时长为12小时，150rpm回旋式震荡培养，培养时间为7天，制得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；其中液体复合高糖增殖培养基的配方为:MS培养基+ 红糖 55g/L+2，4-D 0.5mg/L，pH 5.58 ；
[0058](7)取步骤(6)制得的悬浮细胞IL加入蒸馏水，加蒸馏水的量为500ml，95°C加热提取80min，过滤保存提取液；在滤渣中加入蒸馏水，重复以上步骤2次，合并提取液；在合并后的提取液用纱布过滤杂质后，加入无水乙醇至提取液中乙醇的体积百分含量为75%，静置沉淀12小时，取上清，55°C旋转蒸发至恒重，获得辣木多糖8.9g。
[0059]效果对比试验:调整步骤￠)中的培养温度为25°C，其他操作步骤和参数条件不变，制得辣木多糖7.2g，与高温处理相比，低温处理的辣木多糖含量显著降低，这表明高温处理能够促进辣木多糖的合成。
[0060]按照本实施例步骤(7)同样的提取方法，从10g辣木叶中可获得辣木多糖5.9g。该结果表明本实施例生产的悬浮细胞，每0.66L悬浮细胞含有的辣木多糖相当于辣木叶粉10g含有的多糖，表明利用辣木悬浮培养细胞制备辣木多糖产量高。
[0061]实施例4
[0062](I)取辣木未成熟种子作为外植体，将辣木未成熟的豆荚切段，用0.1 %氯化萊消毒10分钟，用无菌水漂洗后，用无菌刀破开豆荚，用无菌镊子取出无菌种子，同时进一步剥离种子的种衣，制得辣木外植体；
[0063](2)将步骤⑴制备的辣木外植体接种至愈伤诱导培养基，每瓶培养基接种I?2粒辣木外植体，在温度28°C，光照强度2000LUX，每日光照时长为10小时条件下，培养35天后获得非胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织的直径平均为Icm ;其中愈伤诱导培养基的配方为:MS 培养基 + 红糖 40g/L+2，4-D lmg/L+NAA lmg/L+1.2% g/L 琼脂，pH 5.8 ；
[0064](3)将步骤(2)培养获得的直径约为Icm的非胚性愈伤组织转移至愈伤增殖培养基，接种量为0.25cm3/cm3愈伤增殖培养基，28°C条件下暗培养28天，制得生长迅速的疏松细胞团，直径大约为2?3cm ;其中愈伤增殖培养基的配方为:MS培养基+红糖20g/L+2，4-D3mg/L+0.8% g/L 琼脂，pH 5.8 ；
[0065](4)将步骤(3)制备的生长迅速的疏松细胞团5cm3，转移至含有75mL细胞悬浮启动培养基的150mL三角瓶中，25°C、130rpm回旋式震荡暗培养7天，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系；其中细胞悬浮培养启动培养基的配方为:MS培养基+红糖18g/L+2，4-D0.75mg/L，pH5.8 ;用该方法获得的细胞系生长迅速，每10天继代一次，增殖系数为6 ；
[0066](5)将步骤⑷制备的非胚性悬浮细胞系转移至50mL离心管中，100g离心5分钟，弃上清，取沉淀的细胞5mL，接种至含有40mL液体增殖培养基的10mL三角瓶中，25°C、130rpm回旋式震荡暗培养8天，制得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞；其中液体增殖培养基的配方为:MS培养基+红糖30g/L+2，4-D lmg/L, pH 6.0 ;用该方法获得的悬浮细胞生长周期为10天，继代周期为7?10天；
[0067](6)将步骤(5)制得的悬浮细胞接种至液体复合高糖增殖培养基中，在35°C，光照强度4000LUX，每日光照时长为12小时，150rpm回旋式震荡培养，培养时间为7天，制得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；其中液体复合高糖增殖培养基的配方为:MS培养基+ 红糖 55g/L+2，4-D 0.5mg/L，pH 5.58 ；
[0068](7)取步骤(6)制得的悬浮细胞IL加入蒸馏水，加蒸馏水的量为500ml，95°C加热提取80min，过滤保存提取液；在滤渣中加入蒸馏水，重复以上步骤2次，合并提取液；在合并后的提取液用纱布过滤杂质后，加入无水乙醇至提取液中乙醇的体积百分含量为75%，静置沉淀12小时，取上清，55°C旋转蒸发至恒重，获得辣木多糖8.9g。
[0069]效果对比试验:调整步骤(2)?(6)中的红糖为蔗糖，其他操作步骤和参数条件不变，制得辣木多糖7.3g，与红糖处理相比，蔗糖处理的辣木多糖含量显著降低，这表明红糖处理能够促进辣木多糖的合成。
[0070]按照本实施例步骤(7)同样的提取方法，从10g辣木叶中可获得辣木多糖5.9g。该结果表明本实施例生产的悬浮细胞，每0.66L悬浮细胞含有的辣木多糖相当于辣木叶粉10g含有的多糖，表明利用辣木悬浮培养细胞制备辣木多糖产量高。
【主权项】
1.一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步骤: (1)取辣木外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织； (2)将步骤(I)中获得的非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团； (3)将步骤(2)获得的细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系； (4)将步骤(3)获得的非胚性悬浮细胞系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得生长周期稳定、生长迅速的非胚性悬浮细胞系； (5)将步骤(4)获得的非胚性悬浮细胞系在液体复合高糖增殖培养基中悬浮培养3?7天，离心沉淀，获得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞； (6)取步骤(5)获得的非胚性悬浮细胞，水提取I?3次，合并提取液，在提取液中加入无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量为60?75%，取上清液，旋蒸至恒重，获得辣木粗多糖； 其中步骤(5)中所述的液体复合高糖增殖培养基的配方为:MS培养基+红糖35?55g/L+2，4-D 0.5 ?2mg/L，pH 5.5 ?6.0，培养温度为 30 ?35°C，光照强度 4000 ?6000Lux，每日光照时长为8?12小时，120?150rpm回旋式震荡培养，培养时间为3?7天。2.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的愈伤诱导培养基的配方为:MS培养基+红糖20?40g/L+2，4-DI?3mg/L+NAA 0.1?lmg/L+质量分数0.8?1.2%琼脂，pH为5.5?6.0，培养温度为24?28°C，光照强度2000?4000Lux，每日光照时长为8?12小时，培养时间为25?35天。3.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的愈伤增殖培养基的配方为:MS培养基+红糖20?40g/L+2，4-D3?4mg/L+质量分数0.8%琼脂，pH为5.5?6.0，培养温度为25?28°C，培养方式为暗培养，培养周期为28?35天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125?0.25cm3。4.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的细胞悬浮启动培养基的配方为:MS培养基+红糖18?22g/L+2，4-D0.25?lmg/L，pH为5.5?6.0 ;培养温度为24?27°C，培养方式为暗培养，120?150rpm回旋式震荡培养，培养周期为10天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10?1/20。5.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的液体增殖培养基的配方为:MS培养基+红糖25?35g/L+2，4-D0.5?2mg/L，pH 5.5?6.0，培养温度为24?27°C，暗培养，120?150rpm回旋式震荡培养，培养7?10天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10天，继代周期为7?10天，继代时接种量为液体增殖培养基体积的1/6?1/10。6.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤出)中水提取的温度为95?100°C，提取时间为40?80min。7.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤￠)中旋蒸温度为48?55°C。8.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的辣木外植体为未成熟的辣木种子。
【专利摘要】本发明涉及天然产物生物化学技术领域，具体公开一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法。该方法采用辣木非胚性细胞生产辣木多糖，获得的非胚性细胞，类型单一，细胞充分分散，增值效率极高，生长周期一致，产量易于调控；对辣木外植体进行诱导增殖培养获得悬浮细胞后，进一步的模拟辣木高温、高光照的自然生长环境，并优选液体复合高糖增殖培养基，选择高浓度的红糖代替蔗糖，培养过程中刺激辣木细胞合成辣木多糖，提高多糖产量。本发明方法可工厂化生产辣木多糖，不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源，和种植辣木相比(生产周期3～5年)，本发明方法生产周期缩短至7～10天，生产规模便于控制，投资风险小。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105123518
【申请号】CN201510543062
【发明人】蒋盛军, 张德旺
【申请人】海南木辣达生物科技有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月31日