中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株的制作方法
【专利摘要】一种中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，属于生物【技术领域】。本发明菌株为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC?No.5462。本发明菌剂，其活性成分为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，CGMCC?No.5462。本发明应用的两个关键点在于：一是抗菌肽的高效表达。抗菌肽是动物的体内成分之一，是一类小分子短肽，具有安全、无残留、无毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制剂，无任何毒副作用，对多种病毒和细菌性疾病均有显著的预防效果，同时具有改善畜禽生产生长性能、减少机体发病的作用，能有效替代饲用抗生素或化学合成药物的使用，具有良好的推广应用前景。二是酵母菌体蛋白。发酵产物富含生物活性蛋白、优质的维生素及促生长因子，可显著提高机体免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，诱食效果佳，可显著提高畜禽出栏重。
【专利说明】中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鲎是一种极其珍贵的海洋无脊椎动物，也是海洋动物界现存的“活化石”，其经济价值和科研价值很高。鲎缺乏获得性免疫系统，在抵抗病原侵袭的过程中形成了多种天然防御系统，在这些防御系统中，鲎素(tachyplesin)发挥了主要的抗病原作用。鲎素是一类存在于鲎血细胞中的具有抗菌活性的阳离子多肽，它的发现被医学界称为“抗生素”研究的一个里程碑，是后抗生素时代到来的标致。自1988年日本学者Nakamura T从东方鲎中分离提取鲎素以来，鲎素的研究引起了人们的广泛关注，现己知道，鲎素是一种2.3Ku的阳离子抗菌肽，由17个氨基酸组成，形成2个二硫键，其羧基端带有I个a精氨酰胺，1988年这种肽被命名为Tachyplesin I。研究表明，鲎素具有以下抗菌特性:(I)杀菌活力高，致死浓度均在U mo I/L级；⑵作用迅速，往往在几秒或几分钟内可将99%以上的病原杀灭；(3)对真核生物细胞无毒性；(4)活性稳定，比较耐热，100°C处理30min不丧失其抗菌活性；(5)在高盐环境下同样具有抗菌活性，这是海洋抗菌肽的一个重要特征。鲎素的抗微生物作用己远远超过目前抗生素药物的作用范畴，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及囊膜病毒均能产生有效的杀伤作用，且没有耐 药性问题，因此应用前景十分诱人。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株。
[0004]本发明菌株为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC N0.5462。
[0005]本发明菌剂，其活性成分为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，CGMCCN0.5462。
[0006]本发明中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株在饲料添加剂中的应用。
[0007]本发明作为饲料添加剂的优势在于:一是高效绿色，表达的抗菌肽可具有广谱的抗细菌、抗病毒、抗霉菌等广泛的生物学效应，且不产生耐药性，无残留；二是补充蛋白，酵母菌本身是高蛋白的饲料添加剂和胃肠道正常菌群的一部分，可以同时起调节胃肠菌群和补充营养的作用。用它表达的药用蛋白不需进行大量的宿主安全性实验，外源蛋白的分泌型表达使其纯化更加简便。三是兼顾抗生素，酵母菌由于对抗生素和抗菌药具有抗性，解决了目前微生态制剂不能同时应用抗生素的弊端。而且，己报道阳离子抗菌肽与传统抗生素联合用药时会产生协同作用。因此，基因工程抗菌肽酵母制剂是一种适合在畜牧业推广应用的、有益于肉类产品质量和安全的新型饲料添加剂，具有广阔的应用开发前景。
[0008]本发明应用的两个关键点在于:一是抗菌肽的高效表达。抗菌肽是动物的体内成分之一，是一类小分子短肽，具有安全、无残留、无毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制剂，无任何毒副作用，对多种病毒和细菌性疾病均有显著的预防效果，同时具有改善畜禽生产生长性能、减少机体发病的作用，能有效替代饲用抗生素或化学合成药物的使用，具有良好的推广应用前景。二是酵母菌体蛋白。发酵产物富含生物活性蛋白、优质的维生素及促生长因子，可显著提高机体免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，诱食效果佳，可显著提高畜禽出栏重。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是温度和糖浓度对表达上清影响的二维响应面图；
图2是温度和pH值对表达上清影响的三维响应面图；
图3是糖浓度和pH值对表达上清影响的三维响应面图；
图4是自控罐发酵操作各因素曲线图；
图5是摇瓶和发酵罐发酵产物Tricine-Glycerol-SDS-PAGE结果比较；
图6是薄层扫描比较分析结果；
图7是表达上清冻干粉Tricine-SDS-PAGE鉴定；
图8是表达上清冻干粉；
图9是表达上清的质谱分析结果；
图10是鲎素高效液相色谱标准曲线；
图11是高效液相色谱分析TP I表达上清。
【具体实施方式】
[0010]本发明菌株为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC N0.5462。
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏日期:2011年11月16日 保藏编号:CGMCC N0.5462 分类命名:巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
[0011]本发明菌剂，其活性成分为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，CGMCCN0.5462。
[0012]本发明中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株在饲料添加剂中的应用。
[0013]菌株
pGAPZ a A-TP I为构建的中国當素组成型毕赤酵母阳性表达菌株；Escherichia coliATCC25922和Staphyloccocus aureus ATCC25923用于检测发酵产物抑菌活性的指示菌株。
[0014]主要试剂
Zeocin抗生素为Invitrogen公司产品；Peptone、D-葡萄糖、YNB(无游离氨基酸酵母含氮碱基)、山梨醇、生物素、组氨酸等均为上海生物工程试剂公司产品。Tris、Tricine,SDS> 过硫酸铵、P -mercaptoethanol、TEMED 均为 Sigma 公司产品；蛋白 Marker (116.0、66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4kD)为 Fermentas (MBI)公司产品；BM201 型低分子量蛋白质 Marker (66000、45000、35000、27000、20000、14400、9500、6500、4100Da)为美国 BBI 公司产品；MH培养基(Mueller hinton agar)为英国Oxoid公司产品。[0015]主要仪器
Bioflo 115?型台式生物发酵系统，总容积7.5升，含pH控制器、溶氧控制器、温度控制器、搅拌控制器、空气混合器、补料进样系统等，控制软件为Bio Command Track and Trend发酵过程专用数据采集与管理软件，美国New Brunswick Scientific公司；Minim? II型切向流过滤系统，美国PALL公司！Advantage型冻干机，美国VIRTIS公司。Allegra6R低温离心机，美国Beckman公司；SW_CJ-1F净化工作台，苏州兰林净化设备有限公司；TGL_16G振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；Min1-PROTEAN Tetra MP4型电泳槽，Powerpac Basicl64_5050型电泳仪，Bio-Rad公司；M200型多功能酶标仪，德国QIAGEN公司；DYY-1II型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳槽，北京六一仪器厂；PYX-DHS型恒温培养箱，上海市跃进医疗器械厂；MDF-290A型_80°C超低温冰柜，SANYO公司；CS_9000型薄层扫描仪，日本岛津；Counter Mat Flash型全自动菌落成像分析系统,西班牙IUL公司；LC-2010型高效液相分析仪，日本岛津SHIMADZU ；Hypersi1-ODS C18型色谱柱，美国Thermo公司；API4000型液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾源(ESI)，美国ABI公司。
[0016]试剂配制
(I)基础盐培养基(Basal salt medium, BSM) =CaSO4 ? 2H200.93g/L, K2S0418.2g/L,MgSO4 ? 7H2014.9g/L，柠檬酸三钠 1.47g/L, Glycerol40g/L, (NH4) 2S0410g/L, PTMJ mL/L,磷酸钾缓冲液(pH6.0)0.1M ;其中微量元素(PTMl)配方=CuSO4 ? 5H206g/L, K10.08g/L,MnSO4 ? H203.0g/L, (NH4)6Mo7O24 ? 4H200.2g/L, H3BO30.02g/L, CaSO4 ? 2H200.5g/L, ZnS0420g/L，&H2S045mL/L，FeS04 ? 7H2065g/L, CoCl2 ? 6H200.5g/L, Biotin0.2g/L。
[0017](2) MH 培养基(MueIIer-Hinton agar):称取本品 42.0g,加热溶解于 1000mL 蒸懼水中，121°C高压灭菌15m in。
[0018]响应面法优化X33-GAP-TP I的表达
响应面分析法(Response surface methodology, RSM)是对响应面等值线的分析来寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合影响因素与响应值之间函数关系的一种统计方法，采用响应面法对X33-GAP-TP I的培养基进行整体优化，为下一步放大生产深层发酵奠定基础。根据毕赤酵母组成型表达的限制因素，对三个发酵条件关键因素(A培养温度、B葡萄糖含量和C初始pH)进行响应面分析优化，选适当浓度作为实验中心点，得到最优发酵条件。使用Design_Expert8.0.6软件进行Central Composite Desing响应面优化。发酵培养基在基础培养基:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L的基础上进行优化。
[0019]采用中心旋转组合设计法，在最大响应区内对影响TP I活性及产量的因素进行研究和探索。重组酵母菌培养48h后测定发酵液中TP I的活性。中心旋转组合实验的因素和水平见表1。
[0020]表1中心旋转组合设计各因素水平表<img/
按上述优化后的条件，发酵5批，以Staphyloccocus aureus ATCC25923为指示菌,用平板打孔法进行抑菌活性检测，并计算平均值和误差，来考察所建立的模型是否正确。
[0021]发酵罐种子菌的培养
取己鉴定表达活性高低的X33-GAP-TP I单菌落，加入到IOmL YTO培养液(种子培养基)中，30°C，250r/min震荡培养16~24h ;取ImL培养物加入到500mLYPD培养液中，30°C，250r/min震荡培养24h左右，OD600约为10作为发酵罐种子菌。
[0022]发酵罐高密度发酵
按Bioflo 115?:发酵罐操作说明书对发酵罐的PH计、溶氧计及蠕动泵的流量进行校准。
[0023]7.5L发酵罐中加入5L基础盐培养基，罐体经121°C，30min高压灭菌。待培养基冷却到室温后，用氨水调节培养基的pH值，火焰消毒法，加入2mL PTMl微量元素、0.5mL生物素贮存液和200mL发酵罐种子菌开始发酵培养，发酵罐参数设置为:搅拌速度500r/min，罐内压力lOpsi，温度28.5°C，控制均为P-1-D，维持DO(溶解氧)值在20%以上。葡萄糖的补料流加方法为:1L的50%葡萄糖中含12mL的PTMl微量元素，以18.2mL/h/L的补料速率加入到发酵罐中。当罐内出现较多泡沫时，可滴加2~3滴市售豆油消泡。发酵过程中固定间隔由计算机自动在线记录检测D0、pH、温度和搅拌速度等数值，根据实验设计在一定的发酵时间点取样，镜检、测0D_值、细胞湿重、并对上清进行抑菌活性和蛋白电泳分析。
[0024]细胞干重测定
取ImL发酵液，40C，12000r/min,离心5min，双蒸水清洗菌体沉淀三次，105°C干燥12h，准确称重。
[0025]鲎素饲料添加剂制备一浓缩冻干法
酵母表达产物，经12000r/min离心lOmin，取上清液用真空冷冻干燥机冻干，粉碎，得冻干粉，按农业部《柞蚕素暂行质量标准》中测定抗菌肽活性的方法，测定冻干粉抑菌活性，单位为U/g，并计算发酵利率，并进行Tricine-Glycerol-SDS-PAGE检测。
[0026]重组鲎素的MALD1-T0F-MS定性检测
质谱条件:电喷雾(ESI)离子源，正离子模式，多反应监测(MRM)扫描方式；电喷雾电压(is):5500V;离子源温度(TEM):500°C ;辅助气I压力(GSl): 139kPa，辅助气2压力(GS2):206.7kPa ;气帘气压力(CUR):103.4kPa ;碰撞气(CAD):41.3kPa ;入口电压(EP)和出口电压(CXP):10V。
[0027]重组鲎素的高效液相色谱法的定量检测 1.高效液相色谱条件
色谱柱 Hypersil-ODS C18 柱(250mmX 2.1mm 1.d, 5 u m),流动相:A 为 0.1 %三氟乙酸(TFA) ；B为乙腈。柱温为35°C，检测波长为220nm。线性梯度洗脱程序:20min内流动相B由25%线性梯度增加到50% ;进样量IOii L ;体积流量为1.0mL/min。
[0028]2.标准曲线建立
梯度稀释鲎素，分别制得200、100、50、25、12.g/mL标准液，IOii L进样，用各样品的
峰面积与质量浓度计算回归所得方程。
[0029]3.高效液相色谱检测重组鲎素表达量
对不同批次的发酵液上清经0.45 U m滤器过滤后，按照1.2.4.1条件进行液相检测，用
1.2.4.2所得公式计算表达量。
[0030]响应面法优化重组鲎素酵母菌发酵工艺 中心组合设计及结果
以影响组成型表达的关键因素温度、糖浓度及PH值作为中心旋转组合实验的设计因素，以基础培养基相关参数值为实验中心点，按表2的实验设计进行20组实验，每组重复3次，以发酵液上清的抑菌圈直径为响应值，取3次重复平均数，来寻找上述三因素的最优水平，结果如表2所示。
[0031]表2中心组合设计及结果
【权利要求】
1.菌株为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC N0.5462。
2.一种菌剂，其活性成分为中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，CGMCC N0.5462。
3.中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株在饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A23K1/16GK103710276SQ201210051423
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2012年3月1日
【发明者】韩文瑜, 冯新, 雷连成, 宋战昀, 刁昱文, 赵红蕾, 高宇 申请人:吉林大学