稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用图
【专利说明】稳定的液体HARP IN蛋白制剂的制备、制剂及用途
[00011 本申请是国际申请日为2009年8月6日的国际申请PCT/US2009/052978进入中国、 申请号200980131314.2的题为"稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途"的发明专 利申请的分案申请。
[0002]本申请要求提交于2008年8月12日的序列号为61/088,195的美国临时专利申请的 优先权，据此将该申请以全文引用的方式并入。
技术领域
[0003]本发明涉及稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途。
【背景技术】
[0004] 植物已经进化出能辨别和响应包括病原体感染在内的环境信号的一系列复杂的 生物化学通路。在病原体和植物之间有两种主要的相互作用-相容和不相容。当病原体和植 物相容时，通常就发生疾病。如果病原体和植物不相容，则植物通常对该特定的病原体有抵 抗力。在不相容的相互作用中，植物通过引起感染部位周围一小范围的局部坏死或组织死 亡而限制病原体的繁殖。植物的这一反应被定义为过敏反应（"HR"）（Kiraly/Defenses Triggered by the Invader:Hypersensitivity/'Plant Disease:An Advanced Treatise 5：201-224J.G.HorsfalI and E.B. Cowling,eds. Academic Press,New York(1980)； Klement/7Hypersensitivity,uPhytopathogenic Prokaryotes 2:149-177，M.S.Mount and G.H.Lacy，eds.Academic Press，New York(1982))。局部细胞死亡不仅能遏制感染病 原体的进一步扩散，还会导致系统抗性，防止其它病原体的后续感染。因此，HR是植物对由 细菌、真菌、线虫和病毒引起的疾病的抗性的常见形式。
[0005] 一组命名为hrp(Hypersensitive Response and Pathogenicity)的基因是由包 括欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属和劳尔氏菌属在内的病原菌诱导HR的原因 (Willis 等〃hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria，〃Mol·Plant-Microbe Interact.4：132-138(1991)；Bonas /7hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria，〃pp·79_98in: Current Topics in Microbiology and Immunology，Vol·192，Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals：Molecular and Cellular Mechanisms·J.L.Dangl，ed·Springer-Verlag，Berlin(1994);Alfano等/'Bacterial Pathogens in Plants：Life Up Against the Wall，〃Plant Cell 8:1683-98(1996))。通常，有多个hrp基因聚集在30-40kb的DNA片 段中。hrp基因中的任何一个的突变将导致宿主植物中细菌病原性的丧失和非宿主植物的 HR0
[0006]基于基因和生物化学表征，hrp基因的作用可以分为三组：（1)编码位于细胞外的 如harpin的HR诱导子的结构基因（Wei等"Harpir^Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora"Science 257:85 (1992);He等〃Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants，〃Cell 73:1255(1993);Arlat等〃PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes，Is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum，〃EMBO J.13:543-53(1994);Kim等〃 Hrpff of Erwinia amylovora?a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，〃J.Bacteriol.l80:5203_10(1998));(2)编码用 于将HR诱导子和其它蛋白质从细菌的细胞质输出至细胞表面或细胞外空间的泪液分泌部 的分泌基因 （Van Gi jsegem等，〃Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic BacteriaZ7Trends Microbiol.I： 175-180(1993);He等/Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants /7Cell 73 :1255( 1993);Wei等，〃HrpI of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family/J.Bacteriol · 175: 7985-67(1993);Arlat等〃PopAl，a Protein which Induces a HyPersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes ?Is Secreted via the Hrp Pathway ofPseudomonas solanacearum〃EMBO J.13:543-53(1994);Galan等，〃Cross-talk Between Bacterial Pathogens and Their Host Cells/7 Ann. Rev. Ce11 Dev.Biol.12:221-55 (1996);Bogdanove等，〃Erwinia amylovora Secretes Harpin via a Type III Pathway and Contains a Homo log of yopN of Yersinia/7J.Bacteriol.178：1720-30(1996)； Bogdanove等/'Homology and Functional Similarity of a hrp-linked Pathogenicity Operon，dspEF，of Erwinia amylovora and the avrE Locus of Pseudomonas syringae Pathovar Tomato，〃Proc.Natl .Acad.Sci .USA 95:1325-30(1998));和（3)控制hrp基因表 达的调苄基因（Wei，〃Harpin，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora"Science 257:85(1992);Wei等，〃hrpL Activates Erwinia amylovora hrp Genes in Response to Environmental Stimuli，" J.Bacteriol·174:1875-82(1995);Xiao等，〃A Single Promoter Sequence Recognized by a Newly Identified Alternate Sigma Factor Directs Expression of Pathogenicity and Host Range Determinants in Pseudomonas syringae" J.Bacteriol.176:3089-91(1994);Kim等，〃The hrpA and hrpC Operons of Erwinia amylovora Encode Components of a Type III Pathway that Secretes Harpin/7 J.Bacteriol.179:1690-97(1997);Kim等/HrpW of Erwinia amylovora，a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，" J.Bacteriol.180:5203-10(1998);Wengelnik等，〃HrpG，A Key hrp Regulatory Protein of Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria is Homologous to Two Component Response Regulators / MoI .Plant-Microbe Interact · 9:704-12( 1996)) D 由于在植物和 微生物之间相互作用中所起的作用，hrp基因已经成为细菌病原性和植物防御反应研究的 焦点。
[0007]除局部防御反应外，HR还激活同一植物中未被感染部分的防御系统。这就产生了 对继发性感染的全面的系统抗性，命名为系统获得抗性（"SAR"）（Ross，〃 Systemic Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in PlantsZrVirology 14:340-58(1961);Malamy等，〃Salicylic Acid and Plant Disease Resistance，〃Plant J.2:643-654(1990)) AAR赋予对广谱病原体长期的系统疾病抗性，并与某一套基因的表达 相关联(Ward等，"Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance/'Plant Cell 3:1085-94(1991))。由于诱导植物保护自 己的潜力能显著地减少或摆脱对化学杀虫剂的需求，所以SAR是植物抗病性的重要组成部 分，已经长期受到关注。SAR可以用生物试剂(微生物）或非生物(化学）试剂诱导(Gorlach et al. /7BenzothiadiazolejA Novel Class of Inducers of Systemic Acquired Resistance,Activates Gene Expression and Disease Resistance In Wheat/'Plant Cell 8:629-43(1996))。历史上，弱毒性的病原体被用作SAR的生物诱导剂。也有报道指无 毒的植物生长促进细菌能诱导某些植物对于各种疾病的抗性。
[0008]生物试剂诱导的SAR已成为很多研究的主题。随着分子生物学的发展，第一个具有 广宿主谱的蛋白质HR诱导子于1992年从引起苹果树和梨树火疫病的梨火疫病欧文氏菌 (Erwinia amylovora)(-种病原菌）中分离出来。该HR诱导子被命名为"harpin〃，现被称为 harpinEa或HrpNsac3HarpinEa,由403个氨基酸组成，分子量约为40kDa。编码这一蛋白质的 基因，hrpN，包含在位于hrp基因簇中间的1.3kb DNA片段中。HarpinEa被分泌入细胞外的空 间，对蛋白酶消化很敏感。
[0009]自从梨火疫病欧文氏菌中分理出harpinEa以来，其它一些harpin或类harpin的蛋 白质也已经从其它主要的植物