使用存在尽可能少的液氮的自由浮动盖将所述粉碎的叶材料在Grindomix中研磨 (Retsch，5" 3000rpm然后5" 5000rpm)，以得到粉末。然后将该粉末传送到管中，将管用 液氮冷却并在小于_70°C的温度下存储，直到进一步分析。
[0167] 对于叶绿素测量，将1克粉末（指定的准确质量）分别传送到两个60ml烧瓶中。 立即将50ml100%的甲醇添加到两个烧瓶中。指定使用体积（ml)。用UltraTurrax勾衆 样品溶液1分钟并在超声浴中在'脱气设置'下超声浴5分钟。将一部分溶液置于I. 5ml微 量离心管中并在4°C下以13000rpm的速率离心处理4分钟。测量出360-900nm的谱和测定 653nm和667nm处的吸光度（如果需要，在用提取液稀释之后）。使用下式计算总叶绿素的 量：
[0168] 总叶绿素=25. 5 *A635+4 *A667 (yg/ml甲醇提取物）
[0169] 带有用于稀释的补偿并转换成yg/g样品鲜重。用于计算总叶绿素水平的式取 自GoodwinT.W. (1976年；植物色素的化学和生物化学，笫2卷，第18章，通过引用并入本 文）。
[0170] 对于P花青苷测量，将10克粉末（指定的准确质量）分别传送到两个50ml管 中。将4到5倍样品体积量的磷酸钾缓冲液（250mM，pH= 5)添加到两个管中。指定使用 缓冲液的质量（g)。将样品溶液在超声浴中在'脱气设置'下超声处理5分钟。将一部分溶 液置于12ml管中，用于可能的再分析。将一部分溶液传送入I. 5ml微量离心管中并在4°C 以13000rpm离心4分钟。测量400-800nm的谱，并测定537nm处的吸光度（如果需要，在 用提取液稀释之后）。
[0171] 用使用在磷酸钾缓冲液（250mM，pH= 5)中的甜菜苷的消光系数的公式计算花 青苷的量。因此用yg甜菜苷当量/g鲜重（FW)给出0花青苷含量。
[0172] 甜菜苷当量（yg/g鲜重）=
[0173] (10 *A537 *稀释* (缓冲液质量+液体部分样品质量））/
[0174] (LI5"* 样品质量）
[0175] 其中1. 1599为使用的磷酸钾缓冲液（250mM，pH= 5)中lmg/100ml甜菜苷溶液的 A537，通过样品质量（=IOg)乘以（1-(干物质/100的百分比））计算样品的液体部分的质 量。
[0176] 表 1
[0177] 测量本发明植株、绿色菠菜植株和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶菠菜植株的叶 绿素和0花青苷，其中红色被限制在粗脉之上的叶柄和表皮。在2011-2012年冬天的荷 兰Fijnaart(费纳特）未加热的温室的土壤中培育所有植株。Squirrel是一种绿色Rijk Zwaan菠菜品种。RijkZwaan红脉菠菜行具有的绿叶植株带有红色叶柄和红色粗脉，其中 红色被限制在粗脉上的叶柄和表皮。行12. 30002、12. 30007和12. 30009的本发明植株的 群体从保藏的种子培育并仅含有以纯合状态携带遗传决定因子的植株。P花青苷和叶绿素 含量的给定平均值为每5-10株的每植株行的两个生物重复的平均值。
[0178]
[0179] 从表1清楚的是，以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株的P花青苷水平 (每克鲜重甜菜苷当量）显著高于带绿色叶柄的绿叶的WT菠菜植株（大约高100倍）并显 著高于带红色叶柄和红色粗脉的绿叶WT菠菜植株，其中红色被限制于粗脉之上的叶柄和 表皮（大约高100倍）。
[0180] 有趣的是，在与WT绿色菠菜和WT红脉菠菜相比较时，以纯合状态携带遗传决定因 子的本发明植株的叶绿素水平未改变（见表1)。
[0181] 由于所有不同行（Squirrel、RZ红脉菠菜行和三行以纯合状态携带遗传决定因子 的本发明植株）的叶绿素水平很相近而P花青苷水平差别相当大，纯合状态携带遗传决定 因子的本发明植株与两行WT菠菜行的总叶绿素（iig/g鲜重）与P花青苷（yg甜菜苷当 量/g鲜重）之比也明显不同（见表1)。
[0182] 实施例4
[0183] 本发明性状向其他菠菜植株的转移
[0184] 用以纯合状态包含遗传决定因子的菠菜植株与未携带本发明性状的几种不同 野生型（WT)菠菜植株相杂交，其中所述遗传决定因子形成具有红叶的植株，如以保藏号 NCHMB41954、N(HMB41955和NCHMB41956进行保藏的代表性种子（此处称为供体）中所 发现。
[0185] 在菠菜杂交中，发生自我授粉的情况并不少见。为了能轻易检测到自花授粉的偶 发事件，将供体亲本在这些杂交中用作传粉者或父本。如果假设从WT母本收获的种子种植 的Fl植株具有非常相似于WT母本的表型，以及通过那些假设的Fl植株自我授粉得到的F2 植株也看起来像初始WT母本植株，那么可以推断，那些植株来自于WT母本的自我授粉并可 将它们丢弃。
[0186] 出乎意料地，从该杂交得到的Fl植株具有的叶着色表型介于WT亲本的表型和以 纯合状态包含造成植株具有红色叶的遗传决定因子（供体亲本）的菠菜植株之间。这表明 本发明性状为半显性遗传。这些Fl植株在这些叶脉之间叶区域上的近轴叶面上具有带红 色一级脉和二级脉以及额外的红着色的红色叶柄和叶片（见图2B)。从具有绿色叶和叶柄 的WT亲本杂交得到的Fl植株以及从具有红色叶柄和红色主叶脉的绿叶WT亲本杂交得到 的Fl植株皆是这种情况，其中红色被限制在粗脉之上的叶柄和表皮。
[0187] 可引入本发明性状的WT菠菜植株可为任何叶型、任何形式或着色的菠菜植株。
[0188] 随后，这些Fl代植株自我授粉，并获得F2代植株。以继承本发明性状的相应的单 基因半显性（还被称为不完全显性）的方式分离不同的F2。F2中的结果大约为：带有WT 亲本叶着色的一株；带有供体亲本红叶着色的一株；带有中间表型的两株，其具有红色叶 柄的绿叶，带有红色一级脉和二级脉的叶片，且在这些叶脉之间的叶面区域上的近轴叶面 上带有额外的微红色（见表2和图2)。
[0189] 表 2
[0190] 分离用带有不同WT绿色菠菜亲本（绿色）的供体亲本（父本）杂交的3个F2群 体中的和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶的不同亲本菠菜植株的供体亲本（父本）杂交的 3个F2群体中的本发明性状，其中红色被限制在粗脉（红色叶脉）之上的叶柄和表皮。
[0191]
[0192] 卡方检验证实：观察到的具有WT亲本表型（绿色或红色的叶脉）、供体亲本表型 (红色）和中间表型（微红）的F2代植株的数量与如果性状以半显性方式分离所期望的情 况相符，即I:I: 2(WT亲本表型：供体亲本表型：中间表型）。在所有这些群体中的卡方 概率值大于〇. 05。根据表2中的分离数据，可由此得出结论，本发明的遗传决定因子表现为 单基因半显性性状。
【主权项】
1. 菠菜植株（Spinaciaoleracea)，其包含使植株具有红色叶的遗传决定因子，其中在 至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞 包含红色素，所述遗传决定因子包含于菠菜植株中，其代表性种子保藏在NQMB，保藏号为 NCHMB41954、NCHMB41955 和NCHMB41956。2. 根据要求1所述的菠菜植株，其中所述遗传决定因子是纯合性存在的。3.根据要求1所述的菠菜植株，其中在收获期的叶的P花青苷含量以优先级增加的顺 序至少为55 y g甜菜苷当量/g鲜重、60 y g甜菜苷当量/g鲜重、70 y g甜菜苷当量/g鲜重、 80 y g甜菜苷当量/g鲜重、90 y g甜菜苷当量/g鲜重、100 y g甜菜苷当量/g鲜重、110 y g 甜菜苷当量/g鲜重、120 y g甜菜苷当量/g鲜重、130 y g甜菜苷当量/g鲜重、140 y g甜菜 苷当量/g鲜重、150 y g甜菜苷当量/g鲜重、160 y g甜菜苷当量/g鲜重、170 y g甜菜苷当 量/g鲜重、180 y g甜菜苷当量/g鲜重、190 y g甜菜苷当量/g鲜重、200 y g甜菜苷当量/g 鲜重、210 y g甜菜苷当量/g鲜重、220 y g甜菜苷当量/g鲜重、230 y g甜菜苷当量/g鲜重、 240 y g甜菜苷当量/g鲜重、250 y g甜菜苷当量/g鲜重、300 y g甜菜苷当量/g鲜重、350 y g 甜菜苷当量/g鲜重、400 y g甜菜苷当量/g鲜重、450 y g甜菜苷当量/g鲜重、500 y g甜菜 苷当量/g鲜重、550 y g甜菜苷当量/g鲜重、600 y g甜菜苷当量/g鲜重。4. 根据权利要求1-3任一项所述的菠菜植株，其可通过使第一菠菜植株与第二菠菜 植株杂交获得，其中至少一种所述植株包含遗传决定因子，遗传决定因子被包含在菠菜植 株中，所述菠菜植株的代表性种子保藏于NCHMB，保藏号为NCHMB41954、NCHMB41955和 NQMB41956,或携带所述遗传决定因子的其子代植株，以及选择、优选地在F2代中选择具 有红色叶的植株，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的 至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素。5. 根据权利要求1-4任一项所述的菠菜植株的种子，其中所述种子包含以下种子中 存在的遗传决定因子，所述种子的代表性样品保藏于NCHMB，保藏号为NCHMB41954、NCHMB 41955 和NCHMB41956。6. 根据权利要求1-4任一项所述的菠菜植株或根据权利要求5所述的菠菜种子的子代 植株，其中所述植株包含以下种子中存在的遗传决定因子，所述种子的代表性样品保藏于 NCHMB，保藏号为NCHMB41954、NCHMB41955 和NCHMB41956。7. 根据权利要求6所述的子代植株，其中所述遗传决定因子是纯合性存在的。8. 来源于根据权利要求1-4和6-7任一项所述的植株或根据权利要求5所述的种子的 繁殖材料，其中所述繁殖材料包含以下种子中存在的遗传决定因子，所述种子的代表性样 品保藏于NCHMB，保藏号为NCHMB41954、NCHMB41955 和NCHMB41956。9. 繁殖材料，其能够生长成如权利要求1-4任一项所述的植株。10. 根据权利要求8或9所述的繁殖材料，其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、 胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、莖、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生 质体、愈伤组织、和细胞。11. 根据权利要求8-10任一项所述的繁殖材料的组织培养物。12. 根据权利要求1-4和6-7任一项所述的植株的菠菜叶，其带有红色，其中在至少近 轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红 色素。13. 食品，其包含权利要求12的菠菜叶、或其部分，其任选地处于经加工的形式。14. 根据权利要求1-4和6-7任一项所述的植株、或产生自权利要求5所述种子的植 株、或来自权利要求8-10任一项所述繁殖材料的植株的应用，其作为育种程序中的种质资 源用于开发具有红色叶的菠菜植株，其中所述叶的红色源自包含红色素的在至少近轴叶 面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶的表皮细胞。15. 容器，其包括在生长基质中的如权利要求1-4和7-8任一项所述的一种或多种菠菜 植株，所述容器用于在居室环境中收获来自所述菠菜植株的叶。
【专利摘要】本发明涉及一种菠菜植株(Spinacia？oleracea)，其包含使植株具有红色叶的遗传决定因子，其中可从包括所述遗传决定因子的菠菜植株得到遗传决定因子，其代表性种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB？41954、NCIMB？41955和NCIMB？41956。NCIMB 4195420120406
【IPC分类】A61K36/21, A01H5/12
【公开号】CN105208853
【申请号】CN201480015521
【发明人】J·H·登布拉贝尔
【申请人】瑞克斯旺种苗集团公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】EP2966994A1, WO2014140209A1