所述性状的遗传决定因子的植株的子代或繁殖材料被用作源，以将所述性状基 因渗入另一菠菜植株。包含所述遗传决定因子的所述植株的代表性种子保藏于NCHMB，保藏 号为NCHMB41954、NCHMB41955 和NCHMB41956。
[0121] 本发明优选地提供具有本发明性状的菠菜植株，其中通过本文描述的和/或本领 域技术人员已知的任何方法可得到所述植株。
[0122] 本发明进一步提供一种选择具有红色叶的菠菜植株的方法，其中红色叶源自包含 红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜 叶表皮细胞，所述方法包括筛选植株中如本文所描述的红色叶的存在。
[0123] 而且，本发明涉及导致具有红色叶的菠菜植株的突变的基因，其中红色叶源自包 含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠 菜叶表皮细胞，其中所述突变的基因存在于植株基因组中，所述植株的代表性样品的保藏 号为NCHMB41954、NCHMB41955 和NCHMB41956。
[0124] 本发明还涉及使用形成红色叶的遗传决定因子的应用，其中红叶源自包含红色素 的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮 细胞，所述遗传决定因子用于产生带有红叶的植株，更具体地产生带有红叶的菠菜植株，所 述遗传决定因子存在于植株基因组中，所述植株的代表性样品的保藏号为NCHMB41954、 NCHMB41955 和NCHMB41956。
[0125] 根据其另一方面，本发明涉及具有红色叶的非天然生成的植株，其中红色叶源自 包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分 菠菜叶表皮细胞，该红色是植株基因组中存在遗传决定因子的结果，所述遗传决定因子存 在于植株基因组中，其代表性样品的保藏号为NCHMB41954、N(HMB41955和NCHMB41956。 所述非天然生成的植株具体地为突变体植株。
[0126] 本文中使用的术语"本发明的性状"被定义为导到本发明菠菜植株具有红色叶的 性状，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者 的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞。
[0128] 菠菜（SpinaciaoleraceaL.) 12. 3002、12. 3007 和 12. 3009 的种子包含生成具 有红色叶的植株的本发明遗传决定因子，其中在近轴叶面和/或远轴叶面的叶脉之间的 菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素，所述种子于2012年4月6日保藏在NCHMBLtd， FergusonBuilding，CraibstoneEstate，Bucksburn，AberdeenAB21 9YA，UK，保藏号为 NCHMB41954、NCHMB41955和NCHMB41956。这些保藏物的种子包含处于纯合状态的遗传
[0129] 保藏的种子不满足获得植物品种保护的DUS标准，因此不能被认为是植物品种。
【附图说明】
[0130] 在以下实施例中，将进一步说明本发明，所述实施例仅用于说明目的、而非意于限 制本发明的范围。在实施例中参考了下述附图：
[0131] 图1 :菠菜叶的图片和示意图。示出叶柄、叶片（也称为叶基）和叶的一级脉（也 称为中脉）、二级脉和三级脉。
[0132] 图2:A:携带纯合性遗传决定因子的本发明菠菜植株的图片和示意图。在本发明 植株的示意图中，阴影指示具有红色的植株的区域；虚线指示具有红色的叶脉。非虚线指示 非红色的叶脉。
[0133] B:携带杂合性遗传决定因子的本发明菠菜植株的图片和示意图。在示意图中，描 绘出完整植株的实例和所述植株的叶的一个实例。阴影指示具有红色的植株的区域；虚线 指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。
[0134] C:绿色菠菜品种（Squirrel)的图片和示意图。阴影指示具有红色植株的区域；虚 线指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。
[0135] D:带红叶柄和红色粗脉（红脉菠菜）的绿叶菠菜的图片和示意图。在示意图中描 绘出完整植株的实例和所述植株的叶的一个实例。阴影指示具有红色的植株的区域；虚线 指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。
[0136] 图3:A:本发明菠菜叶的近轴（上）侧的图片和示意图。矩形（b)指示叶脉间的 叶区域的实例，用于提取如图3C-F的图片中所示的表皮条。虚线（a)指示可提取的如图3G 和3H所示的不包括任何粗脉的叶横断面的实例。
[0137] B:本发明菠菜叶的远轴（下）侧的图片和示意图。矩形（b)指示叶脉间的叶区域 的实例，用于提取如图3C-F的图片中所示的表皮条。
[0138] C:携带纯合性遗传决定因子的本发明植株叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红 色和因此包含红色素的细胞。通过（2)指示这种细胞的实例。不包含红色素的表皮细胞的 实例用（3)指示。在表皮上存在气孔（1)，气孔细胞（也称为保卫细胞）不具有红色。
[0139] D:携带杂合性遗传决定因子的本发明植株叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红 色和因此包含红色素的细胞。通过（2)指示这种细胞的实例。不包含红色素的表皮细胞的 实例用（3)指示。在表皮上存在气孔（1)，气孔细胞（也称为保卫细胞）不具有红色。
[0140] E:绿色菠菜植株叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红色和因此包含红色素的细 胞。在该情况下，表皮条中没有细胞具有红色。不包含红色素的表皮细胞的实例用（3)指 示。在表皮上存在气孔（1)，气孔细胞（也称为保卫细胞）不具有红色。
[0141] F:带有红叶柄和红色粗脉（红脉菠菜）的绿叶植株的叶脉之间区域的表皮。阴影 指示具有红色和因此包含红色素的细胞。在该情况下，表皮条总没有细胞具有红色。不包 含红色素的表皮细胞的实例用（3)指示。在表皮上存在气孔（1)，气孔细胞（也称为保卫细 胞）不具有红色。
[0142] G:本发明植株叶的横断面的图片和示意图。示意图中的阴影指示具有红色和因此 包含红色素的细胞。
[0143] H:本发明植株叶的横断面的图片和示意图。在该横断面中，仅可见一层表皮细胞 和几层叶肉细胞。示意图中的阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。 实施例
[0144] 实施例1
[0145] 本发明植株的培育
[0146] 以如下方式得到本发明的菠菜植株：对带有叶柄红色和红色粗脉的绿叶Rijk Zwaan菠菜繁殖种群的种子进行EMS处理。经EMS处理后的这些种子被播种和培育以用于 大规模种子生产。在Fijnaart(费纳特）的RijkZwaan田地上播种得到的种子和培育植 株以对叶的红色进行表型选择。进一步轮次的自交和选择得到菠菜（Spinaciaoleracea L. ) 12. 3002、12. 3007和12. 3009的种子，其包含本发明的遗传决定因子。这些种子于 2012年 4月 6 日保藏在NCIMBLtd，FergusonBuilding，CraibstoneEstate，Bucksburn， AberdeenAB21 9YA，UK，保藏号为NCHMB41954、NCHMB41955 和NCHMB41956。这些保藏 物的种子包括处于纯合状态的遗传决定因子。
[0147] 实施例2
[0148] 本发明植株的表型特征
[0149] 在温室或田间的正常生长条件下培育时和在头两片植株叶完全长成时，通过红色 叶柄和叶的红色着色（参见图2A)容易识别携带纯合状态的遗传决定因子的本发明的植 株。使用RHS比色表（英国皇家园艺学会，伦敦，英国）对红色着色进行评分。携带纯合状 态遗传决定因子的本发明植株叶片的上面（近轴面）和下面（远轴面）均具有紫红色（见 图3A+B)，其被评分为187A、N186C或在一些情况下为N186B，均在灰紫色（greyed-purple) 组。
[0150] 在还被称为中脉或中肋的一级脉上的叶柄颜色和表皮层颜色通常比叶片其余部 分的颜色浅。在叶的远轴面，二级脉通常也标志在于比叶片其余部分较浅的颜色。携带纯 合状态的遗传决定因子的本发明的植株的叶柄颜色被评分为187B、187C、187D或N186D，均 在灰紫色组。在叶片的一级脉上，颜色被评分为187A、187B、187C、187D、N186C或N186D，而 叶远轴面的二级脉的颜色被评分为187A、187B、187C或187D，均在灰紫色组。
[0151] 以杂合状态携带本发明遗传决定因子的植株具有红色叶柄和绿色叶片，带有红色 一级脉和二级脉，且在这些叶脉之间的叶近轴面的叶区域上有额外的微红色（见图2B)。
[0152] 在以杂合状态携带本发明遗传决定因子的植株中，呈现红色叶的百分比因遗传背 景不同而不同，但是在相同或相似培育环境下，总是高于未携带本发明遗传决定因子的红 脉菠菜植株。
[0153] 在以杂合状态携带本发明遗传决定因子的一些植株中，红色可被更多地限制在接 近叶的粗脉的区域，而在其它以杂合状态携带本发明遗传决定因子的植株中，红色素可呈 现在几乎整个叶片的叶表皮细胞中。
[0154] 在取下以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株叶的横断面时，清楚的是，形 成红叶的红色素主要位于叶的表皮层（见图3H)，既在叶的近轴侧也在叶的远轴侧（见图 3G)。在与不包含本发明遗传决定因子的植株相比较时，在最外1至3层的细胞层下面含叶 绿素（具有绿色）的叶肉不受影响（见图3H)。
[0155] 在利用新鲜叶组织（S卩，不固定或嵌入）形成叶横断面时，红色素可从受损细胞泄 漏出来，还使得自身不包含红色素的细胞显出红色。
[0156] 另外，通过检验至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间菠菜叶表 皮细胞是否是红色来分析本发明的植株。
[0157] 在近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间取下例如0. 15X0. 2cm的表皮条。首先沿条的 3个侧面取下表皮。沿剩余侧面将镊子的一个细点插入表皮和叶肉之间。然后表皮被抓取 且慢慢地从叶肉剥离。然后将条传送到其中带有水滴的显微镜载玻片，且覆盖盖玻片。之 后在透射光显微镜下观察表皮条细胞的颜色。
[0158] 为了避免混淆，提取所述表皮条是重要的，以对良好地从红色叶脉移除的叶片区 域进行分析。
[0159] 在提取和检验时，必须小心处理这些表皮条以不损坏和刺破任何表皮细胞，否则 红色素会从细胞泄漏且表皮中含有红色素的细胞百分比被低估。
[0160] 在以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株中，大约90-100%表皮细胞（不包 括组成气孔的保卫细胞）在表皮带上具有鲜艳的粉红色，因此包含红色素（见图3C)。在以 杂合状态携带遗传决定因子的本发明植株中，表皮条中18-67%的表皮细胞具有红色/粉 色（见图3D)，百分比取决于提取的表皮条与叶脉接近程度。
[0161] 提取于带有绿叶的菠菜植株（见图3E)和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶菠菜植 株二者的近轴叶面或远轴叶面的叶脉之间的表皮条细胞无一具有粉红色，其中红色被限制 在（红脉菠菜）粗脉之上的叶柄和表皮（见图3F)。因此，在采用这种方法可量化的程度 上，这些细胞无一显示可检测水平的P花青苷。
[0162] 实施例3
[0163] 本发明植株的生化分析
[0164] 分析本发明植株的叶绿素和P花青苷含量，并与绿色菠菜植株和带有红色叶柄 和红色粗脉的绿叶菠菜植株相比较，其中红色被限制在粗脉之上的叶柄和表皮（红脉菠 菜，见图2D)。在2011-2012年的冬天的Fijnaart(费纳特）未加热的温室的土壤中培育所 有植株。用生物化学方法测量叶绿素和P花青苷水平。
[0165]以653nm和667nm吸光度测量总叶绿素（叶绿素a和b)，同时以537nm吸光度测 量P花青苷。对于每个菠菜品种，在叶成熟阶段收获大约200克鲜重的菠菜植株地上部分 以作为代表性样品。对于每行菠菜，分别采用5-10株两个样品以作为重复。
[0166] 将样品放入塑料袋并于小于-80°C立即冷却。用手粉碎冷冻的样品。然后根据 需要