专利名称：十四酸乙酯在作为引诱雄性草地螟的性引诱剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病虫害防治领域，尤其涉及十四酸乙酯在作为引诱雄性草地螟的性引诱剂中的应用。
背景技术：
草地螟(Loxostege sticticalis)是一种世界分布的迁飞性害虫，属鳞翅目(Lepidoptera),螟蛾科(Pyralidae),野螟亚科(Pyraustinae),锥额野螟属，别名甜菜网螟、黄绿条螟，主要分布于北纬34° 54°之间。草地螟幼虫食性较广，可为害甜菜、苜蓿、大豆、马铃薯、亚麻、向日葵等多达80种以上的作物及牧草；并且幼虫具有暴食性，初龄幼虫取食叶肉组织，残留表皮或叶脉，3龄后可食尽叶片，吃光一片作物以后再向其它地块群集转移危害，可在短时间内对农作物造成毁灭性危害，前苏联、加拿大、美国、蒙古等数十个国家和地区都对其有严重危害的报道。草地螟在我国主要分布在华北、东北和西北地区，是北方农牧业生产的重大害虫，建国后已有三次爆发成灾，其中2008年草地螟I代成虫从俄罗斯及蒙古大量迁入我国，导致2代幼虫成为新中国成立以来发生面积最大、危害程度最重的一个世代。我国科研工作者针对草地螟作了大量的研究工作，在草地螟的生长发育、迁飞规律、繁殖生物学等方面掌握了大量的数据资料，为草地螟的防治提供了依据。但由于草地螟具有迁飞性、间歇性爆发成灾的特点，给测报和防治带来极大难度。寻找准确、实效、便捷的虫情监测和治理方法，成为防控我国草地螟爆发成灾亟待解决的科学问题。早在上世纪70年代，加拿大的Struble和Lilly就开始探索草地螟的性信息素，他们最终确定Ell-14:Ac (反11-十四碳烯醋酸酯)为草地螟的引诱剂，添加与其相近的化合物El 1-14: OH (15%)、12: OH (6%)或者12: Ac (6%)能增加El 1-14: Ac的引诱效果，但这些化合物的增效作用在1974至1975年的田间诱集试验中并没有得到很好的重复；同时，Ell-14: Ac、Ell-14:Ac与异构体(5-10%)的混合物能诱到另外两种雄蛾Hysterosia cartwrightana 和 Lymnaecia phragmitella。其他研究者的结果证实，除草地螟外，Ell-14:Ac对许多蛾类具有诱引作用，包括二化螟蛾(Archips podana)、玉米螟蛾(Ostrinia nubilalis)、云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana)以及其它多种有害蛾类。近年来，草地螟在我国北方连续爆发成灾，国内研究者尝试应用人工合成Ell-14:Ac引诱雄蛾，但诱集效果均不理想，其原因可能是同一物种不同地理种群的雌蛾性信息素存在差异，这种差异可导致该信息素在我国的应用失败。因此，利用性信息素对我国北方草地螟进行预测预报，防止草地螟爆发成灾，急需科研人员对我国草地螟的性信息素进行鉴定。
发明内容
本发明的一个目的是提供十四酸乙酯在作为引诱草地螟(Loxostegesticticalis)的性引诱剂中的应用。所述草地螟(Loxostege sticticalis)为雄性草地螟。本发明的另一个目的是提供一种引诱草地螟(Loxostege sticticalis)的性引诱剂。本发明所提供的引诱草地螟(Loxostege sticticalis)的性引诱剂,其活性成分为十四酸乙酯。所述草地螟(Loxostege sticticalis)为雄性草地螟。十四酸乙酯在防治草地螟(Loxostege sticticalis)中的应用也属于本发明的保护范围。结合使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、气相色谱-触角电位测量系统(GC-EAD)以及系列行为试验，对我国草地螟种群的性信息素进行化学鉴定，并对雄蛾进行野外诱引试验。研究结果证实，十四酸乙酯(Ethyl myristate)为草地螟雌蛾释放的性引诱剂，雌蛾羽化后第3日(即3日龄)暗期便可进入求偶(Calling)状态，性腺从腹部末端伸出，释放性信息素，吸引·雄蛾前来交配。该研究成果将为应用性信息素对我国草地螟进行虫情监测和防控提供理论依据，以期有效防止草地螟对北方农牧业造成灾害。
图1为用于行为试验的双向选择盒装系统。系统由三个透明的食品塑料盒组成，释放盒的两端及备选盒的一侧各打一直径约4cm圆孔，释放盒底部朝上置于中间、备选盒顶部朝上置于两侧，使圆孔两两相接紧凑形成一个封闭的系统。被测化合物和空白诱芯分别放入左右两侧备选盒中，气味物质在这一封闭系统中扩散时形成浓度梯度；被试雄蛾引入中间的释放盒内，可自由选择进入左右两个方向的备选盒。图2为草地螟雌、雄蛾腹部末端粗提液的总离子流图。非极性色谱柱HP5-MS(0.25mmx30mx0.25 μ m)分离提取，其中在色谱柱中保留时间为26.87分钟的色谱峰为雌蛾粗提液中特有的化合物。图3为草地螟雌蛾特有化合物色谱峰的质谱特征图(a)与标准化学品十四酸乙酯的质谱特征图(b)通过谱库检索(NIST，2002)初步确定雌蛾特有色谱峰对应的化合物结构，经非极性柱(HP5-MS)和极性柱(DB-Wax)分离检测人工合成标准化学品十四酸乙酯，对比人工标准品与雌蛾提取液中特有化合物的保留时间和离子谱，最终确定该雌蛾特有的化合物为十四酸乙酯。图4为草地螟雄蛾对标准化学品十四酸乙酯的触角电位反应。草地螟雄蛾触角对合成化合物十四酸乙酯有显著和可重复的电位反应，FID (Flame ionization detector)的纵轴放大倍数为10mV/div, EAD (Eectroantennographic detector)的纵轴放大倍数为ImV/div0图5为草地螟雄蛾对十四酸乙酯的双向选择试验结果。双向选择盒装系统的其中一个备选盒放入滴有十四酸乙酯溶液(50ng/ μ LX 10 μ L)的橡胶诱芯，另一个备选盒(对照盒)放入滴有等量二氯甲烷的诱芯。被试雄蛾引入释放盒后会在两个备选盒中作出选择，少数雄蛾在试验时间内未出现选择行为。样本量为40头雄蛾，对照与处理之间差异显著(卡方检验，P=0.012)。图6为2011年6月河北省康保县北关村柠条地诱引试验。单个诱捕器最多诱到草地螟雄蛾17头，橡胶诱芯内性诱剂为十四酸乙酯IyL (50ng/yLX20yL)。图7为野外生测诱蛾数量对比。2011年与2012年各进行一次野外诱引，2011年使用的诱捕器为深绿色船形，2012年使用的为白色三角形诱捕器。处理组诱捕器内置性诱剂诱芯(剂量为50ng/ μ LX 20 μ L)，对照组诱芯仅有20 μ L 二氯甲烷，每组6个诱捕器。两次诱引处理组与对照组的诱蛾量差异均达到显著(单因素方差分析，P值分别为0.010和
0.047)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。实施例1、十四酸乙酯在作为引诱雄性草地螟的性引诱剂中的应用一、供试虫源2010年冬季从河北省康保县北关村采集草地螟蛹，带回实验室置于人工气候箱(RXZ-268B，宁波江南仪器厂)，设定温度为22±1°C，湿度70±5%，光周期16L:8D。待其羽化后交配产卵进行人工饲养。幼虫用玻璃瓶(直径8cm，高IOm)以30头/瓶的密度分装，尼龙纱布封口，饲以灰藜(Chenopodium album);雌、雄成虫用透明塑料罩(直径8cm,高20m)分开饲养,尼龙纱布封口，饲以10%葡萄糖水。二、样品制备草地螟雌雄成虫的交配行为发生于暗期后4 8h之间，其交配高峰期在暗期最后2h。雌蛾的性腺位于腹部末端的8-9节间膜的腹面，未求偶时第9腹节套缩在第8腹节之内，雌蛾在进入暗期一段时间后，腹部开始向上翘起，产卵器外伸，性腺外露以释放性信息素，保持姿势以等待雄蛾前来交配。我们将雌、雄蛾进行一一配对，在暗期观察求偶和交配行为。当雌、雄蛾进入预交尾阶段时，即用手术剪将雌(N=77)、雄(N=99)蛾的腹部末端剪下放入样品瓶，加入400 μ L 二氯甲烷(纯度>99.5%，北京北化精细化学品有限责任公司)浸没，密封提取2h后将浸提液保存 于-20° C冰箱备用。三、化学分析(GC-MS)利用气相色谱-质谱联用仪(Gaschromatography-mass spectrometry, GC-MS,Agilent 6890N GC-5973MS，)分别对草地螟雌、雄蛾浸提液进行分离和检测，通过质谱库(NIST Mass Spectral Library, 2002 version,安捷伦科技有限公司，美国)对分离出的化合物进行定性分析。GC-MS测试条件:色谱柱为HP5-MS(长30m，内径0.25mm,膜厚0.25 μ m，Agilent 19091S-433);载气为高纯He (99.999 % )，载气流速为1.0ml/min ;进样口温度220°C，进样量2μ 1，无分流进样模式；程序升温50°C开始，以5°C /min升至260°C，保留8min ；电离方式EI，电离能量70eV，四极杆温度150°C，离子源温度230°C，扫描质量范围30-450amu。人工合成标准化学品十四酸乙酯(Ethyl myristate,纯度彡98%,北京百灵威科技有限公司)。标准品分别经非极性柱(HP5-MS)和极性柱(DB-Wax，长30m，内径0.25mm,膜厚0.25 μ m)分离检测，以确定提取液中相应化合物的化学结构。性诱剂候选组分的化学结构鉴定(GC-MS)结果:通过GC-MS的分离和分析，我们在草地螟雌、雄蛾腹部末端的粗提液中共检测到20多种化合物(图2)，大部分是直链的脂肪族化合物，包括醛、酮、酸、烯和烷。其中在色谱柱中保留时间为26.87分钟的色谱峰为雌蛾粗提液中特有的峰，而雄蛾的粗提液中无此对应峰。因此，我们认为该化合物可能为雌蛾性腺释放的性引诱物质。根据该化合物在色谱柱的保留时间以及离子谱特征，在GC-MS谱库中进行检索，初步确定此色谱峰相应化合物为十四酸乙酯。人工合成标准化学品十四酸乙酯经非极性柱(HP5-MS )和极性柱(DB-Wax )进行分离检测，对比人工标准品和雌蛾提取液中特有化合物的保留时间和离子谱，最终确定雌蛾特有的化合物为十四酸乙酯(图3)。四、电生理活性测试(GC-EAD)使用气相色谱-触角电位测量系统(gas chromatographic-electroantennographic detection, GC-EAD)测定草地螟雄蛾触角对雌蛾性腺粗提液及人工标准化合物十四酸乙酯的电生理反应。GC型号为6890 (美国安捷伦科技有限公司)，色谱柱为HP5-MS(30!1^0.2511111^0.25 4111，美国安捷伦科技有限公司)。气相色谱程序设置同以上化学分析过程。雄蛾触角被剪下并切除末端，用导电胶粘至两个电极(PRG-2探针，荷兰Syntech公司)。雌蛾粗提液、浓度为50ng/μ L的十四酸乙酯进样量均为2 μ L。吹向触角的气流速度为250mL/min，调节刺激时间为0.2S。触角电位仪(EAG)由荷兰公司的智能化数据获取控制器IDAC-4、刺激气流控制器(CS-55)、微动操作仪(MN-151)及Syntech EAG软件处理系统四部分组成，跗节上感受器的电位反应经放大后在计算机上显示。雌蛾粗提液和十四酸乙酯的GC-EAD试验分别测试6个来自不同雄蛾的触角样品。性诱剂候选组分的电生理活性测定(GC-EAD)结果:草地螟雄蛾触角对人工合成的标准化学品十四酸乙酸有显著可重复的电位反应峰(图4)，说明该化合物与天然存在于雌蛾性腺摄取液中的化合物具有同样的电生理活性，能够激发雄蛾的电生理反应。五、室内行为活性测定人工合成的性引诱剂十四酸乙酯的行为测定装置为自制的双向选择盒装系统(图1)，该系统由三个透明的食品塑料盒组成(盒顶部:16.5Xllcm,盒底部:14.5X9cm,盒高:
5.5cm)，盒内壁用解剖针划 出一些痕迹便于草地螟蛾在盒内攀爬。释放盒的两端及备选盒的一侧各打一直径约4cm圆孔，释放盒底部朝上置于中间、备选盒顶部朝上置于两侧，使圆孔两两相接紧凑形成一个封闭的系统。加入十四酸乙酯的诱芯(50ng/y LXlOyL)与空白诱芯分别放入左右两侧备选盒中，气味物质在这一封闭系统中扩散时形成浓度梯度；草地螟雄蛾被引入中间的释放盒内，可自由选择进入左右两个方向的备选盒。每次试验之前以无水乙醇(95%)擦拭塑料盒内壁并自然风干，被测雄蛾共40头，均只使用I次。数据分析:双向选择试验数据采用卡方检验(ch1-square goodness-of-fittest)对试验观测值与预期值之间的差异性进行分析。所有数据均通过SPSS17.0进行统计分析。草地螟雄蛾对十四酸乙酯的趋向行为测定结果:草地螟雄蛾对十四酸乙酯的室内双向选择试验结果显示，雄蛾对十四酸乙酯表现出明显的选择偏好性(图5)，选择处理盒(即含性诱剂十四酸乙酯的备选盒)的雄蛾多于选择空白对照盒的雄蛾，差异达到显著水平(卡方检验，p=0.012)。说明十四酸乙酯对雄蛾具有显著的吸引作用。六、野外生测野外生测地点设在河北省康保县北关村的一片朽1条(Caragana intermedia)地块(约300mX800m)。2011年6月与2012年6月各进行一次野外诱引，2011年使用诱捕器为深绿色船形(25cm LX 15cm BXlOcm H)，2012年为白色三角形诱捕器(21cm LX 14cmBX 12cm.H)，均购自北京中捷四方生物科技有限公司。分别设处理组和对照组，每组6个诱捕器。处理组诱捕器内置性诱剂诱芯(剂量为50ng/ μ LX 20 μ L)，对照组诱芯仅有20 μ L 二氯甲烷。诱捕器悬挂于柠条的枝条上，距地面高度为50cm左右，组间距离10m，组内距离5m，各处理和对照随机分布其中。诱捕器放置时间为傍晚7时左右，次日早晨6点左右收集，统计诱引草地螟雄蛾的数量。数据分析:野外生测处理组与对照组诱蛾数量的差异比较采用单因素方差分析(one-way AN0VA)。所有数据均通过SPSS17.0进行统计分析。野外生测结果:2011年6月的野外诱引单个诱捕器最多诱到雄蛾17头(另有雌蛾I头)，其余均仅诱到雄蛾(图6)，2012年 6月的野外诱引单个诱捕器最多诱到雄蛾15头，均未诱到雌蛾；两次诱弓I处理组与对照组之间差异均达到显著(图7 )。以上研究结果证实,十四酸乙酯(Ethyl myristate)为我国草地螟雌蛾释放的性引诱剂，雌蛾羽化后第3日(即3日龄)暗期便可进入求偶(Calling)状态，性腺从腹部末端伸出，释放性信息素，吸弓I雄蛾前来交配。19世纪70年代加拿大学者的Struble和Lilly鉴定草地螟雌蛾释放的性信息素为Ell-14:Ac，并在田间试验了其他的一些增效成分，但效果不稳定。我国草地螟研究者采用Ell-14:Ac及可能的增效成分进行野外诱引，其效果不佳，即使在草地螟蛾密度高达百步惊蛾量500-1500头的田间仍然无法诱到雄蛾，这说明Ell-14:Ac并不是我国草地螟雌蛾性信息素的主要成分。我们在中国草地螟雌蛾的性腺提取液里面分离出的主要化合物中，包括多种烯、醇、酸和酯，但未发现Ell-14:Ac，因此，Ell-14:Ac可能不是发生在我国北方的草地螟雌蛾性腺的主要释放物质。
权利要求
1.十四酸乙酯在作为引诱草地螟(Loxostegesticticalis)的性引诱剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述草地螟(Loxostegesticticalis)为雄性草地螟。
3.—种引诱草地螟(Loxostege sticticalis)的性引诱剂,其活性成分为十四酸乙酯。
4.根据权利要求3所述的引诱草地螟(Loxostegesticticalis)的性引诱剂,其特征在于:所述草地螟(Loxostege sticticalis)为雄性草地螟。
5.十四酸乙酯在防 治草地螟(Loxostegesticticalis)中的应用。
全文摘要
本发明公开了十四酸乙酯在作为引诱雄性草地螟的性引诱剂中的应用。本发明还提供了一种引诱草地螟(Loxostege sticticalis)的性引诱剂，其活性成分为十四酸乙酯。结合使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、气相色谱-触角电位测量系统(GC-EAD)以及系列行为试验，对我国草地螟种群的性信息素进行化学鉴定，并对雄蛾进行野外诱引试验。研究结果证实，十四酸乙酯(Ethyl myristate)为草地螟雌蛾释放的性引诱剂，雌蛾羽化后第3日暗期便可进入求偶(Calling)状态，性腺从腹部末端伸出，释放性信息素，吸引雄蛾前来交配。该研究成果将为应用性信息素对我国草地螟进行虫情监测和防控提供理论依据，以期有效防止草地螟对北方农牧业造成灾害。
文档编号A01P19/00GK103109809SQ201310057649
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者肖永红, 罗礼智 申请人:中国农业科学院植物保护研究所