耐硒培养基的硒浓度，然后以调整硒浓度后的耐硒培养基按照步骤O)的方法继续进行耐硒培养。
优选的，所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据预定阈值或预定阈值的整数倍数进行调整，当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为当前批次耐硒培养基的硒浓度减去预定阈值或预定阈值的整数倍数后的硒浓度。
优选的，所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据相邻批次耐硒培养基的硒浓度进行调整，当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为相邻批次耐硒培养基的硒浓度的平均值。
优选的，所述方法中PDA综合培养基每IOOml定容培养基中，所用原料为马铃薯 20g，葡萄糖 2g，琼脂 1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4O. 3g，VBl 0. OOlg，pH 调至 6. 0。
优选的，所述方法中所述PDA综合培养基的配制方法包括先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积的步马聚ο
优选的，所述方法中硒源选自亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。
优选的，所述方法中梯度硒浓度的含硒培养基为硒浓度分别为10，30，50，60，80，100，120mg/L的含硒培养基；当杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
优选的，所述方法中所述含硒液体发酵培养基的配方为每IOOml定容培养基中， 所用原料为玉米粉Ig,葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7Η200· 2g，KH2PO4 0. 3g，175-263mg亚硒酸钠或190-287mg硒酸钠，pH为自然状态。
优选的，所述方法中所述含硒液体发酵培养基的硒含量为600_800mg/L，培养条件为温度为30°C，转速为150转/分的最优化条件下，进行杏鲍菇液体富硒深层培养3-4天， 即得高硒杏鲍菇材料。
所述的预定阈值为根据食用菌耐硒培养的需要和其他因素确定的硒浓度变异的值，可以是恒定的值，也可以是变动的值，如递归减小的值。
具体进行杏鲍菇的高硒液体培养时按照以下条件和步骤制备
(1)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养；
(2)将硒源与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作成10，30，50，60，80， 100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌；
(3)将步骤1培养的试管菌种接入步骤2制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中， 进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养；
(4)将步骤3培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤2制备的30mg/L的培养基中， 进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养；
(5)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种；
(6)将步骤5中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中，在含硒液体发酵培养基的硒含量为600-800mg/L，培养条件为温度为30°C，转速为150 转/分的最优化条件下，进行杏鲍菇液体富硒深层培养；
(7)在发酵的第3-4天，单位发酵液的杏鲍菇总硒含量达到最大，达到50_80mg/L， 其中硒代蛋氨酸(有机硒)占杏鲍菇总硒的50%以上；
(8)对收获的高硒杏鲍菇材料，可制备高有机硒食品或保健品添加剂。
所述PDA综合培养基配方为每IOOml定容培养基中，所用原料为马铃薯20g，葡萄糖 2g，琼脂 1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4 0. 3g，VBl 0. OOlg, pH 调至 6. 0 ；所述 PDA 综合培养基配置方法是先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积。
所述硒源是指亚硒酸钠或硒酸钠；所述含硒液体发酵培养基的配方为每IOOml 定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，131-175mg亚硒酸钠或143_191mg硒酸钠，pH自然。
液体富硒深层培养为采用深层液体培养法进行富硒培养的过程，也叫液体深层发酵法，它是目前发酵工业上常用的一种发酵方法，与液体深层发酵法的区别在于发酵培养基是否含有硒。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果
1、大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度液体培养耐硒浓度可提高到 600-800mg/L。
2、大幅提高杏鲍菇菌丝体中的有机硒含量杏鲍菇菌丝体硒含量可达 10000-14000 μ g/g (干重)，其中硒代蛋氨酸占50%以上。
3、大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的 2/3-1/2。
4、杏鲍菇的硒累积性效果好单位发酵液的杏鲍菇总硒产量达到50_80mg/L。
5、可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1 :3L液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒700mg/L 的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g， 153. 3mg亚硒酸钠，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的3L发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第3天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为5. 2g(干重)/L,菌丝体硒含量为 Hmg/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到72.8mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占杏鲍菇总硒的55%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为700mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的1/2。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达14000 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到72. 8mg/L，其中硒代蛋氨酸占55%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例2 =IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒700mg/L 的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g， 153. 3mg亚硒酸钠，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为4. 8g(干重)/L,菌丝体硒含量为 iaiig/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到57.6mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占杏鲍菇总硒的50%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为700mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达12000 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到57. 6mg/L，其中硒代蛋氨酸占50%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例3 :30L液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒700mg/L 的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g， 153. 3mg亚硒酸钠，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的30L发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为4. 5g(干重)/L,菌丝体硒含量为 llmg/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到49.5mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占杏鲍菇总硒的50%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为700mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达11000 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到49. 5mg/L，其中硒代蛋氨酸占50%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例4 =IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒600mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，亚硒酸钠131mg，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第3天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为5. 6g(干重)/L，菌丝体硒含量为 10mg/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到56mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占杏鲍菇总硒的60%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为600mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的1/2。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达10000 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到56mg/L，其中硒代蛋氨酸占60%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例5 IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒800mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，亚硒酸钠175mg，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为4. 3g(干重)/L，菌丝体硒含量为 14. 5mg/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到62. 35mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒) 占杏鲍菇总硒的50%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为800mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达14500 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到62. 35mg/L，其中硒代蛋氨酸占50%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例6 =IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将硒酸钠(NajeO4)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒600mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，硒酸钠143mg, pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第3天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为5. Og(干重)/L，菌丝体硒含量为 10mg/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到50mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占杏鲍菇总硒的52%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为600mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的1/2。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达10000 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到50mg/L，其中硒代蛋氨酸占52%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例7 IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买杏鲍菇菌种(编号5. 775)。
2)将杏鲍菇菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将硒酸钠(Na2SeO4)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，60，80，100，120mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒杏鲍菇菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行杏鲍菇菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至杏鲍菇菌种完成120mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的500mL含硒800mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，硒酸钠191mg，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获杏鲍菇菌丝体，其生物量为4. Og(干重)/L，菌丝体硒含量为 13. 2mg/g (干重)，单位发酵液的杏鲍菇硒含量达到52. 80mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒) 占杏鲍菇总硒的50%。
实施效果
大幅提高杏鲍菇的液体培养耐硒浓度杏鲍菇在硒含量为800mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短杏鲍菇液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
硒累积性效果好杏鲍菇菌丝体硒含量可达13200 μ g/g (干重)，杏鲍菇总硒产量达到52. 80mg/L，其中硒代蛋氨酸占50%。
可生产高硒材料所收获的杏鲍菇菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种杏鲍菇的高硒液体培养方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)将杏鲍菇菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始试管菌种；(2)将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将杏鲍菇菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的杏鲍菇菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养得到耐硒培养菌种；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始试管菌种，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养得到的耐硒培养菌种，依次类推；当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；且相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值在预定阈值内时，停止耐硒培养，并确定杏鲍菇的最佳耐受硒浓度为前一批次耐硒培养基的硒浓度和高耐硒杏鲍菇菌种；(3)将步骤(2)中获得的高耐硒杏鲍菇菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中， 所述含硒液体发酵培养基的硒含量为500-1000 mg/L，培养条件为温度为25 33°C，转速为100 200转/分的最优化条件下，进行杏鲍菇液体富硒深层培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度，使耐硒培养基的硒浓度大于前一批次耐硒培养基的硒浓度，且耐硒培养基的硒浓度小于当前批次耐硒培养基的硒浓度，然后以调整硒浓度后的耐硒培养基按照步骤(2)的方法继续进行耐硒培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据预定阈值或预定阈值的整数倍数进行调整，当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为当前批次耐硒培养基的硒浓度减去预定阈值或预定阈值的整数倍数后的硒浓度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据相邻批次耐硒培养基的硒浓度进行调整，当杏鲍菇菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为相邻批次耐硒培养基的硒浓度的平均值。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中PDA综合培养基每IOOml定容培养基中，所用原料为马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4 0. 3g, VBl 0. OOlg, pH 调至 6. 0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述PDA综合培养基的配制方法包括先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中硒源选自亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中梯度硒浓度的含硒培养基为硒浓度分别为10，30，50，60，80，100，120 mg/L的含硒培养基；当杏鲍菇菌种完成120 mg/L 含硒培养基的培养，制备高耐硒杏鲍菇菌种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述含硒液体发酵培养基的配方为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g， MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，175-263 mg 亚硒酸钠或 190-287 mg 硒酸钠，pH 为自然状态。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述含硒液体发酵培养基的硒含量为600-800 mg/L，培养条件为温度为30°C，转速为150转/分的最优化条件下，进行杏鲍菇液体富硒深层培养3-4天，即得高硒杏鲍菇材料。
全文摘要
本发明公开了一种杏鲍菇的高硒液体培养方法，包括以下步骤(1)将杏鲍菇菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始菌悬液；(2)将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将杏鲍菇菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的杏鲍菇菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始菌悬液，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养使用的菌悬液，依次类推；得到杏鲍菇的最佳耐受硒浓度和高耐硒杏鲍菇菌种；(3)将步骤(2)中获得的高耐硒杏鲍菇菌种发酵培养。经过杏鲍菇菌种的高硒耐受性培养后，其在液体深层培养的状态下，对培养基中的硒含量的耐受性大幅提高。
文档编号A01G1/04GK102511303SQ20111040217
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者胡海涛, 袁林喜 申请人:苏州硒谷科技有限公司