avusTD-I代谢产生的挥发性物 质进行抑菌活性实验，结果表明，VOCs能有效的抑制灰霉孢菌菌丝生长和产孢量，菌丝生长 抑制率达66. 67%，并使细胞膜通透性增大、细胞形态异常、菌丝表面粗糙、分节增多。也有 研宄表明，挥发性物质除了造成真菌形态的改变外，还能影响菌体细胞内相关酶的活性，可 见，挥发性物质抑制微生物生长的作用方式是一个较为复杂的体系。
[0132] 四、白黄链霉菌TD-I发酵液在番茄离体叶片上对灰霉病菌的防治效果
[0133] 摘取叶龄、大小一致的番茄叶片，用无菌水洗净、晾干。将叶片浸于TD-I发酵液中 lmin，取出后在子叶叶柄部包裹醮水脱脂棉保持子叶活力。以无菌水浸叶为空白对照，每处 理设3个重复，每重复处理6片叶。叶片浸药后，正面朝上摆放在含有0. 5%琼脂的培养皿 中。在每片叶中央接种一个直径为6mm的灰霉病菌菌饼，置于25°C恒温培养室中培养5-6d 后，用十字交叉法测病斑直径。
[0134] 病斑平均直径（mm)=测量平均直径一 6
[0135] 防治效果（％) =(对照病斑平均直径一处理病斑平均直径）/对照病斑平均直 径X100
[0136] 结果见图12,由图12可知，发酵液处理番茄叶片上灰霉病菌的病斑直径明显小 于清水处理的病斑直径。对照处理的叶片上可见水渍状的灰褐色病斑，平均病斑直径约 3. 67cm，TD-I发酵液处理的叶片病斑直径为I. 34cm，抑制率为63. 49%。
[0137] 五、白黄链霉菌TD-I发酵液在番茄植株上对灰霉病的防治效果
[0138] 在番茄植株上喷洒链霉菌TD-I发酵液24h后喷灰霉病菌孢子悬浮液（孢子液浓 度1. 0-5. 0XIO6个/mL)，20-25°C培养，每个处理重复2次，每个重复10株，对照组用清水 代替发酵液。参照方中达（方中达.植病研宄方法[M].北京：中国农业出版社，1998.)的 方法，在接菌后5-6d进行调查并计算病情指数和防效。结果见附图13,由图13可知，对照 组番茄植株叶片大面积发黄枯萎，处理组叶片发病较轻，表面仅见轻微的灰色斑点。
[0139] 实验结果：
[0140] 表2TD-I发酵液在番茄植株上对灰霉病的防效表
[0141]
【主权项】
1. 一种白黄链霉菌在番前灰霉病防治中的应用，所述白黄链霉菌（Streptomyces alboflavus)为白黄链霉菌TD-I，该白黄链霉菌TD-I保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4666,其特征在于：所述白黄链霉菌TD-I的活菌 体、发酵液、麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰 霉病防治中的应用。
2. 根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述 白黄链霉菌TD-I的发酵液的制备步骤如下： ⑴菌种的活化培养： 将分离保存的白黄链霉菌TD-I菌株转接到PDA固体培养基上，30°C条件下培养5-6d， 保存备用； ⑵菌株TD-I孢子悬浮液的制备： 取PDA平板上活化的白黄链霉菌TD-1，用无菌水洗下平板表面的孢子，配成孢子悬浮 液，并调整孢子浓度为I. 0 X IO6个/mL ; ⑶菌株TD-I种子培养液的制备： 种子液培养基为每1000 mL水中含有可溶性淀粉，20.0 g ;黄豆粉，10.0 g ;KN03, LOg ; K2HP04,0. 5g ;NaCl，0. 5g ;MgS04?7H20,0. 5g ;FeS04?7H20,0.0 lg，每 250mL三角瓶装培养基 IOOmL ;配制后121°C灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按1%的接种量将TD-I孢子悬浮 液接种于培养基内，30°C，180r/min摇床培养48h，得到菌株TD-I种子液； (4) ID-I菌株发酵液的制备： TD-I菌株发酵培养基的配制与⑶中种子液培养基配方一致，121°C灭菌20min，待冷却 后在无菌条件下按10%的比例接种TD-I种子液，30°C、180r/min摇床培养6d，5000r/min 离心15min，取上清液备用，即得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-I的发酵液。
3. 根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述 白黄链霉菌TD-I的麦麸培养物的制备步骤如下： 称取干燥麦麸，按照料水比的质量比为1:1的比例添加蒸馏水，121°C灭菌20min，冷却 后按20%的比例接种链霉菌TD-I的种子培养液，在30°C条件下培养8d，即得可用于对灰霉 菌抑菌的白黄链霉菌TD-I的麦麸培养物。
4. 根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述 白黄链霉菌TD-I麦麸培养物的固态菌剂的制备步骤如下： 称取无菌麦麸，按20%的接种量，接种链霉菌TD-I种子液，30°C发酵2d，待菌种适应生 长环境后，将发酵物置于30°C烘箱中干燥24h，再按2% (mL/g)的比例添加司盘60:吐温 80 (体积比1:1)乳化剂到干燥后的固态发酵物中，分装于自封袋中，4°C条件下保存两个月 后，即得白黄链霉菌ID-I麦麸培养物的固态菌剂。
5. 根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述 白黄链霉菌TD-I的麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治中的应用的检测方法 的步骤如下： ⑴抑菌活性测定方法 采用双皿对扣法测定挥发性物质的抑菌活性，根据测量得到的菌落直径，用以下公式 计算挥发性抑菌物质的抑菌率； 抑菌率=[(空白组菌落直径一实验组菌落直径）/空白组菌落直径]X 100% ⑵挥发性物质对菌丝生长和产孢能力的影响 取发酵8d的TD-I麦麸培养物，置于直径90mm的皿底，取活化好的灰霉病菌菌饼，直径 6mm，接种于另一 PDA皿底中央，两皿对扣，封□膜密封，25°C培养，以加入相应质量的无菌 麦麸作为空白对照，每个处理设3个平行，重复3次，5d后，采用十字交叉法测量菌落直径， 按上述公式计算抑菌率，用血球计数板计数各组灰霉病菌的产孢量； ⑶挥发性物质对灰霉病菌细胞膜通透性的影响 双层平皿培养如步骤⑵所述，下层皿底为发酵8d的TD-I麦麸培养物，上层皿底倒 入PDA培养基，冷却后平铺灭菌玻璃纸，I. 5 X I. 5cm2,将灰霉病菌孢子悬浮液浓度调整至 0. 5 - 5X 106CFU/mL，取0. 5mL均匀涂布于玻璃纸上，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白 对照，封口膜密封，25 °C培养，分别于12h、24h、36h、48h和60h时取出，5mL无菌水洗下菌体， 离心，取上清，分光光度计测定OD 26tl值；每个样品做3次平行，重复3次； ⑷挥发性物质对灰霉病菌细胞形态的影响 挑取培养5d的菌落边缘菌丝，在生物显微镜下观察菌丝形态及变化；从PDA培养基上 取大小为3-5mm3灰霉病菌菌块，用扫描电子显微镜观察挥发性物质对菌丝微观形态的影 响； (5) 挥发性物质的对番茄果实上灰霉病菌的防治 取大小一致的番前果实，每个果实用打孔器打一直径6mm的伤口，接种浓度为0. 5 -5X IO6CFUAiL的灰霉病菌孢子悬浮液I y L，将果实放入带隔板保鲜盒，盒底部放入20g TD-I麦麸培养物，放少量无菌水保湿，保鲜膜封住保鲜盒口，以加入相应质量的无菌麦麸作 为空白对照，30°C培养4d后观察灰霉病菌对番茄果实的侵染情况； (6) 挥发性物质的GC/MS分析鉴定 取样品于顶空瓶中，45°C水浴30min，用经老化处理的DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维 头顶空吸附30min收集挥发性物质，GC/MS进样分析检测，以无菌麦麸作为空白对照； 气相色谱条件：色谱柱型号：VF-5MS 30mX0. 25_X0. 25ym ;进样口温度：250°C ;载 气：He，纯度99. 999%;分流比：10:1 ;流速：lmL/min ;程序升温：初始温度40°C，保持3min， 以4°C /min升至150°C，保持lmin，以8°C /min升至250°C，保持6min，根据气相色谱峰面 积归一法确定各组分含量； 质谱条件：质量分离器：离子阱；离子源：EI ;电离能量：70eV ;离子阱温度：220°C ;传 输线温度：280°C ;溶剂延迟时间：1. 5min ;全扫描方式；扫描范围：43-500m/z ;检索谱库： NIST05〇
【专利摘要】本发明涉及一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，所述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)为白黄链霉菌TD-1，该白黄链霉菌TD-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4666，所述白黄链霉菌TD-1的活菌体、发酵液、麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治中的应用。本发明将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1应用在番茄灰霉病害防治中，该白黄链霉菌对番茄灰霉病具有较强的抑制效果，为生物防治灰霉病害提供了一种新的微生物菌株，将其应用在番茄灰霉病害防治中，长期使用不会造成环境污染、残毒积累，不会危及人畜健康。
【IPC分类】A01P3-00, C12P1-06, C12R1-465, A01N63-02
【公开号】CN104872194
【申请号】CN201510173534
【发明人】王昌禄, 单丽萍, 李贞景, 张春慧, 王志芳, 刘春静, 陈勉华
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月13日