专利名称：：天然高产叶酸菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及选择叶酸高产突变菌抹的方法。本发明的这些方法中，利用抗叶酸氨甲喋呤(MTX)作为选择试剂。也提供了含有该突变菌林或这些菌林的衍生物或提取物的食品和食品添加剂组合物。
背景技术：
：多年来，由于叶酸类似物特别是二氢叶酸还原酶抑制剂在癌症化学疗法中以及作为抗疟原虫药物的潜在作用，逐渐成为研究的主题。文献首先报道的叶酸类似物之一就是LederleLaboratories公司的氨曱喋呤。1948年这个化合物-故用于治疗急性白血病(HUchings,G.H.,Jr,,1989,InVitroCellDevBiol25:303-10)。氨曱喋呤(MTX)的活性基于对靶酶二氬叶酸还原酶的竟争性抑制。这个酶对于利用二氢叶酸(DHF)作为底物生成四氢叶酸(THF)及四氢叶酸循环是必需的。氨甲喋呤的特异性可以通过不同物种中二氲叶酸还原酶的结构差异来解释(Chang等，1978,Nature275:617-24)。氨曱喋呤抑制细胞产生足够的四氢叶酸来生物合成曱硫氨酸、DNA和RNA。但是在嘌呤、胸腺嘧啶、甘氨酸、甲硫氨酸和泛酸(所有这些代谢产物的生物合成都需要四氬叶酸)存在的情况下，细胞生物合成四氢叶酸的需求会降低(Harvey，R.J.,1973:JBacteriol114:309-22)。不管是否有依赖型叶酸代谢物，由于四氢叶酸是形成蛋白质合成起始所必需的曱硫氨酰-tRNA必不可少的，因此细胞的生长在某些方面被氨甲喋呤所抑制(Baumstark等，1977,JBacteriol129:457-71)。乳酸乳球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌这样的乳酸菌对于氨曱喋呤和另一个叶酸类似物甲氧千氨嘧啶的反应有高度的可变性。乳酸乳球菌对两种抗叶酸物质都不敏感(Leszczynska等,1995,应用环境微生物学61:561-6)。众所周知，对于众多的有机体,长期暴露于抗叶酸物质可以选择抗性细胞类型。几个潜在的机制已经被用来解释真核细胞系和细菌对氨甲喋呤的抗性机制。Tamura等(1997，Microbiology143:2639-46)研究了海氏肠球菌(Enterococcushirae)产生氨曱喋呤抗性的机制。他们发现了几种表型效应(i)叶酸还原酶(FAR)活性增高；(ii)二氢叶酸还原酶(DHFR)活性增加；(Hi)含有两个谷氨酰残基的氨曱喋呤的合成和细胞内驻留的减少；(iv)伴随叶酸摄入量的减少，氨甲喋呤的摄入量也减少；及(v)叶酸结合量的减少。在抗性形成过程中，培养基中的叶酸形式会影响二氢叶酸还原酶和叶酸还原酶活性，以及叶酸的运输。虽然暴露于氨甲喋呤可以用来选择对氨甲喋呤抗性增加的细胞，但是先前的文献报道在氨曱喋呤抗性和细胞的叶酸水平之间没有联系。对比前面的氨曱蝶呤抗性机制的描述，本发明令人惊奇的发现细菌细胞有另一个产生氨曱喋呤抗性的机制产生高水平的叶酸。用氨甲喋呤作为选择试剂，可以利用这个发现筛选和选择高产叶酸(自发)突变菌抹。这些菌抹尤其是食品级菌抹，可以用来强化具有叶酸的食品产品。叶酸是可溶性的B族维生素，对于细胞的正常生长和功能发挥是必需的。许多食品产品，如面包、谷物、乳制品等都补充叶酸来保证足够的叶酸摄入量。本发明的突变菌林可以通过如用突变菌抹进行发酵的方法，用天然的叶酸来强化食品产品。定义本发明提到的乳酸菌指的是可以产生乳酸，并把乳酸作为最终发酵产物的细菌，如乳杆菌、乳球菌、链球菌、和双歧杆菌等一些菌属。本发明中的菌抹或分离菌抹可以互换使用，且指的是在生长或繁殖的时候，保持遗传不变的细菌，包括同一细菌的繁殖。突变细菌，或突变菌林或分离菌林指的是自然(自发的、自然发生的)突变菌，或在野生型没有DNA片段的染色体组中含有一个或多个诱导突变的菌株。诱导突变指的是通过人为处理引起突变的菌抹，如用化学突变剂、紫外线或伽马辐射等。相反，自然或自发突变是没有被人为诱变处理的。本发明的突变菌抹指的是非基因修饰菌，即没有通过重组DNA技术修饰的菌林。"野生型菌抹，，或"野生型分离菌抹"指的是没有发生突变形式的细菌，就像刚从自然界发现的一样。"叶酸依赖型代谢物"指的是叶酸生物合成或分解的代谢产物或前体，在细胞存在于氨曱喋呤培养基时，可以掩盖细胞对氨曱喋呤的敏感性。"氨曱喋呤抑制量"指的是完全抑制细胞生长所需要的氨甲喋呤量。一般而言，对于原核细胞，每升培养基至少大约1.25毫克可以对氨曱喋呤敏感细胞产生抑制。"总叶S交"指的是菌抹产生的细胞外(分泌)和细胞内叶酸水平之和。"食品级"微生物特别指的是被人或试验动物摄入时，可以认为没有危害的微生物。术语"包含"可以解释为特指存在特定的部分、步骤或组分，但不排除一个或多个附加的部分、步骤或组分。因此，含有X菌林的组合物可以包含另外的菌林，或其它组分等。同时，被不定冠词"a"或""an"修饰的成分不排除有多于一种成分的可能性。除非上下文中明确要求有且只有一个成分。因此，通常不定冠词"a"或""an"意思是至少一个。发明详述试验中，无论重组叶酸高产菌抹是否已经修改了氨曱。巣呤的敏感性，研究发现许多植物乳杆菌野生菌林即使在抑制量氨甲喋呤(1.25毫克/升)的培养基上培养大约40个小时，也不被氨甲喋呤抑制，且与缺乏氨甲喋呤的培养基上的生长速度相似。分析这些菌林的叶酸水平，大约5%的菌落与野生菌抹(没有突变)相比，叶酸产量显著升高。叶酸总量比野生菌林的叶酸总量(平均)高4%到63%。这个研究证明氨曱喋呤可以用来有效选择自然(非基因修饰菌林)叶酸高产菌林。甚至当菌林在缺乏氨甲喋呤的培养基上传代50次以上，仍有对氨甲喋呤的耐性，这说明菌林对氨曱。某呤的耐性是由细菌基因组上的稳定(自发)突变引起的。从重组植物乳杆菌可以看出，提高叶酸产量同样可以导致对氨曱喋呤的高度耐性，该植物乳杆菌转入了完整的叶酸生物合成基因簇，并将其置于强启动子控制下。这些重组菌抹可以产生高水平的叶酸，而且在缺乏叶酸依赖型代谢物的培养基上生长时，对氨曱喋呤具有抗性。不限制本发明的范围，可以推测细胞内二氮叶酸水平与累积的氨甲喋呤竟争二氢叶酸还原酶(DHFR)的活性位点。该发现被用于开发快速筛选方法，即通过在氨曱喋呤培养基上生长来选择叶酸高产菌林。本研究中鉴定的叶酸高产菌林与野生型产叶酸菌林相比，叶酸水平显著升高。叶酸高产菌抹的总叶酸量是野生型水平的20-60倍。叶酸高产菌抹的细胞内叶酸量比野生型菌抹的高10到20倍。这种增加的细胞内叶酸水平引起细胞对氨曱喋呤的敏感性(即耐性)降低。这可以解释为什么叶酸高产菌抹的生长没有被氨曱喋呤显著影响。只有当培养基不含与叶酸有关的代谢物时，才可以观察到野生型菌抹对氨甲喋呤的敏感性。本发明的菌抹因此，给出本发明突变菌抹的一个实施例，该菌林的细胞内和/或细胞外叶酸总量比野生型高，而且在含有(至少)1.25毫克/升氨曱喋呤且不含叶酸依赖型代谢物(即他们具有氨甲喋呤抗性)的培养基上生长时，其生长率至少为0.1优选在此生长条件下，突变菌抹的生长率与在缺乏氨曱喋呤的相同培养基上生长的野生型的生长率(即正常生长)，没有显著差别。最重要的是，在所含氨曱喋呤的浓度抑制野生型菌株的情况下，突变菌抹可以显著生长。抑制浓度是野生型不能充分生长所需的氨甲蝶呤浓度。例如图3,显示了在氨曱喋呤浓度为1.25,1.5,2.0和2.5毫克/升下，野生菌抹生长率基本为0(n<0.05h—i),而叶酸高产菌株具有0.lp/小时以上的生长率，尤其达到约0.15^/小时。生长培养基不应该补充叶酸依赖型代谢物，因为当它们存在的时候，观察到菌株对氨甲喋呤的耐性没有明显差异，这可能是因为野生菌抹可以通过利用培养基中的叶酸代谢产物来补偿叶酸的不足。例如适宜的生长培养基为改良化学合成培养基，其中不含甘氨酸、肌苷、乳清酸、胸腺嘧啶脱氧核苷、鸟嘌呤、腺。票呤、尿嘧啶和黄嘌呤。生长率可以通过不同方法测定。例如在特定时间点，检测接种了该菌抹或分离菌抹培养基的分光光度值，就可以计算出生长率随时间的变化规律。与野生型菌株相比，优选包含细胞内和/或细胞外叶酸含量高的突变菌抹。与野生型相比，优选细胞内叶酸的总量比野生型菌抹细胞内叶酸的平均量至少高约4°/。，5%,10%:15%,20%,25%，30%,40%,50%,更优选至少高约60%,63%(或更高)。在某些菌种中，野生型菌林的细胞内叶酸水平具有显著的差异。优选分析许多不同野生型菌抹(例如2，3，4,或者更多菌抹)的细胞内叶酸水平，并计算其平均叶酸水平。测定分离株或菌株的细胞内或细胞外叶酸的总量并通过本领域内已知的方法定量，如Sybesma描述的干酪乳杆菌(L.casei)微生物学测定方法(见例1.3),或通过HPLC或其他已知的方法分析其变异体。例如微生物检测可以用指示菌(如干酪乳杆菌)，它可以利用测试菌产生的叶酸生长。如果测试菌产生大量的叶酸，指示菌就会生长的好，因此生长一定时间后，光密度检测就会很高。与此相反，如果测试菌产生叶酸的量较低，就会检测到较低的光密度值。突变菌株优选自发(自然)突变体，例如它是由用本发明的方法筛选出来的(见下文)。该菌株可以是对氨曱喋呤天然敏感的任何种的野生型菌林，如植物乳杆菌(L.plantarum)、干酪乳杆菌或乳酸菌的其他种。对氨曱喋呤敏感意味着，该菌株在缺乏叶酸依赖型代谢物的培养基上生长时，可以被至少1.25毫克/升的氨曱喋呤充分抑制。该菌种是否对氨甲喋呤敏感可以通过让该菌在含有补足了氨曱喋呤的培养基和缺乏叶酸依赖型代谢物的培养基上生长而方便的检测出来。该菌优选食品级菌，而且在本发明的一个实施例中，该菌是从包括乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属和链球菌属的组中选出的一个种。该菌优选食品级的乳酸菌。该菌可以从下面的一组菌中挑选，罗伊氏乳杆菌(Lactobaci1lusreuteri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、嗜酸乳杆菌(L.acidophi1us)、巻曲乳杆菌(L.crispatus)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、干酷乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、副干酷乳杆菌(L.paracasei)、鼠乳杆菌(L.murinus)、唐氏乳杆菌(L.jensenii)、唾液乳杆菌(L.saiivarius)、小乳杆菌(L.minutis)、短乳杆菌(L.brevis)、鸡乳杆菌(L.gallinarum)、淀粉乳杆菌(L.araylovorus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸明串珠菌(Lc.lactis)、有害片球菌(Pediococcusdamnosus)、乳酸片球菌(P.acidilactici)、小片球菌(P.parvulus)、两岐双岐杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、长双岐杆菌(B.longura)、婴儿双岐杆菌(B.infantis)、短双岐杆菌(B.breve)、青春双岐杆菌(B.adolescente)、动物双岐杆菌(B.animalis)、鸡双岐杆菌(B.gallinarum)、马格南双岐杆菌(B.magnura)和嗜热双岐杆菌(B.thermophilum)。在另一个实施例中突变菌抹是具有高叶酸且对氨甲喋呤有抗性的诱导突变株。这种突变抹可以采用与自然突变株相同的筛选方法(如下文所述)得到，包含除了筛选突变基因步骤前的方法。该突变基因步骤包括一个或多个已知的突变基因方法，如化学和/或物理突变剂处理(如N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍，紫外辐射，咖玛辐射等)。突变后，菌林在含有抑制剂量氨甲喋呤的培养基上生长，分离生长的菌抹，分析其叶酸含量。然而，在另一个实施例中，根据本发明突变菌抹可以通过基因表达模式来鉴定。这一点被下面的发现证实与野生型相比叶酸产量提高至少50%的耐氨甲喋呤植物乳杆菌(L.plantarum)显示基因组中的一个或多个folC基因2倍(或更多倍)过表达。folC基因编码二氬叶酸合成酶。在一个实施例中，根据本发明的菌抹与编码叶酸生物合成途径的酶的一个或多个基因的野生型菌林相比显示过表达。除直接参与叶酸生物合成的基因外，发现下列基因也具有较高的转录水平果糖激酶基因(编码果糖激酶)、丙酮酸氧化酶基因、乳酸氧化酶基因和丙酮酸脱氬酶基因。与野生型相比二幾丙酮磷酸转移酶基因(甘油酮激酶基因)转录水平显著降低。因此，在本发明的一个实施例中，根据本发明的菌抹，编码二氢叶酸合成酶(EC6.3.2.17)、果糖激酶(EC2.7.1.4)、丙酮酸氧化酶(EC1.2.3.3)、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.86)这组基因中的一个或多个基因的mRNA转录水平显著增加。另外，该菌林包含编码二羟丙酮磷酸转移酶(即甘油激酶)(EC.2.7.1.29)的基因的mRNA转录水平显著降低。术语"正调节"或"负调节"指的是与野生型菌林中的基因相比，mRNA转录水平的升高或降低。"显著增强转录水平"指的是与野生型的转录水平相比，mRNA转录量增加至少约2倍，优选至少约3倍，或甚至约4倍或更多。同样，"显著降低转录水平"指的是比野生型mRNA转录量减少至少约2倍，3倍等。一个或多个基因的mRNA转录水平可以用常用分子生物学方法测定和定量，如Northern分析和定量反转录酶(RT-)PCR。由于可以得到这些基因的DNA/cDNA序列信息，因此可以找到适于与靶mRNA或cDNA杂交的引物或探针，并通过常用实验来分析转录水平。例如植物乳杆菌的核酸序列(基因组已经测序)可以用于其他菌种的同源基因的鉴定(如计算分析)，克隆(用基于PCR的方法，基于杂交的方法等)和/或序列测定。根据这些基因或其部分基因的核酸序列设计引物或探针可以用来检测或定量靶基因。可选择的，转录模式也可以作为选择标准(上面提到的一个或多个基因增强或减少的转录水平)。例如首先用初筛来改变细菌的表达水平，然后再用氨曱喋呤抗性和/或叶酸水平分析(如下文所述)。同样，也可以用作下面方法中讲到的附加的筛选或选择步骤(例如在步骤(b)和步骤(c)之间或步骤(d)之后，或者甚至取代步骤(a)和(b))。通过用植物乳杆菌WCFS1的全基因组DNA芯片，比较了所描述的氨曱喋呤抗性菌抹(植物乳杆菌NIZOB2550)与亲本菌抹(植物乳杆菌WCFS1,其全序列保存在EMBL数据库，登记号为AL935263)的转录模式。提取亲本菌林和氨甲喋呤耐性突变抹的总mRNA,然后用反转录酶处理合成焚光标记cDNA。差异标记亲本菌林和突变抹，然后标记cDNA的混合样品与DNA芯片杂交，以检测突变菌林与植物乳杆菌亲本菌抹的所有基因的mRNA的相对丰度。根据布达佩斯条约，在一个实施例中，突变菌抹保存在NIZO食品研究所P.O.Box20，6710BAEde,荷兰CBS,其CBS登记号为CBS117120(CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Uppsalalaan8，3584CTUtrecht,荷兰)。本发明的组合物本发明的另一方面涉及含有上述突变菌抹或其衍生物或提取物的组合物，也涉及生产这些组合物的方法。本发明的菌抹在适宜条件下培养，任选从培养基中回收，和任选配制成符合预期用途的组合物。制备这些组合物的方法本身是已知的。优选用突变菌林，其衍生物或其提取物来制备含有天然叶酸的食品或食品添加剂。根据本发明优选的组合物适宜于被主体所消耗，该主体优选人或动物。这些组合物可以采用食品添加剂或完整食品或食品组合物等形式，其中除了本发明的菌抹外还含有适宜的食品基质。此处，食品或食品组合物应理解为不但包括固体和半固体组合物，也包括人和动物用液体食品，如饮料。食品或食品组合物可以是固体、半固体和/或液体食品或食品组合物，而且特别是可以是奶制品，如发酵奶制品，包括但不局限于酸奶、酸奶饮料或酪乳。这些食品或食品组合物可以通过已知的方法来制备，如向适宜的食品或食品基质中添加适量本发明的一个或多个突变菌林。也可以用于制造含有适量一个或多个突变菌抹或其提取物(如部分纯化或完全纯化的天然叶酸)的食品添加剂。食品添加剂包括维生素片，维生素丸，维生素胶囊或维生素粉，其中含有每日推荐用量的各种维生素，包括叶酸。根据本发明使用的这些制品中的合成叶酸通常可以用天然叶酸所取代。在另一个优选的实施例中，用活菌来生产食品或食品组合物，如通过发酵。这样，本发明的菌林就可以用已知的方法来生产这些发酵食品或食品组合物，如利用乳酸菌用已知方法来制备发酵乳制品。在这些方法中，本发明的菌林细胞可以与经常用到的微生物联合使用，和/或取代经常用到的一个或多个或部分微生物。例如在生产如酸奶或酸奶饮料这样的发酵乳制品时，本发明的食品级突变菌林可以添加或用做部分起子培养物，或者适于在发酵过程中添加。这种情况下，菌抹的生长培养基是食品级的培养基，如牛奶培养基。另一个实施例中，使用的本发明菌抹可以是死的(即裂解的)，或没有活性的，或冻干的。根据本发明利用一个或多个突变菌林生产的组合物，或添加了适量的一个或多个菌株的组合物，都含有增强量的由该菌抹产生的天然叶酸。一个或多个高产叶酸的菌林可以混合到或连续加入该组合物中，或者在其生产过程中加入。最终产品中的叶酸总量可以用例如HPLC法分析。本发明的方法和用途氨曱喋呤被用于选择细胞内叶酸水平和总叶酸水平都增加的菌抹。在一个实施例中提供了选择细胞内叶酸水平和/或总叶酸水平都增加的菌抹的方法。该方法包括以下步骤(a)在含有氨曱喋呤的培养基上(或内)培养细菌，其中所述的培养基中没有添加叶酸依赖型代谢产物；(b)选择生长率(p)至少为O.lii/小时的菌抹；(c)测定步骤(b)中所选择菌林中的叶酸水平；(d)和选择其叶酸水平高于野生型或其他合适对照物中的叶酸水平的菌林。(e)任意重复步骤(b)，(c)和/或(d)步骤(a)中的生长意思是菌抹与培养基接触。培养基中含有不同浓度的氨甲喋呤。例如第一轮筛选可以选择相对较低的浓度，如1.25，1.5,2.0,2.5毫克/升培养基。接着可以在一个或多个这些浓度上生长分离的菌抹，可以直接筛选其叶酸含量，也可以再进行一轮或多轮更高浓度的氨曱喋呤选择，如用更高的氨曱蝶呤浓度，如4，5,10毫克/升，或更高。选择过程的严格性可以变化，如只在高浓度有高生长率的分离菌抹进行更严格的选择，或在相对较低氨甲喋呤浓度下具有中等生长速率的分离菌林进行较低严格性的选择。在每个氨甲喋呤选择步骤，优选分离菌抹在培养基上或内生长至少40个小时，更有选生长50小时或更长时间。始终都应该包括合适的对照物，如野生型菌林，根据突变子与对照(如野生型)生长状况的不同来挑选突变株。对照不必要是野生型菌抹，也可以是先前选择的菌林。技术人员可以容易的决定适宜的培养溫度，培养基的适宜pH值和其他参数。实际的培养条件由所用菌抹特性决定。根据所建立的方法，优选可以用如96孔板或其它类似的方式，同时对大量的分离菌林进行筛选。该方法可以用于所有对氨甲喋呤天然敏感的菌抹。如上所述，利用叶酸类似物氨曱喋呤，人们可以有效选择和分离天然叶酸高产菌抹，这些菌抹可以用于生产具有增加叶酸含量(自然强化或发酵强化)的发酵食品。此处包括所有根据本方法可以得到并具有显著提高叶酸水平的细菌。除非其他声明，本发明将采用标准的传统分子生物学、病毒学、微生物学和生物化学方法实施。这些技术在Sa油rook等(1989)分子克隆实验指南(第二版)，冷泉港实验室，冷泉港出版社；Sambrook和Russell(2001)分子克隆实验指南第三版，纽约冷泉港出版社；Ausubel等(1994)的现代分子生物学实验方法，现行方法第一巻和第二巻；Brown(1998)分子生物学实验第二版第一巻和第二巻，学术出版社(英国)；寡核普酸合成(N.Gait编)；寡核苷酸杂交(Hames和Higgins编)中都有描述，此处一并作为参考。图l.在化学合成培养基(CDM)上培养的植物乳杆菌野生型菌抹(1),带有质粒pNZ7019的植物乳杆菌菌抹(2)和带有质粒pNZ7021的植物乳杆菌菌林(3)的叶酸产量。图例细胞外叶酸水平(白条)，细胞内叶酸水平(灰条)，总叶酸水平(黑条)图2.植物乳杆菌野生型菌林(1),带有载体pNZ7019的植物乳杆菌菌林(2)和带有载体pNZ7021的植物乳杆菌菌抹(3)的生长率。用含有浓度为0,0.3125,0.625,1.25,2.5毫克/升的氨曱喋呤的化学合成培养基(a)和改良化学合成培养基(b)测试三种植物乳杆菌的生长状况。图3.根据氨曱喋呤抗性筛选的15抹叶酸高产菌林的产叶酸水平。15株菌株的叶酸产量与野生型菌林叶酸产量相比较。实施例l.材料与方法1.1菌林与培养条件野生型植物乳杆菌WCFS1及其衍生物在含有19克/升(3-磷酸甘油酸盐(6)的化学合成培养基或改良的化学合成培养基上，37。C培养。在这种改良化学合成培养基中，从正常化学合成培养基中去除了甘氨酸、肌苷、乳清酸、胸腺嘧啶脱氧核苷、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤。在使用的所有培养基中另外添加8ng/ml氯霉素。在两种化学合成培养基中加入浓度范围为0-10毫克/升的氨曱喋呤(Sipia,氨喋呤)。1.2DNA技术，质粒构建与转化本研究中使用的质粒见表1。表1<table><row><column>质粒</column><column>相关性质</column></row><row><column></column><column>pNZ8148</column><column>氯霉素抗性；含有nisA基因启动子的诱导表达型载体。</column></row><row><column></column><column>pNZ7019</column><column>氯霉素抗性；pNZ7017衍生质粒，含有乳酸乳杆菌叶酸基因簇，并将其置于p印N基因启动子之后(Wegka即等，应用环境微生物学.2004，70:3146—3148)。</column></row><row><column></column><column>pNZ7020</column><column>氯霉素抗性；pNZ8148衍生质粒，p印N基因启动子取代了nisA基因启动子。</column></row><row><column></column><column>pNZ7020a</column><column>氯霉素抗性；PNZ7020衍生质粒，含有植物乳杆菌folB基因到截短的folP基因的部分叶酸基因簇。</column></row><row><column></column><column>pNZ7021</column><column>氯霉素抗性；pNZ7Q20a衍生质粒，含有folB到f。lP的植物乳杆菌的完整叶酸基因簇。</column></row><table>pNZ8148载体是一个空的载体，其含有乳酸链球菌肽诱导型启动子，一个多克隆位点和一个对氯霉素抗性标记。pNZ8148载体衍生化，并且用已建立的方法分离了植物乳杆菌染色体组DNA。利用PfxDNA聚合酶(Invitrogen,佩斯里，英国)在MastercyclerPCR仪(E卯endorf，汉堡，德国)中进行PCR。PCR反应采用如下的循环94'C变性30秒(第一个循环变性3分钟)，45。C褪火25秒，68'C下每1000个碱基延伸1分钟，以上步骤总共进行30个循环。载体pNZ8148用Sphl和BglII消化，去除乳酸链球菌肽启动子。同时，用Sphl和BglII从载体pNZ7017上切下乳酸乳杆菌pepN基因的组成型启动子(VanAlen-B。errigter等，1991.应用环境微生物学.57:2555-61)。然后将两个片段用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接起来，所得到的质粒命名为载体pNZ7020。用下面的引物从植物乳杆菌染色体DNA上扩增其叶酸基因簇(i)folBKpn-F(5，-GAAAGAGGCTGGGTACCATTATGGGCATGATTC-3，)，它5'端有一个Kpnl限制性位点，延伸覆盖fo旧基因的起始密码子；和(ii)反向引物LpfPxba-R(5'-CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG-3，)，其5，端有一个Xbal限制性位点，从而允许在folC基因终止密码子和载体间进行融合。扩增的DNA片段用Xbal和Kpnl进行消化，从而产生一个截短的folB-folP基因簇(folP有一个Xbal限制性位点)。载体pNZ7020也用Xbal和Kpnl进行消化，然后用T4DNA连接酶将上述两个片段连接起来，得到的载体命名为pNZ7020a。丢失的folP基因片段用下列引物通过PCR进行扩增lpfP-F(5，-CATGGCATCGATATTGAACGAATTG-3，)和lpffxba-R启动子(5，-CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG-3')。扩增的DNA片段用Xbal进行消化。载体pNZ7020a也用Xbal进行消化，然后用碱性磷酸酶(PharmaciaBiotech)磷酸化以阻止自连。两个用Xbal消化过的DNA片段用T4DNA连接酶连接起来，插入片段的方向用PCR进行验证，得到的载体命名为pNZ7021。然后将三个载体，如表l中所示，转入具有ylgG基因的乳酸乳杆菌NZ9000感受态细胞。接着，小量制备这三种载体后，用已建立的方法将其转入植物乳杆菌。1.3微生物学检测叶酸产量三个基因重组植物乳杆菌菌抹的叶酸水平用前面所述的干酪乳杆菌微生物学检测方法(Sybesma等，2003.应用环境微生物学69:3069-76.)进行分析。1.4菌林生长性能检测用微量滴定板检测三个具有不同载体的植物乳杆菌菌林的生长率。用分光光度计(SPECTRAmax,分子仪器公司，太阳谷，加利弗尼亚，美国)检测三抹菌在％孔微量滴定板上35个小时的生长状况。生长状况检测采用两种培养基，每一种构建体在两种培养基上以下列氨曱喋呤的浓度梯度为0,0.3125,0.625,1.25,2.5毫克/升进行三个平行分析。1.5高产叶酸菌抹的选择含有pNZ8148的野生型植物乳杆菌WCFS1在含有2.5毫克/升氨甲喋呤的改良化学合成培养基上培养，但这些生长培养基是装在96孔微量滴定板中的。96孔微量滴定板培养三天后，将每个96孔微量滴定板的部分培养物等量装入两个新的含有10毫克/升氨曱喋呤的改良化学合成培养基的96孔微量滴定板中。每个步骤中，原始的微量滴定板加入60%甘油，在-80℃冰箱保存。甘油保存的微量滴定板用于接种突变的或在新鲜的改良化学合成培养基上适应的细胞。288林氨曱喋呤抗性培养物的叶酸水平用快速筛选法检测。这种方法基于前面讲到的正常微生物学检测方法，但做了一些改变。在这种快速筛选法中，野生型菌林的叶酸产量与突变菌林的叶酸产量相比较。对野生型产生叶酸的指示菌抹的培养会导致相对较低的光密度。高产叶酸菌株的指示菌抹的光密度会比野生型下培养的高。让指示菌林产生较高光密度的菌林用干酪乳杆菌微生物学检测法再进行分析。2.结果2.1重组菌抹在普通化学合成培养基上研究携带pNZ8148质粒和基因构建质粒pNZ7019和pNZ7021的野生型植物乳杆菌菌抹的叶酸产量。含有pNZ8148空载体的植物乳杆菌WCFS1的叶酸产量为100纳克/毫升培养基(图1.)。携带质粒pNZ7019(乳酸乳杆菌叶酸生物合成基因簇)的植物乳杆菌的叶酸产量达到2000纳克/毫升培养基(图1.)。比野生型叶酸产量高大约20倍。用pNZ7021载体转化植物乳杆菌WCFS1得到的菌抹叶产生6000纳克每毫升培养基的叶酸产量，其中pNZ7021载体携带有植物乳杆菌的叶S吏合成基因簇(图1.)。接着，在有叶酸依赖型代谢产物和没有叶gi依赖型代谢产物的化学合成培养基上，在一定氨曱喋呤浓度范围内，比较叶酸高产菌林和野生型菌抹的特定生长率(图2.)。在叶酸依赖型代谢产物存在下，测试菌抹均不被氨曱喋呤显著抑制。在所有的氨曱喋呤浓度下，携带pNZ7021质粒的植物乳杆菌的生长率与其他两个菌抹相比较低。培养基中不存在叶酸依赖型代谢产物的情况下，情况完全不同。在该培养基上，叶酸高产菌株与野生型相比明显具有氨曱喋呤抗性(图2b.)。当改良的化学合成培养基中含氨曱喋呤浓度为2.5毫克/升时，观察到野生型菌抹生长被完全抑制，而两个叶酸高产菌林在该培养基上生长良好。在氨甲喋呤浓度为0到2.5毫克/升之间时，观察到野生型植物乳杆菌菌抹的生长抑制与氨曱喋呤的剂量相关。这些结果表明，如果在合适的培养基上进行分析，叶酸高产菌抹具有氨甲喋呤抗性。因此氨甲喋呤可以用于区别野生型菌林与叶酸高产菌抹。2.2野生型菌株野生型植物乳杆菌WCFS1在含有2.5毫克/升氨甲喋呤的改良化学合成培养基上培养时间延长(大于40小时)，结果其培养物显著生长。如果该培养物用含有2.5毫克/升氨曱喋呤的新鲜改良化学合成培养基稀释，结果培养物立即生长。从该培养物中挑取单菌落来检测该自然突变林是具有增强的氨甲喋呤抗性还是发生了暂时适应性。在含有2.5毫克/升氨甲喋呤改良化学合成培养基中接种从氨甲喋呤抗性培养物中挑取的单菌落。然后，将生长培养基分成两部分；一个培养物在含有2.5毫克/升氨甲喋呤改良化学合成培养基上培养50代，另一个培养物在不含氨曱喋呤的改良化学合成培养基上培养50代。培养50代后，两个培养物重新转移到含有2.5毫克/升氨曱喋呤改良化学合成培养基上培养。不同处理的两个培养物在此培养基上都有相当的生长率，这显示氨曱喋呤抗性表型是有稳定突变引起的。我们从含有2.5毫克/升或10毫克/升氨曱喋呤的培养物中挑取了288个菌落。用快速前筛选方法，分析了这些菌落的叶酸高产水平。通过这种快速检测，与野生型相比，288个菌落中的5个具有较高的叶酸水平。接着，这5个培养物接种于含有2.5毫克/升氨曱喋呤改良化学合成培养基平板上。每个平板上分离三个单菌落，保存菌林并用下面的方法进行叶酸产量分析。检测15个阳性菌落培养物的叶酸水平(图3.)。其平均叶酸水平比野生型高20%到60°/。。为了确证所有的菌落都是植物乳杆菌，用RAPD对其进行了分析。所有的被检菌落都与其亲本具有高度相似性。2.3转录模式利用全基因组转录模式分析寡核普酸芯片技术，鉴定了氨甲喋呤抗性突变林植物乳杆菌NIZOB2550(从植物乳杆菌WCFS1衍生而来)中，与野生型相比明显被上调或下调的基因。用改良化学合成培养基培养植物乳杆菌WCFS1和NIZOB2550,且浊度(OD6oo)为l时，收获细胞，提取mRNA。mRNA样品处理后，用于DNA芯片分析。与父本菌抹相应基因比较，氨甲喋呤抗性菌林表达基因表达过程中，特异性mRNA的相对丰度成倍改变。转录分析显示与父本菌林相比，氨曱喋呤抗性菌林编码二氢叶酸合成酶的基因folCl,与野生型相比明显上调4倍(见表2.)。二氪叶酸合成酶将谷氨酸偶联在二氢蝶酸上形成二氢叶酸，二氢叶酸是氨甲喋呤的结构类似物，也是二氢叶酸还原酶的底物。通过folQ基因的过表达，产生较多的二氢叶酸合成酶，导致较高的细胞内二氢叶酸水平，从而反过来与氨曱喋呤竟争二氢叶酸还原酶。这显示了突变抹中的氨曱喋呤抗性机制，也可以解释为什么在氨曱喋呤不存在的时候这些突变抹产生较高水平的叶酸。植物乳杆菌WCFS1有两个folC基因(folCl和folC2)。有趣的是，在氨曱喋呤抗性突变林中只有folCl被上调。这个基因不位于功能基因簇中。与此相反，foia位于叶酸生物合成基因簇中。除了folC，在氨曱喋呤抗性菌林中，一些其它代谢基因(编码果糖激酶，丙酮酸氧化酶，6-磷酸-p-葡萄糖苦酶的基因)也被上调了(见表2.)。与父本菌抹相比，在突变菌株中，编码甘油酮激酶(二羟基丙酮磷酸转移酶)的三个基因(daklA,daklB和dak2)被下调了。表2.与植物乳杆菌WCFS1相比，植物乳杆菌NIZ0B2550中被上调或下调的基因。<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>权利要求1.突变菌株，其特征在于，与野生型菌株相比，所述突变菌株的细胞内和/或细胞外叶酸含量提高，且当在含有1.25毫克/升氨甲喋呤和缺乏叶酸依赖型代谢物的培养基上生长时，所述突变菌株的生长率至少为每小时0.1μ。2.根据权利要求1所述的突变菌抹，其特征在于，所述的突变菌林是自发突变体或诱导突变体。3.根据权利要求1或2所述的突变菌抹，其特征在于，与编码叶酸合成途径中的酶的一个或多个野生型基因相比，所述突变菌^^朱显示过表达。4.根据前述任一权利要求所述的突变菌抹，其特征在于，与野生型相比，从用于编码二氢叶酸合成酶，果糖激酶，丙酮酸氧化酶，和6-磷酸-p-葡萄糖苦酶的基因中选择出来的一个或多个基因的表达被上调至少约2倍。5.根据权利要求l,2或4所述的突变菌林，其特征在于，与野生型相比，用于编码二幾基丙酮磷酸转移酶的基因的表达被下调至少约2倍。6.根据前述任一权利要求所述的突变菌林，其特征在于，所述突变菌抹的叶酸总量比野生型菌株的叶酸总量高至少10%。7.根据前述任一权利要求所述的突变菌抹，其特征在于，所述菌林选自植物乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、巻曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠乳杆菌、詹氏乳杆菌、唾液乳杆菌、小乳杆菌、短乳杆菌、鸡乳杆菌、淀^f分乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、肠膜明串珠菌、乳酸明串珠菌、有害片球菌、乳酸片球菌、小片球菌、两岐双岐杆菌、长双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、短双岐杆菌、青春双i咬杆菌、动物双岐杆菌、鸡双歧杆菌、马一各南双歧杆菌和嗜热双岐杆菌。8.植物乳杆菌菌林CBS117120。9.含有根据前述任一权利要求所述的菌林的组合物。10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物可以是食品组合物或食品添加剂组合物。11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述食品组合物是发酵食品组合物。12.利用氨甲喋呤选择细胞内叶酸和总叶酸水平都增加的菌林。13.选择细胞内叶酸和/或总叶酸水平都增加的菌林的方法，所述方法包括如下步骤(a)在含有氨甲喋呤的培养基上或培养基内培养细菌，其中所述培养基中没有添加叶酸依赖型代谢物，(b)挑选生长率至少为每小时o.1μ的菌林，(C)测定步骤(b)中所选菌抹的叶酸水平，并选择与野生型相比叶酸水平提高的菌抹，(d)任意重复步骤(a),(b)和/或(c)。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述培养基含有至少1.25毫克/升氨曱喋呤，且所述菌林在所述培养基上生长至少40小时。全文摘要本发明涉及具有高叶酸水平且耐氨甲喋呤的突变菌株。同时本发明也提供了含有这些菌株的食品或食品添加剂组合物，以及分离这些突变菌株的方法。文档编号C12N1/00GK101203599SQ200680014049公开日2008年6月18日申请日期2006年3月1日优先权日2005年3月1日发明者亨德里库斯·韦格卡朴,威廉·迈因德特·德·沃斯,艾尔特·约翰尼斯·斯密德申请人:荷兰Csm有限公司