专利名称：亚硝酸测定试剂盒及亚硝酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种亚硝酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚硝酸浓度 的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
亚亚硝酸盐主要指亚亚硝酸钠，亚亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒 状，味微咸，易溶于水。外观及滋味都与食盐相似，并在工业、农业、食品、
建筑业中广为使用，由亚亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高。1995年版中华 人民共和国药典对蒸馏水检测增加了亚硝酸盐与亚亚硝酸盐检查。亚亚硝酸 盐可被氧化变为亚硝酸盐，亚硝酸盐在无氧环境中受微生物的作用还原为亚 亚硝酸盐，是致癌物质。
目前有按照国标GB/T 5009.33做成的试剂盒，与标准色卡来比较进行定 量，然而按照国标方法检测亚亚硝酸盐指标，步骤繁琐，而且有些试剂必需 现配现用，费时又费力。它的检测原理在酸性溶液中亚亚硝酸盐与对氨基 苯磺酸作用生成重氮化合物，再与a-萘胺起偶合反应，生成紫红色偶氮染 料，显色深浅与亚亚硝酸盐含量成正比。加入锌粉的目的是将亚硝酸盐还原 成亚亚硝酸盐。
紫外分光光度法的原理亚硝酸根离子在紫外区有强烈的吸收，利用它在 220nm波长处的吸光度可定量测定亚硝酸盐。氯化物在此波长不干扰测定，溶 解的有机物在220nm处也会有吸收，而亚硝酸根离子在275nm处没有吸收。 因此，在275nm处作另一次测量，以校正亚硝酸盐值。紫外分光光度法操作过程简单。
还有利用离子色谱法紫外测定海水中亚亚硝酸盐、亚硝酸盐，这是利用离 子色谱法结合紫外检测的方法。其他还有主要对肉制品、乳制品和蔬菜中亚 亚硝酸盐检测的光度法(格里斯试剂比色法、催化(褪色)光度法、流动注射-分光光度法、顺序注射-分光光度法、导数光度法)、示波极谱法、荧光法等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm 波长处吸光度的变化，得以测定亚硝酸浓度的方法，同时，本发明还将给出 用以实现该方法的亚硝酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分 析仪或半、全自动生化分析仪上进行亚硝酸浓度测定，而且测定速度快、准 确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明亚硝酸浓度测定方法原理如下
亚硝酸+水+辅酶硝酸还原酶硝酸+还原型辅酶 这种方法应用硝酸还原酶(Nitrate reductase; EC 1.7.1.1; EC 1.7.1.2; EC 1.7.99.4)酶促反应连续监测法/终点比色法。硝酸还原酶酶解亚硝酸反应，最 终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸 收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过 测量340nrn处吸光度上升的程度/速度，可以测算亚硝酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明亚硝酸测定试剂盒较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶
硝酸还原酶
3 mmol/L
0000 U/L
本发明的亚硝酸测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、硝酸还原酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、硝酸还原酶。
辅酶、硝酸还原酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双齐U，本发明测定亚硝酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的亚硝酸测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
硝酸还原酶 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度 1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测亚硝酸样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右， 检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出亚础酸的浓度大 小。
实施例二
本实施例的亚硝酸测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂
辅酶
50 mmol/L
3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500 mmol/L
硝酸还原酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，起始吸光度 1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测亚硝酸样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出亚硝酸的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原 体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不
另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法技术的亚硝酸浓度测定方法，其方法原理如下亚硝酸+水+辅酶 硝酸还原酶 硝酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出亚硝酸的浓度大小测定结果。
2. —种亚硝酸测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——^500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L辅酶 1——20mmol/L硝酸还原酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述亚硝酸测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、硝酸还原酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述亚硝酸测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、硝酸还原酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、硝酸还原酶组成。辅酶、 硝酸还原酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述亚硝酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 l"4000mmol/L或0.1Q/o-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法技术的亚硝酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚硝酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、硝酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出亚硝酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/26GK101329262SQ20071002472
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司