本发明属于烟草抗病育种技术领域，具体涉及一种人工病圃快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法。
背景技术：
病圃鉴定法是在烟草大田生长环境下形成的抗病性鉴定方法，有人工接种、自然诱发发病两种方式，是传统的烟草黑胫病抗性鉴定方法。烟草中抗黑胫病的种质都是经过该方法多年、多地鉴定筛选得到的，能反映品种的实际抗性水平，但易受气象条件、土壤含菌量的影响，年度间波动大，需要多年多次的重复鉴定。其发病条件的可控性严重制约了鉴定结果的重现性、准确性。国家标准GB/T 23224烟草品种抗病性鉴定中从黑胫病接种体菌谷的制作、接种时期、人工定量接种菌谷等方面规范了人工病圃的建立，虽然也提到灌水保湿环节，但缺乏一些技术操作细节，实施过程中人为因素、环境条件影响比较大，鉴定结果仍然存在较大的波动。为此，利用烟草植株大田易感病时期以及烟草黑胫病菌土壤存活特点，人为创造病害易于发生的环境，就可有效避免环境条件对鉴定结果的影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人工病圃快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法。
本发明的目的是这样实现的，包括黑胫病接种体菌谷的制作、层饼式接种覆盖形成人工病圃、间歇式保湿诱发和抗病评价步骤，具体包括：
A、黑胫病接种体菌谷的制作：将烟草黑胫病病菌接种到麦粒滤液培养基上，于温度26~28℃培养7~10天得到菌丝块，再将菌丝块接种于麦粒培养基中，于26~28℃培养7~10天得到黑胫病接种体菌谷；
B、层饼式接种覆盖形成人工病圃：将A步骤制备得到的黑胫病接种体菌谷分散成单个的谷粒状，接种到易感病期的烟株上，每株3~5g，均匀分布于烟株根茎部四周，再覆一层有机质，然后再盖一层颗粒土形成人工病圃；
C、间歇式保湿诱发：利用B步骤形成的人工病圃，每天早晚定株浇水500~1000 mL各一次或滴灌30~60 min各一次；连续5~7天诱发病害；
D、抗病评价：C步骤间歇式保湿诱发期间，观察烟株黑胫病的发生情况，当对照的感病品种、中抗品种及抗病品种符合国家标准的黑胫病抗性鉴定指标时，对待测定的品种进行病害调查，以国家标准的黑胫病抗性鉴定指标划分抗感性，其中免疫或高抗、抗病、中抗的烟草品种即为抗性材料。
本发明利用烟草植株大田团棵期、旺长期易感病性以及烟草黑胫病菌易于在5 cm土表层存活、生长、繁殖的生物学特性，采用烟株根茎部四周接种菌谷、覆一薄层有机质、盖一薄层颗粒土的层饼式接种覆盖方法形成人工病圃，早晚间歇式保湿人工模拟利于黑胫病易于发病的阵雨天气，满足病害发生要求的高湿、透气环境，有效诱发病害，避免了环境条件对鉴定结果的影响，提高了烟草黑胫病抗性鉴定的准确性与重现性。该方法是传统大田鉴定方法的继承与发展，相比传统大田鉴定方法，不同批次的结果更可靠，具有更强的可比性、重复性；而且从接种到鉴定完成通常一个月就可结束，与传统大田鉴定整个生长季相比，缩短了1/3~1/2的鉴定时间，一个正常生长季可进行2~3批次的抗性鉴定。本发明具有操作简便、节水省工、效率高、烟草黑胫病抗性表型鉴定准确等优点，是一种值得推广的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用烟草植株大田团棵期、旺长期易感病性以及烟草黑胫病菌易于在5 cm土表层存活、生长、繁殖的生物学特征，采用烟株根茎部四周接种菌谷、覆一薄层有机质、盖一薄层颗粒土的层饼式接种覆盖方法建立人工病圃，早晚间歇式保湿人工模拟利于黑胫病易于发病的阵雨天气，满足病害发生要求的高湿、透气环境，有效诱发病害避免了环境条件对鉴定结果的影响，提高了烟草黑胫病抗性鉴定的准确性与重现性；
2、本发明是传统大田鉴定方法的继承与发展，相比传统大田鉴定方法，控制发病的环境条件与病菌基数更严格规范，这样使不同批次的结果更可靠，具有更强的可比性、重复性；
3、本发明从接种到鉴定完成通常一个月就可结束，与传统大田鉴定整个生长季相比，缩短了1/3~1/2的鉴定时间，一个正常生长季可进行2~3批次的抗性鉴定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的人工病圃快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括黑胫病接种体菌谷的制作、层饼式接种覆盖形成人工病圃、间歇式保湿诱发和抗病评价步骤，具体包括：
A、黑胫病接种体菌谷的制作：将烟草黑胫病病菌接种到麦粒滤液培养基上，于温度26~28℃培养7~10天得到菌丝块，再将菌丝块接种于麦粒培养基中，于26~28℃培养7~10天得到黑胫病接种体菌谷；
B、层饼式接种覆盖形成人工病圃：将A步骤制备得到的黑胫病接种体菌谷分散成单个的谷粒状，接种到易感病期的烟株上，每株3~5g，均匀分布于烟株根茎部四周，再覆一层有机质，然后再盖一层颗粒土形成人工病圃；
C、间歇式保湿诱发：利用B步骤形成的人工病圃，每天早晚定株浇水500~1000 mL各一次或滴灌30~60 min各一次；连续5~7天诱发病害7天以后，如连续一周不降雨，可5~7天浇水或滴灌1次；
D、抗病评价：C步骤间歇式保湿诱发期间，观察烟株黑胫病的发生情况，当对照的感病品种、中抗品种及抗病品种符合国家标准的黑胫病抗性鉴定指标时，对待测定的品种进行病害调查，以国家标准的黑胫病抗性鉴定指标划分抗感性，其中免疫或高抗、抗病、中抗的烟草品种即为抗性材料。
A步骤中所述的麦粒滤液培养基为将带壳燕麦粒用水浸泡8~12小时后纱网过滤，得到滤液，向滤液中加入琼脂，灭菌处理即得。
A步骤中所述的麦粒培养基为将过滤后的带壳麦粒与新鲜的豌豆秸秆、蚕豆秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣中的一种粉碎而成的、同麦粒大小的秸秆粒以体积比为（70~90）:（10~30）混匀，灭菌处理制得。
所述的麦粒为燕麦、黑麦或小麦中的一种或几种。
B步骤中所述的接种是先将烟株根茎部四周培上的浮土扒开，接种菌谷，覆盖有机质后，再用颗粒土覆盖烟株根茎部。
B步骤中所述的覆盖是先覆1.5~2.5 cm的有机质，再盖1.5~2.5cm的颗粒土，总的覆盖厚度不超过5 cm，使烟株根茎部四周呈利于收集雨水的碟状。
所述的覆盖（层饼式接种覆盖），一薄层有机质和一薄层颗粒土由250~350 mL容积的覆盖物均匀撒在烟株根茎部四周，完全覆盖了菌谷，整个层饼式接种覆盖的厚度不超过5 cm、烟株根茎部四周明显呈利于收集雨水的碟状。
所述的有机质为商品化有机质为主的育苗基质、草炭无土栽培基质、腐熟的农作秸秆或林下腐殖质中的一种或几种。
所述的颗粒土的粒径为3~5 mm。
C步骤中所述的间歇式保湿是保持烟株根茎部四周的土壤湿润，而烟株的墒面不潮湿。
D步骤中所述的黑胫病抗性鉴定指标为病情指数为0时是高抗或免疫；病情指数为0.1~20时是抗病；病情指数为20.1~40时是中抗，病情指数为40.1~60时是中感，病情指数为60.1~80时是感病，病情指数为80.1~100时是高感。
实施例1
区试品种的田间黑胫病抗性鉴定
烟草黑胫病病菌即烟草疫霉为0号生理小种（中华人民共和国烟草行业标准YC/T 39-1996），调查病害以株为单位，按国家标准GB/T 23222烟草病虫害分级及调查方法进行，调查所有接种烟株。对照免疫品种为RBST、抗病品种为革新三号、中抗品种为云烟87和K326、中感品种为金星6007、高感品种为小黄金1025和红花大金元。
具体步骤如下：
（1）黑胫病接种体菌谷的制作：将烟草黑胫病病菌即烟草疫霉0号生理小种119号菌株接种在燕麦粒滤液培养基上，26~28℃培养7~10天，获得平板培养的菌丝块；再将平板培养的菌丝块接种于燕麦粒培养基中，26~28℃培养7~10天，即得黑胫病接种体菌谷；
（2）层饼式接种覆盖形成人工病圃：将步骤（1）得到的菌谷掏出，扳开块状培养物，使之分散成单个的谷粒状，接种易感病团棵期的烟株，将烟株根茎部四周培上的浮土扒开，每株5 g，均匀分布于烟株根茎部四周，用250 mL塑料烧杯装一满杯烟草漂浮育苗基质作为一薄层有机质覆盖菌谷，再将扒开的颗粒浮土均匀覆盖有机质，总厚度不超过5 cm，使烟株根茎部四周明显呈利于收集雨水的碟状，形成人工病圃；
（3）间歇式保湿诱发：利用步骤（2）形成的人工病圃，每天早晚定株浇水1000 mL各1次，连续5~7天早晚间歇式保湿诱发病害，7天以后如连续一周不降雨，可5~7天浇水或滴灌1次；保湿时仅保持烟株根茎部四周的土壤湿润，而烟株的墒面不潮湿；
（4）抗病评价：间歇式保湿诱发期间，开始观察烟株黑胫病的发生情况，当对照的感病品种、中抗品种及抗病品种符合国家标准的黑胫病抗性鉴定指标时，对待测定的品种进行病害调查，以国家标准的黑胫病抗性鉴定指标划分抗感性，病情指数为0时是高抗或免疫，病情指数为0.1~20时是抗病，病情指数为20.1~40时是中抗，病情指数为40.1~60时是中感，病情指数为60.1~80时是感病，病情指数为80.1~100时是高感，其中免疫或高抗、抗病、中抗的烟草品种即为抗性材料。
实验结果表明，32个供试材料中无免疫的品种，也无高感的品种，抗性品种24个、占75.00%，其中抗病的有12个、占37.50%，中抗的有12个、占37.50%，中感的有7个、占21.88%，感病的有1个、占3.12%（表1）。说明供试的大多数品种具有较强的黑胫病抗性，可作为抗病品种推广应用。
表1 烟草品种人工病圃抗黑胫病快速鉴定结果