猪生产及免疫性状相关蛋白，它的编码基因与应用的制作方法

专利名称：猪生产及免疫性状相关蛋白，它的编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质及其编码基因与应用，特别是涉及一种猪生产及免疫性状相关的蛋白及其编码基因与利用该蛋白编码基因的单核苷酸多态性和限制片段长度多态性检测猪生产、免疫性状的方法。
背景技术：
现代育种技术使猪的生产性能得到显著改良，然而随着人民生活水平的提高，对猪肉品质的要求也随之提高。畜牧生产的重点已经扩充到提高瘦肉组织的生长效率、改良肉质的同时，提高产品的抗逆性，从而降低单位产品的生产成本，并且减少药物残留，即在保证畜产品数量的同时，提高畜产品的质量。
个体免疫力是衡量动物健康状况的一个重要指标，它属于数量性状，所涉及的相关基因较多，分子机制也较复杂(Knapp等，Relationships between genetics changesand infections disease in domestic livestock，(eds.Hill W G，Bishop S C，McGuirk B.，)brit.Soc Anim Sci.，Edinburgh Occasional publication no.27，65-80.2000)。部分研究表明，免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作设置了较大障碍，即如何在保持和提高生产性能的基础上提高个体免疫能力是畜牧育种领域新的研究课题。但国外也有少量研究表明猪免疫能力与生产性能的关系是双向的，即在某种情况(正常状态)下增强猪的免疫能力能提高其生长速度、饲料转化效率等主要生产性能。目前为止，猪免疫能力与生产性能间的相互关系仍不确定，因此从分子水平上揭示生产性能和免疫力控制基因间的相互关系十分关键，也为家畜的抗病育种工作提供了新的思路。
当个体受到病原体侵染时，机体会调动三方面的防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制加以抵抗。猪的是否发病取决于侵染和防御机能相互作用的结果，若防御机能强便表现出自然抗病力。抗病力按遗传基础不同可分为特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指猪对某种特定疾病或病原体的抗性，这种抗性主要受一个主基因位点控制，也可不同程度地受其它位点(包括调控子)及环境因素影响。研究表明，特殊抗病力的内在机理在于宿主体内存在或缺少某种分子或其变体，这种分子具有以下作用①决定异体识别及特异性异体反应；②决定病原体的特殊附着力；③病原体进入体内后在体内增殖，决定能否导致宿主发病。一般抗病力不限于抗某一种病原体，它受多基因和环境因素的综合影响，病原体的抗原性差异对一般抗病力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能。如鸡的MHC与马立克病、球虫病及罗斯肉瘤等病的抗性和敏感性有关，研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和F18受体基因。
抗病性主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility complex，MHC)是与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群，猪的MHC(命名为SLA)位于猪的7号染色体上(Warner，Mapping of C2，Bf，and C4 genes to the swine majorhistocompatibility complex.J.Immunology.1987，1393388-3395)，包括I型和II型基因，其中I型基因具有极强的多态性。Rothschild实验室长期从事猪SLA基因单倍型与猪初生重、生长速度、背膘厚等性状的研究，他们认为SLA基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(RothschildMF，Identification of quantitative trait lociand interesting candidate genes in the pigprogress and prospects.Proc 6thWCGALP 1998，26403-409)。Mallard等在经8代选择形成的猪高免疫应答(H系)和低免疫应答(L系)品系中发现H系比L系早10d达到上市体重。上述研究表明猪的SLA与多种生产性状均有连锁，且猪的SLA与生长、背膘和繁殖性状间的联系多呈正相关关系。
PSMB10基因编码26S蛋白酶体的核心20S蛋白酶体的亚基。26S蛋白酶体是泛素-蛋白酶体的蛋白水解途径中的必要组成成分，这个途径是机体内消耗ATP的主动降解途径。泛素-蛋白酶体水解途径与MHC I类分子抗原呈递有重要关系，抗原先由蛋白酶复合体降解成为小肽，和MHC I类分子结合，然后呈递给T细胞，刺激机体免疫应答，产生抗体(Klaus Früh，Young Yang.(1999)Antigen presentation by MHC class I andits regulation by interferon.Current Opinion in Immunology.11，76-81)。因此，这个途径中的基因可能会和机体的免疫性状有一定的联系。PSMB10可由IFN-γ诱导产生，替换另外的一个蛋白酶体基因PSMB7(Eleuteri AM，Kohanski RA，CardozoC，Orlowski M.(1997)Bovine spleen multicatalytic proteinase complex(proteasome).Replacement of X，Y，and Z subunits by LMP7，LMP2，and MECL1，and changes in properties and specificity.J Biol Chem.272，11824-11831)。
泛素-蛋白酶体水解途径降解的目的蛋白中还包括一些细胞周期的调节因子，因此这个蛋白降解途径和细胞生长，分化有着密切关系。PSMB10基因是该途径26S蛋白酶水解复合体活性部分的编码基因，对机体的生长发育可能会有着一定影响。人的PSMB10基因，对它的结构和功能的研究已有报道(Cannon MJ，Pate JL.(2003)Expression andregulation of interferon gamma-inducible proteasomal subunits LMP7 and LMP10in the bovine corpus luteum.Biol Reprod.68(4)，1447-54)。PSMB10基因由8个外显子，7个内含子组成。人的PSMB10基因定位在HSA16q22.1(Larsen F，SolheimJ，Kristensen T，Kolsto AB，Prydz H.(1993)A tight cluster of five unrelatedhuman genes on chromosome 16q22.1.Hum Mol Genet.2(10)，1589-95.)。PSMB10基因是泛素-蛋白酶体核心部分重要的β亚基，但目前为止，有关PSMB10基因功能的研究还不是很透彻，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个强有力的手段。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。无论采用哪一种方法，都首先必须对靶序列进行扩增，然后才能进行其它检测。
PCR-RFLP全称为多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性(restrictionfragment length Polymorphism，RFLP)分析。主要包括三个环节(1)靶基因PCR扩增；(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性)，该技术应用PCR将目的基因片段扩增百万倍以上，即使被测样品核酸量小于pg水平，也能被扩增出来，这不仅大大提高了基因分析的灵敏度，而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR-RFLP主要用于核酸变异性分析与比较，当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小).PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高，重复性好，简便快速直观等优点，主要用于微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断，HLA分型及载脂蛋白基因的分析等。

发明内容
本发明的目的是提供一种猪生产及免疫性状相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的猪生产及免疫性状相关的蛋白，名称为PSMB10，来源于猪，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №9；2)将序列表中SEQ ID №9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与猪生产及免疫性状相关的蛋白质。
其中，序列表中的SEQ ID №9由273个氨基酸残基组成。
上述猪生产及免疫性状相关蛋白的编码基因(PSMB10)也属于本发明的保护范围。
上述猪生产及免疫性状相关蛋白的编码基因包括猪生产及免疫性状相关蛋白的cDNA基因和猪生产及免疫性状相关蛋白的基因组基因。其cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №8的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №9蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №8由943个碱基组成，该cDNA序列的编码序列为序列表中SEQ ID №8的自5′端第116-934位碱基。
其基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №7的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №9蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的序列7由2663个碱基组成，自5′端的第1-171位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第383-470位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第561-658位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第753-893位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第1158-1273位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第1384-1442位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第2273-2424位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端的第2546-2663位碱基为该基因组基因的第八个外显子；自5′端的第116-118位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第2655-2657位碱基为该基因组基因的终止密码子TAA；自5′端的第172-382位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第471-560位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第659-752位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第894-1157位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第1274-1383位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第1443-2272位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5′端的第2425-2545位碱基为该基因组基因的第七个内含子。
含有本发明的猪生产及免疫性状相关蛋白编码基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种检测猪生产、免疫性状的方法。
本发明所提供的检测猪生产、免疫性状的方法，是用由序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №3或由序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对以序列表中SEQ ID №2和SEQ ID№3为引物的PCR扩增产物进行下述1)和2)中至少一种检测或对以序列表中SEQ ID№5和SEQ ID №6为引物的PCR扩增产物进行下述3)和4)中至少一种检测1)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO1的5′端第538位碱基为A还是G；2)用Eco81I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段中是否含有一条642bp条带和/或一条535bp条带和一条107bp条带；3)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO4的5′端第550位碱基为T还是C；4)用Eco72I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段中是否含有一条802bp条带和/或一条550bp条带和一条252bp条带。
如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO1的5′端第538位碱基，即自序列表中序列7的5′端第538位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；自序列表中SEQ ID NO1的5′端第538位碱基，即自序列表中序列7的5′端第538位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；它们的杂合体基因型为AG。
Eco81I酶切所述PCR扩增产物，若得到的酶切片段为一条642bp的条带，则确定待测猪的基因型为GG；若得到的酶切片段为一条535bp和一条107bp的两条带，则确定待测猪的基因型为AA；若得到的酶切片段为一条642bp的条带，一条535bp和一条107bp的三条带，则确定待测猪的基因型为AG。
如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO4的5′端第550位碱基，即自序列表中序列7的5′端第1170位碱基(自序列表中序列8的5′端第511位碱基)为T时，其纯合体的基因型为TT；自序列表中SEQ ID NO4的5′端第550位碱基，即自序列表中序列7的5′端第1170位碱基(自序列表中序列8的5′端第511位碱基)为C时，其纯合体的基因型为CC；它们的杂合体基因型为TC。
Eco72I酶切所述PCR扩增产物，若得到的酶切片段为一条802bp的条带，则确定待测猪的基因型为TT；若得到的酶切片段为一条550bp和一条252bp的两条带，则确定待测猪的基因型为CC；若得到的酶切片段为一条802bp的条带，一条550bp和一条252bp的三条带，则确定待测猪的基因型为TC。
其中，AA基因型的出生至结束ADG(出生至结束平均日增重)，屠宰率均高于AG，GG基因型，AG基因型居中，GG基因型的最低；GG基因型的6-7肋骨BF(6-7肋间背膘厚)，平均三点BF(第6-7肋间、最后肋骨处和腰荐结合处离背中线4cm三点膘厚平均值)，肉色，肌内脂肪均高于AG，GG基因型，AG基因型居中，AA基因型最低；在HCT％(红细胞压积量)，MCV(fL)(红细胞平均容积)和RDW(％CV)(红细胞体积分布宽度)这3个免疫性状中，GG基因型均高于AG，AA基因型，AG基因型居中，AA基因型最低，初步显示GG基因型个体的免疫性状较好。
TT基因型的出生至结束ADG，屠宰率，估算眼肌面积(cm2)和腿臀比率均极显著高于TC，CC基因型；而在初生达上市体重(90KG)日龄和肌内脂肪这两个生长性状中，CC基因型均高于TC，TT基因型。TT基因型的出生至结束ADG和估算眼肌面积极显著高于TT，TC基因型，表明TT基因型猪的生长速度和眼肌面积这两个生长指标较好；CC基因型的MCV(fL)性状极显著高于TT基因型(P＜0.01)和TC基因型；而在HCT％和RDW(％CV)两性状中，CC基因型的对应值显著高于TT基因型的对应值(P＜0.05)；在这3个性状中，TC基因型的对应值均显著高于TT基因型的对应值(P＜0.05)。
所述单核苷酸多态性检测可采用DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等进行检测。
本发明的猪生产及免疫性状相关蛋白及其编码基因可用于检测猪红细胞体积分布宽度、红血球压积量、红细胞平均容积等免疫性状，出生至结束ADG，ADG达结束体重日龄、屠宰率、估算眼肌面积(cm2)板油率、腿臀比率、肉质、肌内脂肪等生产性状，为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，将在猪的育种中发挥重要作用。


图1为检测猪PSMB10部分DNA序列多态性的流程2为猪PSMB10部分DNA序列的扩增结果图3为猪PSMB10部分DNA序列Eco81I-RFLP多态性的琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为猪PSMB10部分DNA序列的扩增结果及其Eco72I-RFLP多态性的琼脂糖凝胶电泳检测结果具体实施方式
下述实施例中所用实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、猪PSMB10的获得1、猪PSMB10的基因组基因的获得用人PSMB10的cDNA序列(GenBank收录号NM_002801)为信息探针，利用NCBI的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列检索，获得一系列同源性达80％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI的ENTREZ(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.htmL)中查询相应序列，然后用软件DNAStar中的Seqman程序构建猪的EST重叠群，最后根据EST拼接序列设计扩增引物4对1PL5′-AGTTAAGCTCAGTCGTGCAG-3′1PR5′-TGAAGTGGATCTTTTCGCAG-3′2PL5′-AGCTGCGAAAAGATCCACTT-3′2PR5′-GGTCTTCTAGCACTGCCAGG-3′3PL5′-CCTGGCAGTGCTAGAAGACC-3′3PR5′-GTCAGCGGCATCACTGTCTG-3′4PL5′-ACAAAGCCCACAGAAAGGTA-3′
4PR5′-CTCAGCTTACTCCACATCCA-3′在猪的基因组DNA中进行扩增，得到4条特异条带，用软件DNAStar中的Seqman程序拼接得到一条2663bp的序列，具有序列表中序列7的核苷酸序列，该序列即为猪PSMB10的基因组序列，编码具有序列表中序列9的氨基酸残基序列(猪PSMB10)。自5′端的第1-171位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第383-470位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第561-658位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第753-893位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第1158-1273位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第1384-1442位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第2273-2424位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端的第2546-2663位碱基为该基因组基因的第八个外显子；自5′端的第116-118位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第2655-2657位碱基为该基因组基因的终止密码子TAA；自5′端的第172-382位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第471-560位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第659-752位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第894-1157位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第1274-1383位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第1443-2272位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5′端的第2425-2545位碱基为该基因组基因的第七个内含子。
2、猪PSMB10基因的cDNA的获得最后根据EST拼接序列设计扩增引物2对5PL5’-AGTTAAGCTCAGTCGTGCAG-3’5PR5’-CTCAGCTTACTCCACATCCA-3’6PL5’-GTGCTGGTCCTACTCCTCTG-3’6PR5’-TAACATGCGAGTGACAGTGG-3’在猪的cDNA中扩增得到两条特异带，将产物进行测序，将结果和人的PSMB10及猪PSMB10基因组序列进行比对，确认是该基因的cDNA序列。它具有序列表中的SEQ ID №8(由943个碱基组成)的核苷酸序列，该cDNA序列的编码序列为序列表中SEQ ID №8的自5′端第116-934位碱基。
3、猪PSMB10基因的定位以猪×啮齿类体细胞杂种克隆板RH克隆板(INRA-Minnesota porcine radiationhybrid panel，ImpRH，118个杂种细胞系)中的DNA(购自法国农业科学院，Laboratoirede Génétique Cellulaire，INRA)为模板，以正向引物5′-AGCTGCGAAAAGATCCACTT-3′和反向引物5′-GGTCTTCTAGCACTGCCAGG-3′进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性4min；94℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环。最后在72℃延伸5min。其中的反应体系组成为PCR反应总体积为10μl，其中RH克隆板DNA约25ng，含1×缓冲液(Promega)，2mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度均为0.2μmol/L，1U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段分型，其中在第1，2，3，4，6，12，21，28，29，37，43，48，61，63，68，69，70，73，94，98，99，100，101，102，103，104，105，108，111，112，113，115，118号杂种细胞系中的DNA中获得阳性扩增结果。将PCR分型数据提交给HybWeb(http//imprh.toulouse.inra.fr/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果表明猪PSMB10的基因组基因定位于猪6号染色体上，与微卫星标记SW1108紧密连锁，LOD值为6.14。
实施例2、猪PSMB10的部分DNA序列的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测猪PSMB10的部分DNA序列的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测的流程如图1所示，具体步骤如下一、猪PSMB10的部分DNA序列的单核苷酸多态性的检测1、引物设计用人PSMB10的cDNA序列(GenBank收录号NM_002801)为信息探针，利用NCBI的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列检索，获得一系列同源性达90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI的ENTREZ(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.htmL)中查询相应序列，然后用软件GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪的EST重叠群，最后根据EST拼接序列设计扩增引物，引物序列如下引物1(正向)5’-AGTTAAGCTCAGTCGTGCAG-3’(序列2)引物2(反向)5’-TGAAGTGGATCTTTTCGCAG-3’(序列3)引物3(正向)5’-AGCTGCGAAAAGATCCACTT-3’(序列5)引物4(反向)5’-GGTCTTCTAGCACTGCCAGG-3’(序列6)2、PCR扩增及其扩增产物的纯化、克隆和测序分别以大长通组合(大白×长白×通城猪)26头，长大通组合(长白×大白×通城猪)27，大白猪15头，长白猪15头，杜洛克15头和通城纯繁猪74头的血液基因组的总DNA为模板，在引物1和引物2、引物3和引物4的引导下，PCR扩增猪PSMB10部分DNA序列。PCR反应总体积为20μl，其中，猪基因组DNA约100ng，2μl 10×PCR缓冲液(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP 150μmol/L，引物1和引物2(或引物3和引物4)各0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR反应程序为先94℃4min；然后94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 20s，35个循环；最后72℃延伸5min。将PCR反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，引物1和引物2扩增产物的电泳结果如图2所示，表明获得的PCR产物大小为642bp。图2中，2泳道为PCR扩增产物，M泳道为DNA分子量标记(100-1000bp ladder)。引物3和引物4扩增产物的电泳结果如图4所示，表明获得的PCR产物大小为802bp。图4中，PCR泳道为PCR扩增产物，M泳道为DNA分子量标记(100-1000bp ladder)。
然后按照如下方法进行PCR产物的纯化、克隆和测序(1)PCR产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml树脂(Resin)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过微柱(Minicolumn)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl无菌水，静置1min，10,000g离心20s，弃上清，洗脱DNA存于Ependorff管中。
(2)连接反应将步骤(1)纯化的PCR产物与pGEM-T载体(Promega)用T4DNA连接酶连接，得到重组载体。连接体系为2.5μL 2×缓冲液，0.5μL pGEM-T载体，0.5μL纯化的PCR产物，0.5μL T4DNA连接酶，1μL灭菌水，16℃水浴12-24h。
(3)感受态细胞的制备将大肠杆菌DH5α(TaKaRa)在LB固体培养基上37℃培养16-20h后，挑取单菌落接种于2mL LB液体培养基中，37℃振荡培养3h，然后取1mL菌液转接于含有30mL LB液体培养基的摇瓶中，在37℃继续振荡培养约4h，待菌液OD600的值达到0.3-0.4时将摇瓶从摇床取出，冰浴10-15min使之冷却，然后将菌液转入离心管中于4℃、4,000g离心10min收集菌体细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬沉淀，即菌体细胞，冰浴30min后，4℃ 4,000g离心10min，再用4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬沉淀，置4℃保存备用。
(4)转化无菌状态下取100-120μl步骤(3)制备的感受态细胞于1.5mLEpendorff管中，再加入5μL步骤(2)获得的连接产物，混匀，冰浴30min，42℃热激90s(上述转化过程中不要摇动Ependorff管)，取出后冰浴3-4min，再加入400μl不含抗生素的LB液体培养基，在37℃振荡培养45min，最后取100μL菌液涂布于含4μL的200mg/mLIPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和40μL的20mg/mL X-gal的LB平板上，先37℃预培养1h后在相同条件下倒置培养12-24h；(5)质粒的小量制备挑取琼脂平板上长出的单菌落接种于2-3mL LB液体培养基中，37℃ 300r/min培养12-24h，再用1.5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0))，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III(5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
(6)重组质粒的酶切鉴定取3μl质粒DNA与双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2-3U限制性内酶EcoRI及2μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，得到酶切结果与预计完全相同的目的重组质粒。
(7)测序重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果表明引物1和引物2扩增产物的长度为642bp，具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，其中，自5′端的第1-171位碱基为PSMB10基因组的第一个外显子的部分序列，即自序列表中序列7的5′端第1-171位碱基(自序列表中序列8的5′端第1-171位碱基)；自5′端的第172-382位碱基为该基因基因组的第一个内含子完整序列，即自序列表中序列7的5′端第172-382位碱基；自5′端的第383-470位碱基为PSMB10基因组的第二个外显子的部分序列，即自序列表中序列7的5′端第383-470位碱基(自序列表中序列8的5′端第172-259位碱基)；自5′端的第471-562位碱基为PSMB10基因组的第二个内含子的部分序列，即自序列表中序列7的5′端第471-562位碱基；自5′端的第561-642位碱基为PSMB10基因组基因的第三个外显子的部分序列，即自序列表中序列7的5′端第561-642位碱基(自序列表中序列8的5′端第260-341位碱基)。自序列表中SEQ ID NO1的5′端第538位碱基，即自序列表中序列7的5′端第538位碱基处存在A、G两个等位基因，即为多态性位点。如自序列表中SEQ ID NO1的5′端第538位碱基，即自序列表中序列7的5′端第538位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；自序列表中SEQID NO1的5′端第538位碱基，即自序列表中序列7的5′端第538位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；它们的杂合体基因型为AG。
测序结果表明引物3和引物4扩增产物的长度为802bp，具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，其中，自5′端的第1-38位碱基为PSMB10基因组的第三个外显子的部分序列，即自序列表中序列7的5′端第621-658位碱基(自序列表中序列8的5′端第320-357位碱基)；自5′端的第39-132位碱基为该基因组基因的第三个内含子完整序列，即自序列表中序列7的5′端第659-752位碱基；自5′端的第133-273位碱基为PSMB10基因组的第四个外显子的完整序列，即自序列表中序列7的5′端第753-893位碱基(自序列表中序列8的5′端第358-498位碱基)；自5′端的第274-537位碱基为PSMB10基因组的第四个内含子的完整序列，即自序列表中序列7的5′端第894-1157位碱基；自5′端的第538-653位碱基为PSMB10基因组基因的第五个外显子的完整序列，即自序列表中序列7的5′端第1158-1273位碱基(自序列表中序列8的5′端第499-614位碱基)；自5′端的第654-763位碱基为PSMB10S基因组基因的第五个内含子的完整序列，即自序列表中序列7的5′端第1274-1383位碱基；自5′端的第764-802位碱基为PSMB10基因组基因的第六个外显子的部分序列，即自序列表中序列7的5′端第1384-1422位碱基(自序列表中序列8的5′端第615-653位碱基)。自序列表中SEQ ID NO4的5′端第550位碱基，即自序列表中序列7的5′端第1170位碱基(自序列表中序列8的5′端第511位碱基)处存在C、T两个等位基因，即为多态性位点。如自序列表中SEQ ID NO4的5′端第550位碱基，即自序列表中序列7的5′端第1170位碱基(自序列表中序列8的5′端第511位碱基)为C时，其纯合体的基因型为CC；自序列表中SEQ ID NO4的5′端第550位碱基，即自序列表中序列7的5′端第1170位碱基(自序列表中序列8的5′端第511位碱基)为T时，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为CT。
3、DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO4)与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息，结果表明猪和人的序列相似性为86％，该序列编码猪的蛋白酶体亚基PSMB10。
二、猪PSMB10的部分DNA序列的RFLP多态性的检测1、猪PSMB10的部分DNA序列Eco81I-RFLP多态性检测大白猪15头，长大猪15头，杜洛克和通城猪40头的血液基因组的总DNA为模板，在引物15’-AGTTAAGCTCAGTCGTGCAG-3’(正向)和引物25’-TGAAGTGGATCTTTTCGCAG-3’(反向)的引导下进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为猪基因组DNA约100ng，2μl 10×PCR缓冲液(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物1和引物2各0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR反应条件为先94℃ 4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，35个循环；最后72℃延伸5min。然后将PCR产物用Eco81I限制性内切酶酶切，酶切反应体系(10μl)为，1×酶切缓冲液1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶0.5μl(5U)，用H2O补足10μl。酶切条件为37℃水浴4h。用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并记录基因型，结果如图3所示(图3中，泳道M为Marker，泳道GG为基因型为GG的纯合体，泳道AA为基因型为AA的纯合体，泳道AG为基因型为AG的杂合体)，表明AA基因型个体中，只得到一条642bp的条带；AG基因型个体中，得到三条带一条642bp，一条535bp和一条107bp条带；GG基因型个体中，得到两条带一条535bp和一条107bp条带。当等位基因为A时，自序列表中SEQ ID NO1的5′端第534-540位碱基出现限制性内切酶Eco81I的识别位点(CC↓TAAGG)，若用Eco81I酶切该片段，则等位基因为G只出现642bp一个片段，等位基因为A则会出现535bp和107bp两个片段，由于该基因座由上述两个等位基因控制，因而可组成AA，AG，GG三种基因型。
2、猪PSMB10的部分DNA序列Eco72I-RFLP多态性检测分别以大白猪15头，长大猪15头，杜洛克15头和通城猪40头的血液基因组的总DNA为模板，在引物35’-AGTTAAGCTCAGTCGTGCAG-3’(正向)和引物45’-GGTCTTCTAGCACTGCCAGG-3’(反向)的引导下进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为猪基因组DNA约100ng，2μl 10×PCR缓冲液(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物1和引物2各0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR反应条件为先94℃ 4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，35个循环；最后72℃延伸5min。然后将PCR产物用Eco72I限制性内切酶酶切，酶切反应体系(10μl)为，1×酶切缓冲液1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶0.5μl(5U)，用H2O补足10μl。酶切条件为37℃水浴4h。用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并记录基因型，结果如图4所示(图4中，泳道M为Marker，泳道TT为基因型为TT的纯合体，泳道CC为基因型为CC的纯合体，泳道TC为基因型为TC的杂合体)，表明TT基因型个体中，只得到一条802bp的条带；TC基因型个体中，得到三条带一条802bp，一条550bp和一条252bp条带；CC基因型个体中，得到两条带一条550bp和一条252bp条带。当等位基因为C时，自序列表中SEQ ID NO4的5′端第548-553位碱基出现限制性内切酶Eco72I的识别位点(CAC↓GTG)，若用Eco72I酶切该片段，则T等位基因只出现802bp一个片段，C等位基因则会出现550bp和252bp两个片段，由于该基因座由上述两个等位基因控制，因而可组成TT，TC，CC三种基因型。
实施例3、检测猪免疫性状和生产性状分别以大白猪15头，长大猪15头，杜洛克15头和通城猪40头共85个个体为实验对象按照实施例2的方法检测85个个体的单核苷酸多态性和RFLP多态性，确定它们的基因型，其结果如表1和表2所示，表1表明在所检测的4个猪品种中，通城猪的两个等位基因频率相差不大；在检测的长白猪中，未见GG基因型，A等位基因占绝对优势；大白猪和杜洛克猪的A基因频率明显高于G基因的频率。
表1 各个基因型在4个猪品种中的分布

表2表明在所检测的4个猪品种中，T等位基因均占明显优势，在所检测的长白猪中未见CC基因型。
表2 各个基因型在4个猪品种中的分布

2、标记性状关联分析按照实施例2的方法检测以下87个个体大长通组合(大白×(长白×通城))26头猪，长大通组合(长白×(大白×通城))27头猪，通城纯繁组34头猪的单核苷酸多态性和RFLP多态性，确定它们的基因型，并进行基因型与生产、免疫性状关联分析。
用如下最小二乘模型分析免疫性状(红细胞体积分布宽度(RDW(％CV))，红血球压积量(HCT％)，红细胞平均容积(MCV(fL))，血液抗体IgG含量，平均血红蛋白浓度，平均血红蛋白含量，白细胞总数和红细胞总数)和生产性状(ADG达结束体重日龄，屠宰率，估算眼肌面积(cm2)，腿臀比率，板油率，肌内脂肪，剪切率，PH值，平均日增重，背膘厚，肉色，大理石纹，失水率和滴水损失)yijk＝μ+GENOTYPEi+SEXj+COMBINATIONk+εijk，其中，yijk是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，SEXj为性别效应，COMBINATIONk为不同组合的效应，εijk为随机误差，假定服从N(O，σ2)分布。
不同基因型之间的性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)如表3，表4，表5和表6所示，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。
表3 不同基因型与部分生产性状的关联分析

注**表示差异极显著，*表示差异显著。
表3表明，AA基因型的出生至结束ADG，屠宰率均高于AG，GG基因型的对应值，其中，AG基因型的对应值居中间，GG基因型的对应值最低；GG基因型的6-7肋骨BF，平均三点BF，肉色，肌内脂肪均高于AG，GG基因型，以AG基因型对应值居中间，AA基因型对应值最低。
表4 不同基因型与部分免疫性状的关联分析

注**表示差异极显著，*表示差异显著。
表4表明，在HCT％，MCV(fL)和RDW(％CV)这3个免疫性状中，GG基因型的对应值均高于AG，AA基因型的对应值，其中，以AG基因型的对应值居中，AA基因型的对应值最低，初步显示GG基因型个体的免疫性状较好。
表5 不同基因型与部分生产性状的关联分析

注**表示差异极显著，*表示差异显著。
表5表明，TT基因型的出生至结束ADG，屠宰率，估算眼肌面积(cm2)和腿臀比率的值均极显著高于TC，CC基因型的对应值；而在ADG达结束体重日龄和肌内脂肪这两个生长性状中，CC基因型对应值均高于TC，TT基因型的对应值。数据分析结果表明，TT基因型猪的出生至结束ADG和估算眼肌面积极显著高于TT，TC基因型，说明TT基因型猪的生长速度和眼肌面积这两个生长指标较好。
表6 不同基因型与部分免疫性状的关联分析

注**表示差异极显著，*表示差异显著。
表6表明，CC基因型的MCV(fL)性状极显著高于TT基因型(P＜0.01)和TC基因型；而在HCT％和RDW(％CV)两性状中，CC基因型的对应值显著高于TT基因型的对应值(P＜0.05)；在这3个性状中，TC基因型的对应值均显著高于TT基因型的对应值(P＜0.05)。
序列表<160>9<210>1<211>642<212>DNA<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)<220>
<221>misc-feature<222>(538)<223>n＝a或g<400>1agttaagctc agtcgtgcag gacaaggaca aaggacaagg ctgtggcctt ccttgcttgg 60tgctggtcct actcctctga cctccaaacc cctggactgc cctgcccacc tggacatgca 120gaagatagcg ctagagcccc tagggggctt ttcctttgag aactgccaga ggtgagtggg 180gggatgattg gtccccagct gcctaggtcc tcagtgaggg tctctgggag tgggagaacc 240aggatcttta aaagtaagac gacgacttgg gttccgaggc ttacatggag aagtgagaga 300aacgtggacg gagttggaga atgtgattgg gggaggggga tcccataaga aatgaaacct 360gagacttttc cctccgttcc agaaatgcat ccttggaacg cgccctccct gggttccggg 420tccctcacgc actcaagacg gggaccacca ttgcaggtct tgtattccag gtgagcaaga 480agttgtgact gtggggcttg gaggggcggc cgggaatagg aagtgggcag tgacctangg 540gtttctcccc tcttctccag gacggggtaa tcctgggcgc ggatacgcgg gccactaacg 600actcggtcgt ggcggacaag agctgcgaaa agatccactt ca642<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列
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<221>misc-feature<222>(1170)<223>n＝c或t<400>7agttaagctc agtcgtgcag gacaaggaca aaggacaagg ctgtggcctt ccttgcttgg 60tgctggtcct actcctctga cctccaaacc cctggactgc cctgcccacc tggacatgca120gaagatagcg ctagagcccc tagggggctt ttcctttgag aactgccaga ggtgagtggg180gggatgattg gtccccagct gcctaggtcc tcagtgaggg tctctgggag tgggagaacc240aggatcttta aaagtaagac gacgacttgg gttccgaggc ttacatggag aagtgagaga300aacgtggacg gagttggaga atgtgattgg gggaggggga tcccataaga aatgaaacct360gagacttttc cctccgttcc agaaatgcat ccttggaacg cgccctccct gggttccggg420tccctcacgc actcaagacg gggaccacca ttgcaggtct tgtattccag gtgagcaaga480
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权利要求
1.一种猪生产及免疫性状相关的蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №9；2)将序列表中SEQ ID №9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与猪生产及免疫性状相关的蛋白质。
2.权利要求1所述的猪生产及免疫性状相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №8的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №9蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №7的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №9蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求2或3或4所述编码基因的载体。
6.含有权利要求2或3或4所述编码基因的细胞系。
7.含有权利要求2或3或4所述编码基因的宿主菌。
8.一种检测猪生产、免疫性状的方法，是用由序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №3或由序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对以序列表中SEQID №2和SEQ ID №3为引物的PCR扩增产物进行下述1)和2)中至少一种检测或对以序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6为引物的PCR扩增产物进行下述3)和4)中至少一种检测1)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ IDNO1的5′端第538位碱基为A还是G；2)用Eco81I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段中是否含有一条642bp条带和/或一条535bp条带和一条107bp条带；3)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ IDNO4的5′端第550位碱基为T还是C；4)用Eco72I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段中是否含有一条802bp条带和/或一条550bp条带和一条252bp条带。
全文摘要
本发明公开了一种猪生产及免疫性状相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白为具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质∶1)序列表中的SEQ ID №9；2)将序列表中SEQ ID №9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与猪生产性状及免疫性状相关的蛋白质。检测猪生产性状及免疫性状的方法，是用由序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №3或由序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测或限制片段长度多态性检测。本发明的猪生产及免疫性状相关蛋白及其编码基因将在猪的育种中发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1786030SQ20041009685
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者李奎, 吴潇, 杨述林, 朱正茂 申请人:中国农业科学院畜牧研究所