本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664及其分子鉴定方法和应用。
背景技术：
：植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2，玉米的ms45和水稻的mil1等；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecarpollen和geminipollen；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因ms44；2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了rf-1，rf-2，rf-4，rf-5等基因。水稻是我国的民族产业，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。目前，我国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的55％左右。杂种水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻品种，通过杂交产生具有杂种优势的第一代杂交种用于生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，主要表现在生长旺盛，根系发达，穗大粒多，抗逆性强等方面。杂交水稻比常规稻增产达30％。目前我国种植的杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻(三系杂交稻)就是生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系(简称不育系，代号a)有野败型，红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系(简称保持系，代号b)是用来繁殖不育系一种水稻。其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育细胞质基因，可产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系(简称恢复系，代号r)携带恢复基因，能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种(即杂交稻)正常可育。三系育种法存在感病、品质差、育种效率低等问题。因受恢保关系的制约，95％的水稻资源不能用于杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合几率大；不育系可一系两用。但是两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大。比如在制种期间遇上低温，不育系将转为可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率，导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研究课题。通过自然突变体鉴定和人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在水稻上获得了多种新的不育突变体。ptc1突变体就是其中之一。其突变体的花药明显变小、变白，不产生成熟花粉粒。该突变体由ptc1基因第二外显子上一个t碱基插入引起。ptc1基因有3个外显子和两个内含子，编码一个680个氨基酸的phd锌指蛋白，是水稻绒毡层细胞程序性死亡的重要调控因子。ptc1在水稻花药发育第8、9阶段的绒毡层细胞和小孢子中特异表达，调控着绒毡层细胞的发育及降解。在ptc1的缺失突变体植株中，绒毡层细胞无限制扩增及增大，导致绒毡层细胞降解延迟；小孢子从四分体脱落后，乌氏体形成异常，导致花粉壁发育缺陷，引起完全雄性不育。技术实现要素：本发明的目的是提供一种水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664及其分子鉴定方法和应用。本发明首先对籼稻品种93-11种子(m0代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获m1代植株；m1代植株自交产生种子(为m2代)，种植m2代植株，对m2代植株进行形态学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和dna序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研究。本发明提供的水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664，其为水稻基因组(基因组版本asm465v1)第九染色体上，从第15324556位碱基开始到第15583926位碱基共259370个碱基缺失，该缺失片段包含整个ptc1基因。进一步地，水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664，其相对于野生型缺失片段两端核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明提供了水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664在制备转基因植物中的应用。本发明提供了水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。本发明提供了水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664在水稻改良育种、制种中的应用。本发明还提供了检测水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664的分子标记，该分子标记是由以下引物组合的引物扩增获到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别为：上游引物1664_f1：catctcgcagtttacatgcag(如seqidno.2所示)下游引物1664_r1：agtctactcgagctactaccg(如seqidno.3所示)。下游引物1664_r2：ccatctgaaactagtactccca(如seqidno.4所示)。本发明提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。一种检测水稻ptc1基因缺失突变体ptc1-1664的方法，通过下述引物组合扩增待检植物基因组dna，并用琼脂糖电泳检测：所述引物对的核苷酸序列为：上游引物1664_f1：catctcgcagtttacatgcag(如seqidno.2所示)下游引物1664_r1：agtctactcgagctactaccg(如seqidno.3所示)。下游引物1664_r2：ccatctgaaactagtactccca(如seqidno.4所示)。如果用上述引物组合扩增出的产物为811bp，则标志着该待检植物ptc1基因型为野生型；如果扩增产物为546bp，则标志着该待检植物ptc1基因型为ptc1-1664突变体；如果扩增产物为546bp、811bp两条带型，则标志着该待检植物ptc1基因型为野生型和ptc1-1664突变体的杂合基因型。本发明的有益效果在于：(1)本发明提供了一种新的水稻隐性核雄性不育突变体，为发展新的雄性不育制种方法奠定了材料基础。(2)本发明的水稻ptc1-1664突变体只影响雄性育性，造成雄性完全不育，但对雌性育性和其它农艺性状没有影响。(3)因辐射诱变造成与野生型相比有259370bp的染色体片段缺失，采用实验室常用的琼脂糖电泳就能开展分子检测，即能够实现鉴别，不需要特别的检测技术和方法。(4)本发明的水稻ptc1基因突变体ptc1-1664可直接用于杂交组合选育和不育系改良，经济价值巨大。附图说明图1是实施例2中ptc1-1664突变体和野生型的株型与穗型照片。图2是实施例3中ptc1-1664突变体的花药体式显微镜照片与显微镜照片。图3是实施例6中ptc1-1664突变体染色体缺失位点示意图。图4是实施例7中ptc1-1664×93-11组合f2群体中可育株和不育株染色体片段缺失位点的pcr产物的电泳照片。图5是实施例8的杂交转育的技术路线图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1钴60辐射诱变突变体库选用籼稻骨干亲本品种93-11作为辐射处理的材料，该品种已完成了全基因组测序，对水稻分子育种十分有利。2013年夏，于长沙钴60(60co)辐射93-11种子(m0代)10公斤，7月种植于海南临高田间，分单株收获m1代种子，共收获约6500份种子。选取m1代种子3200个株系，每个株系种植50棵单株。2014年春季，种植于海南临高田间。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。每个株系收6个单株，共19200个单株作为突变体库资源保存。实施例2m2代种植与性状观察m1代植株自交产生种子，种植m2代，在m2代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为1664的家系中发现4株育性异常的植株，该突变体在营养生长、抽穗期、穗型均与野生型没有明显区别，图1为该突变体植株与野生型植株的株型(图1的a)和穗型(图1的b)对比照片，但花药比野生型小，颜色浅黄，结实率很低，被选作候选突变体材料进行下一步研究。实施例3花粉镜检，自交，异交通过数碘染着色与不着色花粉比例，统计花粉育性。在体式显微镜下观察1664突变体小花形态，发现雌蕊与野生型无明显区别，花药比野生型小，颜色较浅(图2的a、b图)。田间采集开花期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液(0.6％ki，0.3％i2，w/w)中轻轻挤压花药，滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照(图2的c、d图)。野生型花粉多而染成蓝黑色，而突变体则看不到花粉粒。同一家系野生型植株套袋自交后正常结实，而1664突变体不结实。用93-11和中花11为突变体授粉，均可正常结实，得到f1代种子。表明该突变体为雄性不育突变体，雌性不受影响。对f1代自交得到f2代种子，种植f2代植株510株，将花药碘染后在显微镜下观察，其中382株花粉正常碘染，且正常自交结实，196株无花粉，且自然结实率低，符合3:1分离，表明该不育性状由单个隐性基因控制。实施例4叶片采样与dna提取采用ctab法提取水稻叶片dna，具体方法如下：称取约0.1g叶片，放入离心管，加入600μlctab提取缓冲液，5μlrnasea，震荡分散，65℃水浴0.5hr，其间轻摇2-3次；加入等体积氯仿/tris-饱和酚(1:1，v/v)，混匀，轻摇10min；4℃10000rpm离心20min；转移上清至新管，加入1/10体积的3m乙酸钠(ph值5.2)、0.6-1倍体积的冷异丙醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4℃10000rpm离心10min；弃去上清，用体积百分含量70％乙醇洗沉淀2次；风干，加入50μl1×te溶解沉淀，-20℃保存。用nanodrop2000检测dna浓度，稀释至10ng/l用作pcr模板。实施例5pcr反应与产物回收参考93-11基因组的列，在缺失片段最邻近的已知片段序列设计一组热不对称pcr引物，扩增1664突变体dna。用于扩增缺失片段侧翼序列的引物对序列见下表1：表1用于扩增缺失片段侧翼序列的引物对序列引物对名称引物序列1664sp1_fgcacactgcacggcgacgtttagg1664sp2_facgatggactccagtctggctgccgtgggaattagagcat1664sp3_fccctccaggagattgtctaaaattgacttt1664ac1_racgatggactccagag1664lad1_racgatggactccagagcggccgcvnnnggaa1664lad2_racgatggactccagagcggccgcvvnvnnnccaapcr反应体系为：1μl10×反应缓冲液，0.25μldntp，0.25μl正向引物和0.25μl反向引物，0.5utaq酶，1μl10ng/μl模板dna，加超纯水将总体积补至10μl。pcr反应分三步进行：第一步使用引物对1664sp1_f、1664lad1_r和1664lad2_r，模板dna为ptc1-1664基因组dna，反应程序为：93℃预热2min，95℃变性1min，然后执行以下循环：94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，10个循环；接着94℃变性30s，20℃复性2min，72℃延伸3min，再执行以下循环：94℃变性20s，58℃复性1min，72℃延伸3min，25个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。第二步使用引物对1664sp2_f和1664ac1_r，模板dna为反应1产物40倍稀释液，反应程序为：执行以下循环94℃变性20s，65℃复性1min，72℃延伸3min，1个循环，然后再执行以下循环：94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，50℃复性1min，72℃延伸3min，13个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。第三步使用引物对1664sp3_f和1664ac1_r，模板dna为反应1产物10倍稀释液，反应程序为：94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，50℃复性1min，72℃延伸3min，6-7个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5v/cm电场下电泳30min；采用市面dna凝胶回收试剂盒回收反应2的pcr产物。实施例6dna序列分析将回收所得的反应2的pcr产物dna采用abi3730测序仪进行测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用dna序列分析软件dnaman6.0对双向测序结果进行拼接，拼接后序列如seqidno.1所示。将seqidno.1序列与水稻基因组序列(基因组版本asm465v1)进行比对，结果显示：seqidno.1第1到1149位碱基与第九染色体第15323406到第15324555位碱基完全匹配，而第1150到第2225位碱基与第九染色体第15583927到15585003位碱基完全匹配，表明1664突变体在第9染色体上第15324556位碱基到第15583926位碱基，共259370个碱基发生了缺失。该缺失区间包含了水稻ptc1整个基因，故将该突变体基因命名为ptc1-1664(参见图3，虚线部分表示缺失的片段，箭头处表示缺失片段中包含着整个ptc1基因)。实施例7突变位点分子标记设计与共分离验证根据实施例6中得到的突变位点两侧的序列设计3条基因特异引物：正向引物1664_f1，其核苷酸序列如seqidno.2所示；反向引物1664_r1，其核苷酸序列如seqidno.3和1664_r2，其核苷酸序列如seqidno.4所示。其中1664_r2位于缺失片段上。如果用上述引物组合扩增出的产物为811bp，则标志着该待检植物ptc1基因型为野生型；如果扩增产物为546bp，则标志着该待检植物ptc1基因型为ptc1-1664突变体；如果扩增产物为546bp、811bp两条带型，则标志着该待检植物ptc1基因型为野生型和ptc1-1664突变体的杂合基因型。在实施例3中获得的有表型分离的m3群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株，提取叶片dna，与93-11基因组dna一起，分别用上述引物对进行扩增。pcr反应体系为：10×反应缓冲液1μl，dntp0.25μl，引物1664_f1、1664_r1和1664_r2各0.25μl，taq酶0.5u，10ng/μl模板dna1μl，加超纯水将总体积补至10μl。pcr反应程序为：95℃变性3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53-58℃复性20s，72℃延伸30s，35个循环。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中，5v/cm电场下电泳30min，在凝胶成像系统中记录电泳图像。结果见图4，表型为野生型植株扩增产物的电泳带型全部为野生型93-11或杂合型带型，突变体扩增产物的电泳带型全部与1664(ptc1)带型相同。这一结果表明实施例6中所述突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。这一结果结合该突变体的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断1664突变体的雄性不育表型是由实施例6中所述的突变造成的。实施例8突变基因的杂交转育可按图5的步骤将ptc1-1664的不育基因ptc1通过杂交转育到其它水稻遗传背景中：①杂交：以ptc1-1664为母本，与受体水稻材料为父本杂交获得f1种子；②第一轮回交：f1播种后获得f1植株，将f1植株与轮回亲本进行杂交，获得bc1种子；②bc1不育基因选择(前景选择)：播种bc1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例4中所述方法提取dna，以seqidno.2-4所示的引物(1664_f1和1664_r1、1664_r2)进行扩增和电泳，选取基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；③bc1背景选择：采用一组(例如100个，或200个等)在ptc1-1664和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于ssr、snp、est、rflp、aflp、rapd、scar等类型标记)，对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得bc2种子；⑥bc2的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的bc2代植株；⑦自交获得bc2f2种子：对步骤⑥中选出的bc2植株进行自交，获得bc2f2种子；⑧bc2f2的前景选择：将步骤⑦中获得的bc2f2种子播种，获得500株以上幼苗，在幼苗期采集叶片，以实施例4中所述方法提取dna，以实施例7中所列的引物组合(1664_f1和1664_r1、1664_r2)进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合野生型的单株；⑨bc2f2的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景筛选，选出100％背景纯合的单株。如果中选单株的1664_f1和1664_r1、1664_r2引物组合带型为纯合突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它水稻材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株用于杂交育种或制种。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>海南波莲水稻基因科技有限公司<120>一种水稻ptc1基因缺失突变体及其分子鉴定方法和应用<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2225<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgatgcatgaactatgaaaacaaactacttggtggcttcttgatttttgtatcatgagtt60ccgctggactctgccgagcgttcctctaatctctatctagaaatggcttcaaatcaattg120gatattgaaaaaatggctttcagatgttggtaaagttaacaaagaaaacgatctttaatg180atgttcatataggttgatgtgtaattttcaattcagtttccatggaacagctttgagaaa240tgagagtcacgagacccatatcatcttaatattctgatttgcttctggcaaaagattcat300tacgtggtcaactaattatcacaatatgttctacatccatttgtgtgtagaactctttaa360atacatgtgctagcaatgagtatcattttttttatagataaaatatttatataaaacccg420acctctacagcaagatggatgtacacggccaatagttataggccttgtttagatctcaaa480aaattttagtcaaaaacatcatatcaaatgtttagacacatatatggggcattaaatatg540ggaaaaaaccaattacacagtttacatgtaaattgcgaaacgaatcttttgagtttaatt600acgccatggtttgacaatgtgatgctatagtaaaaatttgctaataacggattgattagg660tttaataaattcatctcgcagtttacatgcagaatctgtaatttattttgttattagttt720acgtttaatacttcaaatgtgtgttcgtatacttcaaaaactttacacccaaaaatgtgt780gtccgtatgcttcaaaaactttacacccaaagaattaaacacatccataggatatgaaag840tgttcagctttcttgttcggttttcccgaataaaccgagaattggatacgcatggtacgg900aggtggcacaggccgcgtccgcacactgcacggcgacgtttaggctggctgccgtgggaa960ttagagcatcccaatatttcattcccaaaattatttttatgggaatgctaaacaaaattt1020gatgtgctaaaatattgatccctccaggagattgtctaaaattgactttctaaaattaaa1080aatgggccctctacgaaaccaccaactgaattttatttccgtctctccctctgagaaatc1140acggtcacggtctccctccgttctccctcctcgctccgtctcctccccctagctttcggt1200agtagctcgagtagactccccgtagctagccggcgccgccccaaccgttgtcttcgctcg1260ccgtgtgctcgccgccatcgccgcccgagctccgtagcgccgctcgtcgccggcctcgct1320cggcaaagttccacccaatccgacgctagcgtcgagttcccgaagccgcgtaagtgctct1380caccgccgggaatcgacccctcgtggcctcgtcgccgtttccctcttctcccgccgccgg1440ttgccgccgccgcaatccgccgccatcgagcaacctccggcgaatccgagccgttggctc1500gtctccccttgtcctgtacaaccgccccgtgcgctcgctcttgcccgtaccgccgtggtt1560cgctccgccgctcgccgccgccgcccgccgtccattcgcggctgggtcgtcgtctacctc1620ccgccggcctgcgtggctgccacgtaggcgccacgtcggcgccagctcagccgagaccgg1680ataagccgacccggccagccgcttcctccgatcctccccgtgtgcgtggtccgcggtgag1740ccgtgaggctgcgcgtgggccgccgtatccgttcctccgtgaaccgcgcgcgtgcaccgc1800gtcccagccccgcccgcgcgcgtgcgccgcatactccttccgcacggtgagccgagccgc1860tgacaagcgggtcccacccgggaccgcgcgtggtgagcccggtccaccggactctctctc1920ctccctcccgcgcgcgcgcaagcttgggccgtaatgggccggccggcccatttagttcgg1980ccggtccgttccaattcccttgggccgcgccttagccgcccaaggaaaagtccacaatcc2040ctccctcttttcttttcctttttctttttcaaaaaaaaaggatttaattaaatccttttc2100ctttagaccaaaaatccaataatcttagaaattcaatatcttcccaaccgtaaatccgtt2160tgactccgttcaacttccaaaattcctcaaatctcgagatctatctaatggcacgcttag2220aggtc2225<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2catctcgcagtttacatgcag21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agtctactcgagctactaccg21<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccatctgaaactagtactccca22<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcacactgcacggcgacgtttagg24<210>6<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acgatggactccagtctggctgccgtgggaattagagcat40<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccctccaggagattgtctaaaattgacttt30<210>8<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8acgatggactccagag16<210>9<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9acgatggactccagagcggccgcvnnnggaa31<210>10<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acgatggactccagagcggccgcvvnvnnnccaa34当前第1页12