专利名称：锰浓度的测定方法及锰诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对锰浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法及酶(偶)联法测定锰浓度的方法，以及由此制得的锰诊断试剂盒，属于锰浓度分析检测技术领域。
背景技术：
锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶反应激活中，Mn2+和Mg2+可互相替代。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定锰浓度的方法，以及应用该方法配制而成的锰诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种利用酶比色法及酶(偶)联法测定锰浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将测定的样品与含有草酰乙酸、草酰乙酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出锰的浓度大小。
上述利用酶比色法及酶(偶)联法测定锰浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
实现本发明锰诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 5～100g/ml，还原型辅酶 0.1～0.35mmol/L，草酰乙酸1～50mmol/L，草酰乙酸脱羧酶 1000～80000U/L，乳酸脱氢酶 1000～80000U/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分还原型辅酶、草酰乙酸，可以放在试剂II；试剂II中的草酰乙酸脱羧酶、乳酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将试剂配成如下三试剂
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的草酰乙酸可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的草酰乙酸脱羧酶、乳酸脱氢酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，辅酶 3mmol/L，肌醇-1(4)-磷酸酶 1000～80000U/L，，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 1000～80000U/L，肌醇1-磷酸1～12mmol/L，甘油醛-3-磷酸 1～12mmol/L。
本发明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰浓度的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的锰诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶比色法及酶(偶)联法测定锰浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；
(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中锰浓度的大小；(6)本发明提供的液态锰诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种锰浓度的测定方法及锰诊断试剂盒，利用需要锰离子激活的草酰乙酸脱羧酶(oxaloacetate decarboxylase；EC4.1.1.3)(偶)联乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase；EC1.1.1.27；EC1.1.1.28)酶促反应速率比色法。草酰乙酸脱羧酶促使草酰乙酸发生脱羧作用产生丙酮酸，再通过乳酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰的浓度大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制锰诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，NADH0.25mmol/L，草酰乙酸20mmol/L，
草酰乙酸脱羧酶 12000U/L，乳酸脱氢酶 20000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间l0分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰的浓度大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制锰诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L，甘油2mol/L，NADPH 0.25mmol/L，草酰乙酸30mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L，丙二醇 50％v/v，草酰乙酸脱羧酶 18000U/L，乳酸脱氢酶 30000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰样品与试剂I、试剂II的体积比为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰的浓度大小。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制锰诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L，乙二醇 2mol/L，thio-NADH 0.25mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L，草酰乙酸10mmol/L；试剂III——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，草酰乙酸脱羧酶 8000U/L，乳酸脱氢酶 14000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定锰浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰样品与试剂I、试剂II、试剂III的体积比为4∶40∶5∶5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰的浓度大小。
经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.锰浓度的测定方法，包括以下步骤①将测定的样品与含有草酰乙酸、草酰乙酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出锰的浓度大小。
2.锰诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，草酰乙酸 1～50mmol/L，草酰乙酸脱羧酶1000～80000U/L，乳酸脱氢酶1000～80000U/L。
3.根据权利要求2所述的锰诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
4.根据权利要求2所述的锰诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
5.权利要求2～4中任意一种锰诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
6.权利要求2～4中任意一种锰诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种锰浓度的测定方法及锰诊断试剂盒，利用需锰离子激活的草酰乙酸脱羧酶(偶)联乳酸脱氢酶酶促反应速率比色法。草酰乙酸脱羧酶促使草酰乙酸发生脱羧作用产生丙酮酸，再通过乳酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶氧化成为辅酶，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰的浓度大小。该方法特异性高，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，测试成本低廉，便于推广应用。
文档编号C12Q1/26GK1987472SQ200610161230
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司