基酸，这些非必须氨基酸中的半必需氨基酸，在有补充的情况下，可以降低细胞 自身对必须氨基酸的代谢压力。
[0021] 进一步在上述实施方式的基础上，在用作能源底物的丙酮酸钠的基础上，还可以 辅助搭配乳酸钠，控制添加浓度为0. 2~0. 8mmol/L。乳酸钠可以辅助完善细胞的基本营养 成分。
[0022] 本发明在上述骨髓间充质干细胞保存液的基础上，进一步还提出将该骨髓间充质 干细胞保存液进行骨髓间充质干细胞保存的应用。采用本发明的保存液进行保存的过程 中，使骨髓间充质干细胞维持在比较稳定的代谢状态，且能尽量降低或者减缓在保存过程 中出现的细胞损伤的程度，并且能抑制低水平代谢容易引发的休眠和凋亡的倾向，最终在 保存之后能得到活性更好的细胞。
[0023] 为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解 和实施参考，同时凸显出本发明骨髓间充质干细胞保存液的性能和品质，以下通过具体的 实施例进行举例说明。
[0024] 实施例1
[0025] 在实施之前，按照下述物质成分获取各物料，用注射用水配置成5L保存液备用， 同时各物料成分的浓度按照如下进行：2mmol/L的L-谷氨酰胺、0. lmmol/L的酪氨酸、 30mmol/L的HEPES、0. 8mmol/L丙酮酸钠、0. 3mmol/L的乳酸钠、100mg/L硫酸庆大霉素制成 基础液；然后向基础液中按照终浓度2WT%肝素、1WT%透明质酸和2WT%海藻糖的加入肝 素、透明质酸和海藻糖，充分溶解后定容至5L，冰箱保存备用。
[0026] S10,获取骨髓间充质干细胞：
[0027] 取人髋关节手术或下肢骨开放性手术时收集用于原代MSCs分离和培养的骨髓标 本，肝素抗凝；
[0028] 每份骨髓标本按1:2的比例加在密度为1. 073g/ml的percoll分离液上2300rpm 离心30min，取中层单核细胞，加入消毒PBS缓冲液，lOOOrpm离心10min，洗涤3次，弃上清 液后得到的细胞即为MSCs。
[0029] 所得MSCs在光学显微镜下计数，调整至1 X107/培养瓶（25ml)密度用于细胞原 代培养，培养的方式采用血清培养体系培养，具体培养基为含10%胎牛血清、氢化可的松 (106mol/L)、青霉素（100U/ml)及链霉素（100mg/ml)的低糖 DMEM(L-DMEM)。
[0030] S20, MSCs传代与体外扩增：
[0031 ] 当步骤S10的细胞生长到几乎完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2~3次， 倾去PBS液，加入0. 25 %的胰蛋白酶（内含0. 02 % EDTA)，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆 盖瓶底的细胞为准。
[0032] 将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含10% 胎牛血清的低糖DMEM培养终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全 脱壁后，按1:2~1:3比例传代接种于25ml培养瓶（培养基与步骤S10采用相同），放置于 37°C、5% C02、95%湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代； 每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
[0033] S30,将步骤S20的细胞培养至P3代完成时，获取P3代的骨髓间充质干细胞用于 保存试验：用0. 25%胰酶消化后，细胞悬液进行细胞计数，约1 X 106个/ml，以每孔1 X 10 4个接种于96孔培养板中，于C02培养箱37°C静置培养30h后，吸取剩余培养液后，用相应保 存液洗涤2遍后加入3ml现有保存液（0. 9WT%氯化钠注射液、5WT%葡萄糖注射液、复方电 解质注射液（Plasmalyte A)、1WT%人血白蛋白溶液或5WT%人血白蛋白溶液作为对照）及 本发明保存液，各组设3个相同复孔；换液后于4°C放置5h后进行活性评价。
[0034] 上述步骤S30用不同的保存液保存之后的细胞的活性评价的方式中，首先检测保 存之后的细胞存活率，方法采用台盼蓝染色法检测：
[0035] 将用不同保存液（即现有的几种保存液和）保存后的MSCs经过对应保存时间点 离心，lOOOrpm、5min弃去上清；PBS重悬细胞沉淀，充分混勾，取18 μ 1细胞悬液与2 μ 1的 0. 4%苔盼蓝染液充分混匀；取适量悬液滴加到血球计数板计数腔内，加盖玻片，显微镜下 观察；分别计数活细胞与死细胞，计数过程在3min内完成，未着色的细胞为活细胞，染成蓝 色的细胞为死细胞。
[0036] 细胞存活率（％ )=活细胞数/总细胞数X 100 %。
[0038] 从上表的各种保存液保存5h后的细胞存活率的计算结果，可以看出，除了复方电 解质注射液存活率稍低之外，其他的几种保存之后细胞存活率相差的不大，虽然本发明的 存活率稍高一些，但是幅度差异却并不非常大。一方面原因是因为时间比较短，保存的时间 为5h，还无法有非常大的体现的效果。所以在上述基础上，延长保存时间至10h后再次进行 上述细胞存活率的检测，其结果如下：
[0040] 从上表的结果可以看出，延长保存时间之后可以体现出各保存液的优劣，首先常 规的人白蛋白溶液是稍微均衡的细胞生命物质，所以比其他的基中保存液的保存后的细胞 存活率高，本发明中营养更加均衡，在长时间保存后还能具有较高的存活率80%左右。
[0041] 在上述基础存活率检测的基础上，继续进一步进行细胞贴壁率测定，骨髓间充干 细胞是一种贴壁型细胞，其存活的一项指标就是细胞能够贴壁、增殖，因此骨髓间充干贴 壁性能的差异即反映了细胞活力的差异；检测贴壁率用来反映其存活细胞的细胞表型变化 程度和细胞的活性能力：
[0042] 将上述培养的P3代细胞消化后用PBS制成细胞悬液，以2X 106/组保存在相应 保存介质与保存温度下；按时间点保存4h结束后，离心1000rpm、5min，弃上清；用正常完 全培养基轻轻漂洗细胞一次；再用完全培养基重悬细胞，每组以2X 104/孔接种于24孔板 中，放置于细胞培养箱中培养24h ;待细胞贴壁后，微量移液器移除培养液，用PBS轻轻漂 洗2次，去除未贴壁细胞；70%乙醇固定20min后PBS轻轻漂洗1~2次；结晶紫染液染色 15min (100 μ 1，没过孔板底部）；去离子水轻轻漂洗2~3次，尽可能去除背景颜色；置于显 微镜下观察、计数、拍照；细胞贴壁率=已贴壁细胞总数/接种细胞数X 100%。
[004^-从上述保存4h后的细胞贴壁率的结构对比可以看出，虽然没有重复延长保存时 间至10h等更长，但这一贴壁率的对比已经比较明显，在现有的常规的保存液中，复方电解 质注射液相比对细胞的损伤或者引起其细胞表型改变的情况少一些，而，其他的几种现有 的保存液相比对细胞的损伤或者引起其细胞表型改变的情况可能更大一些，且这些现有的 常规保存液保存的细胞与本发明的保存液保存的细胞相比，应当是贴壁能力弱化至半贴壁 程度，所以结构的差异在这一方面即可体现。说明本发明的保存液在维持细胞的活性、防止 细胞凋亡和转向休眠的问题上有明显的优势。
[0045] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，该骨髓间充质干细胞保存液为含有 1. 5~3WT%肝素、0. 5~I. 5WT%透明质酸和1~3WT%海藻糖的基础液； 其中，所述基础液为含有1. 5~2. 5mmol/L的L-谷氨酰胺、20~30mmol/L的HEPES、 0. 6~I. 4mmol/L的丙酮酸钠以及90~110mg/L的硫酸庆大霉素的水溶液。2. 如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，所述基础液中还包括 0? 2~0? 8mmol/L的乳酸钠。3. 如权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，所述基础液中还包 括有0. 08~0. 12mmol/L的非必需氨基酸。4. 如权利要求3所述的骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，所述非必需氨基酸为 半胱氨酸和/或酪氨酸。5. 如权利要求1至4任一项所述的骨髓间充质干细胞保存液在骨髓间充质干细胞保存 中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种骨髓间充质干细胞保存液，该骨髓间充质干细胞保存液为含有1.5～3WT％肝素、0.5～1.5WT％透明质酸和1～3WT％海藻糖的基础液；其中，基础液为包括1.5～2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、20～30mmol/L的HEPES、0.6～1.4mmol/L的丙酮酸钠以及90～110mg/L的硫酸庆大霉素的水溶液。采用本发明的保存液进行保存的过程中，使骨髓间充质干细胞维持在比较稳定的代谢状态，且能尽量降低或者减缓在保存过程中出现的细胞损伤的程度，并且能抑制低水平代谢容易引发的休眠和凋亡的倾向，最终在保存之后能得到活性更好的细胞。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105230604
【申请号】CN201510601214
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳华毓造血干细胞研究有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年9月21日