一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法与流程

本公开涉及植物繁殖技术领域，尤其涉及一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法。

背景技术：

毛叶山桐子(idesiapolycarpamaxim.var.vestitadiels)是大风子科山桐子属的变种，为我国的一个乡土树种。为落叶乔木，具有速生、水土保持功能好，且果实产量大、含油率高、油质好、可食用等特点，是一种较好的生态经济林木。

毛叶山桐子树高达10～15m，树皮平滑，叶互生，宽卵形至卵状心形，端尖，长8～20cm，宽6～20cm，边缘有疏锯齿，冠幅大，在自然生态中是中、低层植被的良好屏障。该树种属浅根性树种，主根不明显，但侧根非常发达，成水平分布，根系密集层为20～60cm，根端根须密集成网，这一特点使其对土地表层水土的保持能力极强。同时,毛叶山桐子产量高，单株产量高的可达200～300kg，产果的持续时间长达70～100年。毛叶山桐子果实含油率高，干果达36％～38％，油品质量好，其中不饱和脂肪酸高达82％以上，亚油酸就高达68％以上，维生素e含量高达1‰以上，是良好的食用油、保健油和工业用油原料。

毛叶山桐子素有“绿荫护夏，红果迎秋”的美誉，可作为行道树和观赏树种，其成片种植区具有旅游开发价值。此外,毛叶山桐子具有耐旱、耐贫瘠的特点，对种植土壤要求不高。由于毛叶山桐子的上述突出优点，开发毛叶山桐子对生态建设、解决“三农”问题，促进农业和林业的可持续发展都有十分重要的意义。

我国四川、甘肃、陕西、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、贵州等地都曾经有毛叶山桐子的分布，但由于种种原因，野生毛叶山桐子自然繁殖力十分低下，野生毛叶山桐子的数量已急剧减少。由于毛叶山桐子的种子极小，发芽困难，传统育苗方法导致育苗苗情参差不齐，苗子质量严重弱化，不利于产业化推广。毛叶山桐子也是一种雌雄异株的速生落叶乔木，传统种子育苗不能保证为雌性树种，导致油料树毛叶山桐子推广困难。

因而，亟需要一种毛叶山桐子的人工培育新方法，开展毛叶山桐子良种选育和组培快繁研究，利用现代生物技术手段，在建立组培再生和遗传转化的基础上，并使其大规模工程化应用。

技术实现要素：

为克服相关技术中存在的问题，本公开实施例提供一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法。

根据本公开实施例的第一方面，提供一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法，包括：

步骤1：将培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒待用；

步骤2：采用优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经乙醇-纳米银溶液消毒，用无菌水冲洗4-5次；

步骤3：无菌条件下，将消毒的外植体接种在含有抗褐变成分的启动培养基中，将其置于8℃低温暗培养7天，然后转为温度23℃，日光为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光10小时，湿度为60％，培养30天，分化长成单芽苗；

步骤4：将长成的所述单芽苗，剪切成带有隐芽的小段，接种于注入增殖培养基的所述玻璃瓶中，进行增殖培养，不断增殖，得到试管芽苗；

步骤5：将培养的所述试管芽苗，对基部剪切去愈伤组织，接种于消毒的注入壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养30-35天；

步骤6：将试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，接种于消毒的注入生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天；

步骤7：将生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有草炭和花生壳粉的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。

所述步骤1具体包括：

将培养基配好调节ph值，加热溶解后分装注入玻璃瓶中，经115℃高压消毒15min后凝固待用。

所述步骤2具体包括：

采用优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经0.5％乙醇-纳米银溶液消毒15min，用无菌水冲洗4-5次放于无菌0.1％pvp水中保存待用。

所述步骤3具体包括：

无菌条件下，将消毒的外植体用手术刀斜切成带有隐芽的1cm-2cm长茎段。接种在步骤1的含有抗褐变成分的启动培养基中，将其置于8℃低温暗培养7天，然后转为温度23℃-25℃，日光为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光10小时，湿度为60％，培养30天，在茎段隐芽出分化长成单芽苗。

所述步骤7具体包括：

将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有体积比为：草炭∶花生壳粉＝1∶1的基质中，喷施多菌灵后浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。

所述培养基成分配比包括：

硝酸钾80，抗坏血酸2.0，硝酸钙287.0，硫酸镁738.0，硫酸钠53.0，氯化钾65.0，磷酸二氢钠19.1，盐酸硫胺素(维b1)0.2，盐酸吡哆素(维b6)0.1，肌醇100，烟酸1.0，甘氨酸3.0，蔗糖20000，硫酸锰6.6，硫酸锌2.7，碘化钾0.75，氯化钴0.025，硼酸1.5，钼酸钠0.025，edta-铁30，卡拉胶6.5g；其中，ph值为5.7，配比单位为mg/l。

所述步骤3中含有抗褐变成分的启动培养基，还包括：

所述培养基中添加tdz0.02-0.1mg/l、6-ba0.5-1.0mg/l和α-naa0.05-0.15mg/l。

所述步骤4中的增殖培养基，还包括：

所述培养基添加tdz0.02-0.1mg/l、6-ba0.8-1.5mg/l和α-naa0.05-0.15mg/l。

所述步骤5中的壮苗培养基，还包括：

所述培养基添加tdz0.02-0.05mg/l、6-ba0.8-1.5mg/l和α-naa0.1-0.5mg/l。

所述步骤6中的生根培养基，还包括：

所述培养基添加α-naa0.1-0.3mg/l和iaa0.3-0.9mg/l。

本公开的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

以优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经过培养基的筛选，制成诱导的专用培养基，成功的建立了毛叶山桐子树组织培养育苗的全套体系，为毛叶山桐子树大量组织培养快速繁殖提供了一条可靠的技术和方法。

采用组织培养方法，繁殖系数高，在短期内能提供大量的优质种苗，加快了毛叶山桐子树推广应用的速度。与同类方法相比，本方案具有很大优势，如根插育苗虽然比较容易操作，但是会严重损害母株，枝插繁殖生根困难，成活率低；种籽育苗方法中由于毛叶山桐子树种子非常小，且种皮坚硬，常规田间发芽率不足4％，造成种子的大量浪费和造林中毛叶山桐子树种苗的缺乏。所以本方案具有很强的实用意义，采用组织培养法繁育种苗，实现矮、密、早、丰栽种管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模毛叶山桐子树育种提供了快速有效途径。

本公开的方案，通过对外植体进行预处理获得低本底污染材料。经过消毒和脱酚化处理减少外植体的褐变，通过降低培养基盐浓度和添加还原性物质来减轻褐变提高了外植体的存活。

本公开的方案，利用组培技术使得毛叶山桐子组培外植体可以在30天获得建立无菌系，并通过增值培养基获得4倍的增值率，通过生根培养基可以获得80％的生根苗，苗高5-15cm，新根5条以上。移栽练苗成活率达到90％。可以支持实现毛叶山桐子的工厂化生产育苗需要。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

图1是根据一示例性实施例示出的一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法原理示意图；

图2是根据另一示例性实施例示出的一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法原理示意图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的装置和方法的例子。

图1是根据一示例性实施例示出的一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法原理示意图，包括：

步骤1：将培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒待用。

步骤2：采用优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经乙醇-纳米银溶液消毒，用无菌水冲洗4-5次。

步骤3：无菌条件下，将消毒的外植体接种在步骤1的含有抗褐变成分的启动培养基中，将其置于8℃低温暗培养7天，然后转为温度23℃，日光为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光10小时，湿度为60％，培养30天，分化长成单芽苗。

步骤4：将从步骤3中长成的芽苗，剪切成带有隐芽的小段，按步骤3的方法接种于按步骤1的方法消毒的注入增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要到500瓶时，进入下一步。

步骤5：将步骤4中培养的试管芽苗，对基部剪切去愈伤组织，按步骤3的方法接种于按步骤1的方法消毒的注入壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，30-35天后进入下一步。

步骤6：将步骤5中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，接种于按步骤1的方法消毒的注入生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天。

步骤7：将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有体积比为草炭∶花生壳粉＝1∶1的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。该方法可以满足优良品系的毛叶山桐子工业化育苗，具有出苗率高苗情一致，苗势旺盛，移栽定植成活率可达90％以上。

具体来说，本实施例中各个步骤的具体实现过程如下：

步骤1：将培养基配好调节ph值，加热溶解后分装注入玻璃瓶中，经115℃高压消毒15min后凝固待用。

步骤2：采用优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经0.5％乙醇-纳米银溶液消毒15min，用无菌水冲洗4-5次放于无菌0.1％pvp水中保存待用。

步骤3：无菌条件下，将消毒的外植体用手术刀斜切成带有隐芽的1cm长茎段。接种在步骤1的含有抗褐变成分的启动培养基中，将其置于8℃低温暗培养7天，然后转为温度23℃，日光为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光10小时，湿度为60％，培养30天，在茎段隐芽出分化长成单芽苗。

步骤4：将从步骤3中长成的芽苗，剪切成带有隐芽的小段，按步骤3的方法接种于按步骤1的方法消毒的注入增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要到500瓶时，进入下一步。

步骤5：将步骤4中培养的试管芽苗，对基部部剪切去愈伤组织，按步骤3的方法接种于按步骤1的方法消毒的注入壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，30-35天后进入下一步。

步骤6：将步骤5中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，接种于按步骤1的方法消毒的注入生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天。

步骤7：将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽前根部沾有5406菌剂作为接菌保护剂，假植到含有体积比为草炭∶花生壳粉＝1∶1的基质中，喷施多菌灵后浇透水，保持温度25℃，相对湿度80％，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。移栽练苗成活率达到91％。

本公开实施例以优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经过培养基的筛选，制成了诱导的专用培养基，成功的建立了毛叶山桐子树组织培养育苗的全套体系，为毛叶山桐子树大量组织培养快速繁殖提供了一条可靠的技术和方法。本公开实施例的积极效果是采用组织培养方法，繁殖系数高，在短期内能提供大量的优质种苗，加快了毛叶山桐子树推广应用的速度。与同类方法相比具有很大优势。如根插育苗虽然比较容易操作，但是会严重损害母株，枝插繁殖生根困难，成活率低；种籽育苗方法中由于毛叶山桐子树种子非常小，且种皮坚硬，常规田间发芽率不足4％，造成种子的大量浪费和造林中毛叶山桐子树种苗的缺乏。所以本公开实施例具有很强的实用意义，采用组织培养法繁育种苗，实现矮、密、早、丰栽种管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模毛叶山桐子树育种提供了快速有效途径。

本公开实施例通过对外植体进行预处理获得低本底污染材料。经过消毒和脱酚化处理减少外植体的褐变，通过降低培养基盐浓度和添加还原性物质来减轻褐变提高了外植体的存活。

本公开实施例利用组培技术使得毛叶山桐子组培外植体可以在30天获得建立无菌系，并通过增值培养基获得4倍的增值率，通过生根培养基可以获得80％的生根苗，苗高5-15cm，新根5条以上。移栽练苗成活率达到90％。可以支持实现毛叶山桐子的工厂化生产育苗需要。

进一步的，上述各阶段用基本的培养基如下成分：单位(mg/l)

硝酸钾80，抗坏血酸2.0，硝酸钙287.0，硫酸镁738.0，硫酸钠53.0，氯化钾65.0，磷酸二氢钠19.1，盐酸硫胺素(维b1)0.2，盐酸吡哆素(维b6)0.1，肌醇100，烟酸1.0，甘氨酸3.0，蔗糖20000，硫酸锰6.6，硫酸锌2.7，碘化钾0.75，氯化钴0.025，硼酸1.5，钼酸钠0.025，edta-铁30，卡拉胶6.5g；ph5.7。

上述各阶段培养基添加植物生长激素如下：

启动培养基：添加tdz0.02-0.1mg/l、添加6-ba0.5-1.0mg/l和添加α-naa0.05-0.15mg/l。

增殖培养基：基本培养基添加tdz0.02-0.1mg/l、添加6-ba0.8-1.5mg/l和添加α-naa0.05-0.15mg/l。

壮苗培养基：基本培养基添加tdz0.02-0.05mg/l、添加6-ba0.8-1.5mg/l和添加α-naa0.1-0.5mg/l。

生根培养基：基本培养基添加α-naa0.1-0.3mg/l和添加iaa0.3-0.9mg/l。

图2是根据另一示例性实施例示出的一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法原理示意图，包括：

步骤11，材料的处理，采来的优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经过无菌处理后进行诱导试验。

步骤12，芽的诱导，经表面灭菌处理好的材料接种在诱导启动培养基上进行诱导试验，每瓶接种一个腋芽，30天后得到芽苗。

步骤13，增殖培养，芽诱导培养之后进行芽苗增殖培养，增殖一段时间后得到大量芽苗。

步骤14，壮苗培养，将增殖后的芽苗移入壮苗培养基中进行壮苗培养。

步骤15，根诱导培养，将壮苗移入生根培养基中进行根的诱导培养。

步骤16，移栽，诱导出根的小苗，移栽到草炭与花生壳粉混合培养基质中，栽培炼苗，然后移栽到室外大田上。四周后统计移栽成活率。

本实施例中，将培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒待用；采用优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经乙醇-纳米银溶液消毒，用无菌水冲洗4-5次；无菌条件下，将消毒的外植体接种在含有抗褐变成分的启动培养基中，将其置于8℃低温暗培养7天，然后转为温度23℃，日光为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光10小时，湿度为60％，培养30天，分化长成单芽苗；将长成的芽苗，剪切成带有隐芽的小段，接种于消毒的注入增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要到500瓶时，将培养的试管芽苗，对基部剪切去愈伤组织，接种于消毒的注入壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，30-35天后，将试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，接种于消毒的注入生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天；将生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有体积比为草炭∶花生壳粉＝1∶1的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。该方法可以满足优良品系的毛叶山桐子工业化育苗，具有出苗率高苗情一致，苗势旺盛，移栽定植成活率可达90％以上。

本公开各个实施例，以优良野生或驯化单株的腋芽茎段为外植体，经过培养基的筛选，制成诱导的专用培养基，成功的建立了毛叶山桐子树组织培养育苗的全套体系，为毛叶山桐子树大量组织培养快速繁殖提供了一条可靠的技术和方法。

采用组织培养方法，繁殖系数高，在短期内能提供大量的优质种苗，加快了毛叶山桐子树推广应用的速度。与同类方法相比，本方案具有很大优势，如根插育苗虽然比较容易操作，但是会严重损害母株，枝插繁殖生根困难，成活率低；种籽育苗方法中由于毛叶山桐子树种子非常小，且种皮坚硬，常规田间发芽率不足4％，造成种子的大量浪费和造林中毛叶山桐子树种苗的缺乏。所以本方案具有很强的实用意义，采用组织培养法繁育种苗，实现矮、密、早、丰栽种管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模毛叶山桐子树育种提供了快速有效途径。

本公开的方案，通过对外植体进行预处理获得低本底污染材料。经过消毒和脱酚化处理减少外植体的褐变，通过降低培养基盐浓度和添加还原性物质来减轻褐变提高了外植体的存活。

本公开的方案，利用组培技术使得毛叶山桐子组培外植体可以再30天获得建立无菌系，并通过增值培养基获得4倍的增值率，通过生根培养基可以获得80％的生根苗，苗高5-15cm，新根5条以上。移栽练苗成活率达到90％。可以支持实现毛叶山桐子的工厂化生产育苗需要。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的公开后，将容易想到本公开的其它实施方案。本申请旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。