病原菌组中分离出来。除harp inEa外，以下的harp in或类 harpin的蛋白质已被分离并被表征：菊欧氏杆菌的HrpN、软腐欧氏杆菌(Wei等/Harpin， Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora/7Science 257:85(1992))和玉米枯萎欧氏杆菌、丁香假单胞杆菌的 HrpZ(He et al·/'Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants/Cell 73:1255(1993))、青枯雷尔氏菌的PopA(Arlat等，"PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes ?Is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum，〃EMB0 J.13:543-53 (1994))和梨火疫病欧文氏菌的HrpW(Kim等，〃HrpW of Erwinia amylovora，a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，" J.Bacteriol. 180:5203-10( 1998))和丁香假单胞杆菌。
[0010]类harpin的蛋白质有共同的特性。它们是热稳定的具有不多于一个半胱氨酸残基 (更典型地，没有半胱氨酸残基)的富含甘氨酸的蛋白质，对蛋白酶消化敏感，以及诱发HR并 诱导许多植物对多种疾病的抗性。基于它们共有的生物化学、生物物理学特性以及生物学 功能，这些来自不同病原菌的HR诱导子属于harpin蛋白系列^这些共有的特性和它们在大 范围的植物中诱导HR的能力使harpin蛋白系列区别于其它的宿主特异性蛋白酶HR，如来自 疫霉菌的激发素（Bonnet等，〃Acquired Resistance Triggered by Elicitors in Tobacco and Other Plants，〃Eur.J.Plant Path 102:181_92(1996);Keller等〃 Physiological and Molecular Characteristics of Elicitin-induced Systemic Acquired Resistance in Tobacco，〃Plant Physiol .110:365-76(1996))和来自黄枝抱菌 的非病原性蛋白（如Avr9)，这些仅能激发特定种属植物中的HR。
[0011] 本质上，当发生某些细菌感染时，harpin蛋白被表达，然后被细菌分泌，给植物发 信号对感染发动抵抗。Harpin充当信号以激活植物的防御反应及其它生理系统，包括SAR、 生长增强和对某些虫害的抗性。
[0012] 迄今为止，harpin产品及其在农业和园艺中的用途一直是作为涂在淀粉上的粉状 固体。由于粉状harpin蛋白在水中的悬浮液体在发生明显降解和失活前仅有48-72小时的 有效使用寿命，这就限制了 harpin蛋白的使用和多用性。
[0013] 本发明涉及克服现有技术中的这些以及其它的局限性。
【发明内容】
[0014] 本发明的一个方面涉及制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法。本方 法包括获得基本上没有细胞碎肩且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。将杀生剂和任选 蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者引入该液体提取物，由此得到包含harpin 蛋白或多肽的液体组合物，其保持harpin活性至少约72小时。
[0015]本发明的另一方面涉及组合物，所述组合物包含水基载体、harpin蛋白或多肽、有 效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂或非离子表面活性剂之一或这两者。该组合物 保持harp i η活性至少约7 2小时。
[0016] 本发明的再一方面涉及诱导植物反应的方法。本方法包括对植物或植物种子施加 本发明的组合物。在能有效地诱导植物反应的条件下实施对植物或植物种子施加本发明的 组合物。
[0017] 本发明涉及制备harpin蛋白或多肽的稳定液体制剂的新方法。如在所附的实例中 所示，已经制备了在数月时间内能保持显著的过敏反应诱导活性的稳定制剂。因为不再需 要进行大量处理以制备粉状的含harpin制剂，在制造和销售含harpin的产品中，延长液体 harpin制剂的保存期限的能力非常重要。这导致了若干优点或好处，包括(i)通过排除了粉 末载体材料以及当前在生产粉末制剂中使用的干燥工艺而节约了成本；（ii)避免了对使用 者的粉尘危害；（iii)液体制剂更容易使用，因为它能容易地用水稀释和与其它液体(待施 用的其它农用化学品）混合，而粉末制剂需监视其溶解；（iv)因为与称量正确量的粉末制剂 相比，液体制剂更容易配制适量的体积，所以液体制剂能更精确地配制;和(V)液体制剂具 有与其它农用化学品一起作为技术级材料用于制剂的潜力。
【具体实施方式】
[0018] 本发明的一个方面涉及制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法。本方 法包括获得基本上没有细胞碎肩且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。将杀生剂和任选 蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者引入该液体提取物，由此得到包含harpin 蛋白或多肽的液体组合物，其保持harpin活性至少约72小时。
[0019] 用在本文中的术语"harpin蛋白或多肽"是指现有技术中公认类别的蛋白质中的 任何一员，所述蛋白质由植物细菌产生，并共有结构特性及诱导植物过敏反应的能力。在生 物化学中，这些蛋白质或多肽具有若干共同的结构特性。这些共同的结构特性包括富含甘 氨酸、对热稳定、亲水、无 N-末端信号序列和易发生蛋白水解。参见Bonas/Bacterial Home Goal by Harpins，〃Trends Microbiol·2:1_2(1994);Gopalan等"Bacterial Genes Involved in the Elicitation of Hypersensitive Response and Pathogenesis Plant Disease 80:604-10(1996);和Alfano等〃The Type III Hrp)Secretion Pathway of Plant Pathogenic Bacteria：Trafficking Harpins,Avr Proteins,and Death/7 Journal of Bacteriology 179:5655-5662(1997)，据此将上述每个的内容均以引用的方 式全文并入。此外，harpin共有与其独特的生物活性相关的独特二级结构。该结构具有两种 主要的组分，α螺旋单元和具有片状或随机转角结构的松弛酸性单元。当缺乏上述一种或两 种组分时，过敏反应诱导不会发生。参见Fan等PCT Publ.No.WO 01/98501，该文以全文引用 的方式并入。
[0020] harpin蛋白还共有能诱导特定植物反应的能力（即，在处理植物和生长出该植物 的植物种子之后）。诱导植物抗病性、植物生长、抗虫性、抗脱水性以及收获后抗病性(在诸 如水果和蔬菜的收获后的植物产品中）是其中的一些较重要的用途。harpin蛋白的这些用 途描述于以下专利中：授予Qiu等的美国专利第6,277,814号、授予Wei等的美国专利第5， 776,889号、授予Zitter等的美国专利第5,977,060号、授予Qiu等的美国专利第6,235,974 号、Wei等的美国专利申请第2003/0104979号、Wei等的美国专利申请第2002/0019337号以 及美国专利申请第2004/0265442号，以上每项专利以全文引用的方式并入。这些反应的诱 导的原因是茉莉酸/乙烯和水杨酸防御途径的上调以及调节光和作用和营养摄入的植物生 长途径。
[0021] 一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)梨火疫病欧文氏菌HrpN的同源物，其包括 那些来自欧文菌属、泛菌属和果胶杆菌属的种属。这种同源物的例子包括在以下确定的那 些harpin蛋白：Genbank Accession Nos.AAC31644(梨火疫病欧文氏菌）；AAQ21220、 AAQ17045、CAE25423、CAE25424、CAE25425和CAF74881(亚洲梨火疫病菌）；CAC20124、 Q47278、Q47279 和 AAY17519(菊欧氏杆）；CAE25422(欧文菌株 JP557);AAG01466(玉米细菌性 枯萎病菌）；AAF76342(成团泛菌）；ABZ05760、ABI15988、ABI15989、ABI15990、ABI15991、 ABI15992、ABI15996、ABK80762、ABD04037、ABI15994、ABD04035、ABD04036、AAY17521、 △八父38231、48115995、44〇73910和041^69276(细菌性软腐病菌） ；￥?_050198、44520361和 CAE45I80(Pseudomonas atrosepticum);和ABD22989(Pseudomonas betavasculorum);上 述菌属以全部引用的方式并入本文。
[0022]另一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)梨火疫病欧文氏菌HrpW和丁香假单胞 菌的同源物，其包括选自以下种属的那些菌属:欧文菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、噬酸菌 属和果胶杆菌属。这种同源物的例子包括在以下确定的那些harp in蛋白：Genbank Accession Nos .U94513、CAA74158、AAC04849和AAF63402(梨火疫病欧文氏菌）；AAQ17046 (亚洲梨火疫病菌）；YP_001906489(欧文氏菌）；YP_050207(细菌性软腐病菌atrosepticum 亚种）；AF037983(菌性斑点病菌）；AA050075(菜豆晕疫病菌）；AAL84244(十字花科蔬菜黑斑 病假单胞菌）；AAX58537、AAX58557、AAX58525、AAX58531、AAX58527、AAX58577、AAX58491、 AAX58515、AAX58517、AAX58523、AAX58583、AAX58451、AAX58561、AAX58453、AAX58541、 AAX58589、AAT96311、AAX58497、AAX58579、AAX58449、AAX58485、AAX58563、AAX58581、 AAX58575、AAX58569、AAX58567、AAX58505、AAX58591、AAX58503、AAX58507、AAX58509、 AAX58469、AAX58441、AAX58543、AAX58495、AAX58549、AAX58593、AAX58511、AAX58519、 AAT96270、AAX58447、AAX58571、AAX58465、AAX58489、AAX58533、AAX58535、AAX58461、 AAT96350、AAX58473、AAX58483、AAX58475、AAX58457、AAX52461、AAX52457、AAT96222，（绿黄 假单胞菌）；ABA47299和BAG24117(菊假单胞病菌）；CAH57075(Pseudomonas avellanae); BAE80274和BAE80242(燕麦噬酸菌）；和AAM37767(柑桔溃疡病菌）；上述菌属以全部引用的 方式并入本文。
[0023]再一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)丁香假单胞菌属HrpZ的同源物，其包括 假单胞菌属的其它种属中的那些。这种同源物的例子包括在以下中确定的那些harp in蛋 白：Genbank Accession Nos.P35674、AAB00127、ABL01505、AAQ92359、BAD20880、BAD20876、 BAD20892、BAD20884、BAD20928、BAD20936、BAD20932、BAD20924、BAD20856、BAD20864、 BAD20860、BAD20848、BAD20844、BAD20836、BAD20840、BAD20824、BAD20842、BA