融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用的制作方法

专利名称：融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合生物合成，特别是一种融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生 物合成应用。对不同种聚酮类化合物的合成基因簇上游或下游进行抗生素标记，通过细 胞融合技术，可以得到阿维菌素的结构类似物。本发明提供了产生新的抗生素结构类似 物的微生物的方法，可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物、抗生素、 基因或蛋白。
背景技术：
组合生物合成(combinatorial biosynthesis)是一种有针对性的对某些基因进行操作从 而获取大量"非天然"天然性化合物的方法，其研究是建立在各种化合物在生物体内的 生物合成途径的基础之上，是微生物新药研发的新技术之一。聚酮类化合物的组合生物 合成是该技术应用较为深入的领域。组合生物合成方法的可行性最早在Hopwood等人的 工作中得到论证。根据放线紫红素(actinorhodin)的生物合成基因簇，Hopwood等人分 别克隆了部分和全部的这些基因到曼德尔霉素(medermycin)和二氢榴菌素(dihydrogranaticin)的产生菌中。在曼德尔霉素产生菌的转化株5^epto/^cey sp.AM-7161 中，除产生曼德尔霉素外，还产生了大量的新化合物曼德尔紫红素A (mederrhodinA)， 它在放线紫红素的特征基础上额外携带了一个羟基。在二氢榴菌素产生菌的转化株 泣丰o平"v油c，"6er TU22中，也产生了一种新的化合物，二氢榴红菌素(dihydrogranatirhodin)，它在异色满醌体系的不同立构中心上分别拥有放线紫红素和二 氢榴菌素的构象。这次尝试使将天然产物的组合生物合成设想首次变成S^实。在此之后， 文献中不断有大量的涉及面较宽泛的此类例子出现，同时这种方法在实现天然产物的化 学多样性方面也被公认为是一种有用的工具。组合生物合成特别适合实现化学方法难以 达到的分子构建，尤其对于较复杂的结构。特别是在聚酮化合物的研究上， 一方面可以 进行骨架结构改变，例如，更改环体系、链长度或者不同构建模块的合并； 一方面可以 引进外围的改变，如糖基化、氧化和还原、甲基化、异戊二烯化、卤化以及酰基化。近 几年，组合生物合成技术更是不断发展、应用范围不断扩大。两种抗生素阿维菌素(avermectin)，因其独特的作用机制以及高效、低毒、安全 性高和对环境影响小等优点，使得这一大环内酯类抗生素成为目前世界上使用最广泛的 驱线虫和除杀外寄生虫抗生素，特别是该类抗生素在防治节肢动物类寄生虫病方面具有 其它抗生素不可替代的功效。但是，阿维菌素对细菌和真菌无抗菌活性。而红霉素(erythromycin)对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性，对革兰氏阴性菌也有抗菌作用。发明内容本发明的目的在于提供一种融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用。 对不同种聚酮类化合物的合成基因簇上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术， 可以得到抗生素阿维菌素的结构类似物。本发明可以用来寻找和发现可用于医药、工业 或农业的化合物、抗生素、基因或蛋白。本发明的进一步目的在于提供一种产生新的抗生素结构类似物的方法，运用该法可 将不同种抗生素的合成基因簇分别在上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术， 筛选同时具备两种抗性的融合细胞，获得可以产生新的抗生素结构类似物的微生物。可 用于医药、工业、农业的化合物的创新与发展。本发明提供了一种新的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇，编码其生物 合成涉及的基因包括阿维菌素合成基因簇上游处的任一段基因，满足此基因的失活不会影响菌株的生长 发育以及抗生素的生产主要功能；阿维菌素合成基因簇下游处的任一段基因；红霉素合成基因簇下游处的任一段基因，满足此基因的失活不会影响菌株的生长发 育以及抗生素的生产主要功能；卡那霉素抗性基因与氨苄霉素抗性基因。本发明提供了一种新的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇，编码其生物 合成涉及的基因具体如下-1) aver-l: 504bp和aver-2: 507bp，位于阿维菌素产生菌除虫链霉菌OSVre; tofly;ces ove/7w力'fo ATCC 31271)中阿维菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间的相 邻的两段基因；aver-C: 651bp，位于阿维菌素产生菌除虫链霉菌(及^ptowjcejavw w幼7/j ATCC 31271) 中阿维菌素生物合成基因簇下游aveG和yerDl基因之间的一段基因；2) KanS 1278bp，位于pEGFP载体中的卡那霉素抗性基因；插入于aver-l和aver-2 基因之间，作为抗生素标记；3) ery-ORF6: 501bp和ery-ORF7: 438bp，位于红霉素产生菌糖多孢红霉菌 (& cc/ arap7^/ ora e^^raea A-50)中红霉素生物合成基因f夷下游ORF6和ORF7之间的相邻的两段基因；4) Amp、 861bp， 位于pMD18-T载体中的氨苄霉素抗性基因；插入于ery-ORF6 和ery-ORF7基因之间，作为抗生素标记；上述各段基因均通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增获得。构 造所得的两大重组基因分别为"aver-l+ Kanf +aver-2+阿维菌素合成基因簇+ aver-C"(记 作R-1)禾B "红霉素合成基因簇+ery-ORF7+An^ + aver-C+ery-ORF6"(记作R-2)。两大重组基因R-l和R-2的第一次组合交换发生在细胞融合过程中，阿维菌素合成 基因簇和红霉素合成基因簇部分(随机)交换、阿维菌素合成基因簇下游的aver-C和红霉素合成基因簇下游插入的aver-C交换，即进行同源双交换。第一次组合交换后所得重 组基因为"aver-l+ Katf +^"-2+部分阿维菌素合成基因簇+部分红霉素合成基因簇 +ery-0RF7+ Ampr + aver-C (记作R-3 )。由于在阿维菌素合成基因簇和红霉素合成基因簇中含有相似的功能域，重组基因 R-3有再次发生交换的可能性，具体分析如下阿维菌素合成基因簇中，所含功能域有酰基转移酶结构域AT 13个，酰基载体蛋 白ACP13个，酮基合成酶结构域KS 12个，酮基还原酶结构域KR IO个，脱氢酶结构 域DH6个，烯酰还原酶结构域ERO个；红霉素合成基因簇中，所含功能域有酰基转移酶结构域AT 7个，酰基载体蛋白 ACP7个，酮基合成酶结构域KS6个，酮基还原酶结构域KR5个，脱氢酶结构域DH1 个，烯酰还原酶结构域ER1个。以每个功能域发生一次交换计算AT13X7 = 91; ACP 13X7=91; KS 12X6 = 72; KR10X5 = 50; DH6X1=6， ER0X1=0，总计91+91+72 + 50 + 6+0 = 310。从而会 有很多阿维菌素的结构类似物产生。所述的新的抗生素阿维菌素生物合成基因簇的用途，其特征在于，兼具卡那、氨苄 两种抗生素抗性标记，其所在的微生物可产生新的抗生素结构类似物。本发明提供了所述的基因序列与质粒、病毒或表达载体所构建的重组载体。本发明提供了所述的基因序列与质粒表达载体所构建的重组载体pKC1139。本发明提供了基因工程化的宿主细胞是选自所述的基因序列转化或转导的融合细 胞或是用所述的重组表达载体转化或转导的融合细胞。本发明提供了所述的新的抗生素阿维菌素生物合成基因簇的用途，其特征在于，兼 具卡那、氨苄两种抗生素抗性标记，其所在的微生物可产生新的抗生素结构类1以物。本发明制备方法主要是以合成大环内酯类抗生素I型PKS中的典型代表阿维菌素 和红霉素为例。首先，在阿维菌素的合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间插入卡那 霉素抗性基因(Kanf: 1278bp);其次，在红霉素的合成基因簇下游0RF7和0RF6基因 之间插入氨苄霉素抗性基因(Amp、 86bp)和阿维菌素合成基因簇下游aveG和yerD
之间一段约651bp的基因，即aver-C;第三，通过细胞融合技术(放线菌的原生质体融 合操作详见"具体实施方式
"中相关步骤)，使上述两段重组基因进行同源双交换，双抗 生素抗性筛选，选择兼具卡那、氨苄两种抗性的融合细胞，获得可以产生新的抗生素结 构类似物的微生物。本发明与以往的组合生物合成操作相比有所不同，是将重点从抗生素合成基因簇主 体转向其上游或下游基因，通过抗生素标记、细胞融合等操作手段，筛选兼具标记性质 的组合成功的细胞，得到可以产生新的抗生素结构类似物的微生物。由此可见，本发明 应用范围更加广泛，是对组合生物合成方法的一种创新，因而具有较强的创造性和新颖 性，同时具有较好的应用性。本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过改变阿维菌素生物合成的一个或几个步骤而得到新的阿维菌素衍生物。
包含本发明DNA片段或基因可以用来提高阿维菌素或其衍生物的产量。包含本发 明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用来从阿维菌素链霉菌基因组文 库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含有本发明中的部分序列，也包含有阿 维菌素链霉菌基因组中以前邻近区域未克隆的DNA 。本发明所提供的核苷酸序列可以 被修饰或突变，途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位 点特异性突变，不同序列的重新连接，或通过紫外线或化学试剂。
本发明所提供的核苷酸序列可以通过序列的不同部分或其它来源的同源序列进行直 接进化(DNAshuming)。通过缺失或失活来自于相同或不同聚酮合酶系统的一个或多个 聚酮合酶模块、功能域或基因，或者增加一个或多个聚酮合酶模块、功能域或基因而产 生新的聚酮化合物。本发明的序列或至少部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主中表 达以得到修饰的聚酮合酶或更高的生物活性或更高的产量。外源宿主包括链霉菌，大肠 杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物和动物等。
本发明经过细胞融合后，筛选兼具卡那、氨苄两种抗生素抗性标记的融合细胞，所 得菌株的主体应该是阿维菌素的基因。此外，在两种不同抗生素的合成基因簇中有可能发生两次交换，其产生新的抗生素 的可能性非常复杂，理论上应该产生至少千余种的新抗生素。如果再发生多次的交换， 情况会更加的复杂。
类似地，当增加两个类似的参与融合的细胞系，可能产生的抗生素的种类会更多， 有望获得的新的抗生素结构类似物在量上将达到二个飞跃。本发明的核苷酸序列或至少部分序列的片段或模块或功能域或基因可以用来构建聚 酮合酶文库或聚酮合酶衍生物文库或组合文库。阿维菌素生物合成修饰基因的核苷酸序 列提供了通过缺失或改造这些修饰基因而得到阿维菌素衍生物的合成途径。含有本发明 的核苷酸序列或至少部分序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯 片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。本发明的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可 能在去除或替代某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高 了产量或优化蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。通过合适的技术缺失，连接本 发明中的氨基酸序列可以得到新的蛋白或酶，进而产生新的聚酮或相关联的产物。本发 明所提供的氨基酸序列可以用来分离需要的蛋白质并可以用于抗体制备。本发明所提供 的氨基酸序列提供了预测聚酮合酶三维结构的可能。本发明提供一种新的融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用。对不 同种聚酮类化合物的合成基因簇上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术，可以 得到抗生素阿维菌素的结构类似物。本发明可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农 业的化合物、抗生素、基因或蛋白。


图1是本发明产生新的抗生素结构类似物的程序示意图。图2是本发明构建的一种重组质粒pMD18-T一aver/kanR的程序示意图。图3是本发明构建的另一种重组质粒pMD18-T—ery/aver的程序示意图。
具体实施方式
实施例参照附1是本发明产生新的抗生素结构类似物的程序示意图。A、 B:分别为阿维菌素合成基因簇上游的两段基因片段。此基因的失活不会影响菌 株的生长发育以及抗生素的产生等主要功能。用于在基因组中卡那抗性基因的装入。C:为阿维菌素合成基因簇下游的一段基因。用于细胞融合过程中基因组间发生同 源交换。D、 E:分别为红霉素合成基因簇下游的两段基因片段。此基因的失活不会影响菌株 的生长发育以及抗生素的产生等主要功能。用于在基因组中氨苄抗性基因以及"C"基 因的装入。Kan1":卡那抗性基因。抗性标记，用于重组菌株的筛选。 Am力氨苄抗性基因。抗性标记，用于重组菌株的筛选。步骤1:除虫链霉菌中阿维菌素合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间插入卡那 抗性基因，得到改造后的重组基因组；步骤2:糖多孢红霉菌红霉素合成基因簇下游ORF7和ORF6基因之间插入氨苄抗 性基因和"C"基因，得到改造后的重组基因组；步骤3:分别含有上述两步所得两大重组基因组的两个细胞进行融合，基因组之间 发生同M双交换，得到一种新的重组基因组。筛选兼具卡那、氨苄两种抗性的融合细胞， 获得可以产生新的抗生素结构类似物的微生物。图2是本发明构建的一种重组质粒pMD18-T—aver/kanR的程序示意图。 '步骤1:将两端含有限制性酶切位点《戶I和及卵H I的Kanr基因连于pMD18-T载 体的相应位置；步骤2:将连于pMD18-T载体上的aver-l基因应用限制性内切酶(￡coR I和《戸 I )进行双酶切，与被同样双酶切的连有Kanr基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；步骤3:将连于pMD18-T载体上的aver-2基因应用限制性内切酶(尸W I和历"dIII) 进行双酶切，与被同样双酶切的连有KaniP aver-l基因的pMD18-T载体发生粘性末端 连接。图3是本发明构建的另一种重组质粒pMD18-T一ery/aver的程序示意图。 步骤1:将两端含有限制性酶切位点I和Prf I的aver-C基因连于pMD18-T载体的相应位置；步骤2:将连于pMD18-T载体上的ery-0RF6基因应用限制性内切酶(五coR I和A^w I )进行双酶切，与被同样双酶切的连有aver-C基因的pMD18-T载体发生粘性末端连 接；步骤3:将连于pMDI8-T载体上的ery-ORF7基因应用限制性内切酶(尸W I和历"d III)进行双酶切，与被同样双酶切的连有aver-C和ery-ORF6基因的pMD18-T载体发生 粘性末端连接。一、有关阿维菌素合成基因簇的操作(参照附图2)1 、从阿维菌素产生菌除虫链霉菌0S^'e/7tow少cM aw,w〃,fe ATCC 31271)中PCR扩增 阿维菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间相邻的两段基因，记作aver-l: 504bp和aver-2: 507bp以及下游aveG和yerDl之间一段约651bp的基因，记作aver-C① 按照《分子克隆实验指南》，从阿维菌素产生菌幼^to"^c" ATCC 31271中提取总DNA;② 根据已知的阿维菌生物合成基因簇序列(GenBank数据库登录号AB032524)， 在阿维菌素生物合成基因簇上游附近基因内设计两对引物aver-l: 504bp引物-averl-l: 5'_~^3': CAG/AATTC GTG CGT AGC TCT GCC ATC TCEcoRl位点用下划线表示引物-averl-2: 5'—~^3': GCGGTAC/C TGC CCC GGATGG CGG TCC AC 《p7I位点用下划线表示 'aver-2: 507bp引物-aver2-l: 5'—~^3': GCCTGCA/G CGG ATG TCT CCAGGA AGG AA/^I位点用下划线表示引物-aver2-2: 5'—~^3': CCA/AGCTT CTG CAG TAC GCC GAG GGG TT历力din位点用下划线表示aver-C: 651 bp引物-averC陽l: 5'_~^3': GCG/TCGAC AAG GCC ACG GTC GAC GAG GC&/1位点用下划线表示引物-averC-2: 5'—~^3': GCCTGCA/G CCG GCG TTACAA AAG GTC CC/^I位点用下划线表示③ 按照以下体系与条件进行PCR反应反应体系如下MgCl23^iL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0单， 上、下游引物各1(JL，模板DNA1.5^L，加去离子水至总体积为50^L 反应程序如下阶段 步骤1 步骤2 步骤3 步骤4温度与时间循环个数95 °C 5min94°C lmin; 60°C lmin; 72°C lmin 94°C 30sec; 62°C lmin; 72°C lmin3个 27个72 。C lOmin2、 从pEGFP载体中PCR扩增卡那霉素抗性基因(Kanf: 1278bp)① 根据已知的pEGFP-Nl载体序列(GenBank数据库登录号U55762),对目的基因 设计两对引物Kanr: 1278bp引物-KanM: 5'—~^3': CGGGTAC/C TTC AAA TAT GTA TCC GCT CA《/w I位点用下划线表示引物-Kanr-2: 5'—~^3': CCG/GATCC TTAGAA CCC CAG AGT CCC GC 万awHl位点用下划线表示② 按照以下体系与条件进行PCR反应 反应体系如下.-MgCl23|iL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8|i， Taq酶0.5^L， 上、下游引物各1^L，模板DNA1.5^L，加去离子水至总体积为50pL 反应程序如下阶段 温度与时间 循环个数步骤1 95 °C 5min步骤2 94°C lmin; 51°C lmin; 72°C lmin 3个步骤3 94°C 30sec; 53°C lmin; 72°C lmin 27个步骤4 72°C lOmin3、 PCR产物的测序验证使用由宝生物工程(大连)有限公司购置的琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒将上 述PCR扩增产物回收纯化后送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列 测定，与PCR产物进行比较，验证一致。4、 目的基因的连接与转化① 分别将目的基因(Kan aver-1和aver-2)连于pMD18-T载体上； 将目的基因aver-C也连于pMD18-T载体上，以供后续实验使用；② 将连于pMD18-T载体上的aver-l基因应用限制性内切酶(￡coR I禾B I/w I )进 行双酶切，与被同样双酶切的连有Kanf基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；③ 将连于pMD18-T载体上的aver-2基因应用限制性内切酶(尸W I和H/wdlll)进行双酶切，与被同样双酶切的连有Kalian aver-l基因的pMD18-T载体发生粘性末端连 接；④ 将连于pMD18-T载体上的Kan'以及aver-l/2基因应用限制性内切酶(五coR I和 H/"din)进行双酶切，将含有Kan1以及aver-l/2的这段基因连于与被同样双酶切的 pKC1139质粒上；⑤ 将含有目的基因的pKC1139重组质粒，转化至大肠杆菌ET12567中进行表达， 得到阳性克隆子；⑥ 挑取单菌落(阳性克隆子)摇瓶培养，提取质粒，之后将所提质粒转化至除虫链 霉菌中进行表达，得到阳性克隆子，记作Y-1。上述双酶切反应具有相似的反应体系以及反应程序，具体如下 反应体系质粒DNA16^L，两种限制性内切酶各l&，反应缓冲液2pL 反应程序37'C恒温反应2h之后进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用由宝生物工程(大连)有限公司购置的琼 脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒将所需片段产物回收纯化。上述连接反应具有相似的反应体系以及反应程序，具体如下反应体系外源DNA片段1(^iL，质粒载体DNA2pL， T4 DNA连接酶1^L， 10 X反应缓冲液2.5jjL，加去离子水至总体积为25^L 反应程序16C过夜反应之后加入2.5mL (1A0量)的3MCH3COONa (pH5.2)，再加入62.5^l (2.5倍量) 的冷无水乙醇，-2(TC放置30 60分钟，离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真 空千燥，25 50^LTE Buffer溶解。上述转化反应如下取TE Buffer溶解的溶液10 20pL转化至100pL的感受态细胞 中，涂平板培养，卡那抗生素筛选得到阳性克隆子，挑取单菌落(阳性克隆子)摇瓶培 养，提取质粒后，将所提质粒转化至除虫链霉菌中进行表达，得到阳性克隆子Y-1。 所述反应使用试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。二、有关红霉素合成基因簇的操作(参照附图3)1、从红霉素产生菌&cc/2arapz7;^ora e^^raea A-50中PCR扩增红霉素生物合成基 ,簇下游ORF7和ORF6之间相邻的两段基因，记作ery-ORF6:501bp和ery-ORF7:438bp① 按照《分子克隆实验指南》，从红霉素产生菌&cc/ aro/ 7;^ora eo^raea A-50 中提取总DNA;② 根据已知的红霉素生物合成基因簇序列(GenBank数据库登录号U82823)，在红 霉素生物合成基因簇上游附近基因内设计两对引物ery-ORF6: 501bp引物ery隱l隱l: 5'—~^3': CA2/M11C CCC CGC CAAGCAAGC CGAGTEcoRl位点用下划线表示引物ery-l-2: 5'—~^3': GCGGTAC/C CGG AGG GCG AGT TGAGGT TC A>w I位点用下戈!j线表示 ery-0RF7: 438bp引物ery-2-l: 5'—~^3， GCCTGCA/GGTG AGT TGGAAT CCC CCG CC/^I位点用下划线表示引物ery-2陽2: 5'—~^3': CCA/AGCTT TTAGTC GCG CGC CGG ACG GG^/wdin位点用下划线表示③按照以下体系与条件进行PCR反应反应体系如下MgCl23nL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5^L， dNTP 8^， Taq酶0.5pL， 上、下游引物各1^L，模板DNA1.5pL，加去离子水至总体积为50pL 反应程序如下阶段 温度与时间 循环个数步骤1 95 °C 5min步骤2 94°C lmin; 60°C lmin; 72°C lmin 3个步骤3 94°C 30sec; 62°C lmin; 72°C lmin 27个步骤4 72°C lOmin2、从pUC18载体中PCR扩增氨苄霉素抗性基因(Amp、 861bp)① 根据已知的pUC18载体序列(GenBank数据库登录号L08752)，对目的基因设 计两对引物Ampr: 861bp引物-ampl陽l: 5'—~^3': GGGGTAC/C ATG AGT ATT CAA CAG TTC CG《p"I位点用下划线表示引物-ampl-2: 5'—~>3': GGG/GATCC TTG CCA ATG CTT AAC CAG TG 万"mH I位点用下划线表示② 按照以下体系与条件进行PCR反应 对于Ampr序列的扩增反应体系如下MgCl23piL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5^L， dNTP 8&， Taq酶0.5&， 上、下游引物各lnL，模板DNA1.5^L，加去离子水至总体积为50jiL 反应程序如下阶段 温度与时间 循环个数步骤1 95 °C 5min步骤2 94°C lmin; 51°C lmin; 72°C lmin 3个步骤3 94°C 30sec; 53°C lmin; 72°C lmin 27个步骤4 72°C 10min3、 PCR产物的测序验证'使用由宝生物工程(大连)有限公司购置的琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒将上 述PCR扩增产物回收纯化后送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列 测定，与PCR产物进行比较，验证一致。(图？)4、 目的基因的连接与转化① 分别将目的基因(ery-ORF6和ery-ORF7)连于pMD18-T载体上； Ampf连于pKC 113 9质粒上；aver-C己连于pMD18-T载体上，如前文所述；② 将连于pMD18-T载体上的aver-C基因应用限制性内切酶"a/I和户rf I )进行 双酶切，与被同样双酶切的pMD18-T载体发生粘性末端连接；③ 将连于pMD18-T载体上的ery-ORF6基因应用限制性内切酶(￡coR I和r戸I ) 进行双酶切，与被同样双酶切的连有aver-C基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；④ 将连于pMD18-T载体上的ery-ORF7基因应用限制性内切酶(尸W I和ffi"dIII) 进行双酶切，与被同样双酶切的连有aver-C和ery-ORF6基因的pMD18-T载体发生粘性 末端连接；⑤ 将连于pMD18-T载体上的aver-C和ery-ORF6/7基因应用限制性内切酶(￡coR I和历"dIII)进行双酶切，将含有aver-C和ery-ORF6/7的这段基因连于与被同样双酶 切的pKC1139质粒上；⑥ 将连于pKC1139质粒上的Ampr基因应用限制性内切酶(X戶I和B，H I )进 行双酶切，与被同样双酶切的连有aver-C以及ery-ORF6/7基因的pKC1139质粒发生粘 性末端连接；⑦ 将含有目的基因(Ampr、 aver-C以及ery-ORF6/7)的pKC1139重组质粒，转化 至大肠杆菌ET12567中进行表达，得到阳性克隆子；⑧ 挑取单菌落(阳性克隆子)摇瓶培养，提取质粒，之后将所提质粒转化至糖多孢 红霉菌中进行表达，得到阳性克隆子，记作Y-2。上述双酶切反应具有相似的反应体系以及反应程序，具体如下 反应体系质粒DNA16nL，两种限制性内切酶各ltxL，反应缓冲液2& 反应程序37"C恒温反应2h之后进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用由宝生物工程(大连)有限公司购置的琼 脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒将所需片段产物回收纯化。上述连接反应具有相似的反应体系以及反应程序，具体如下反应体系外源DNA片段10pL，质粒载体DNA2pL， T4DNA连接酶lnL, 10 X反应缓冲液2.5nL,加去离子水至总体积为25nL反应程序16E过夜反应之后加入2.5nL (1A0量)的3MCH3COONa (pH5.2)，再加入62.5^L (2.5倍量) 的冷无水乙醇，-20<€放置30 60分钟，离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真 空干燥，25 50nL TE Buffer溶解。上述转化反应如下取TE Buffer溶解的溶液10 20^L转化至100pL的感受态细胞 中，涂平板培养，氨苄抗生素筛选得到阳性克隆子，挑取单菌落(阳性克隆子)摇瓶培 养，提取质粒后，将所提质粒转化至糖多孢红霉菌中进行表达，得到阳性克隆子Y-2。所述反应使用试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。三、 Y-l、 Y-2细胞的融合操作(放线菌的原生质体融合)将上述两种链霉菌突变株的新鲜斜面孢子接入培养基中，28'C振荡培养48h，再转 接到同一培养基中，继续培养24h，离心收集菌体。先用0.3mol/L蔗糖溶液洗涤2次， 再用培养基洗涤l次，菌体重悬于培养基中，每亳升菌体悬浮液加2 4mg溶菌酶，混 合均匀，置于32'C保温1.5h左右，取样镜检。至菌丝大部分裂解即停止溶菌，用滴管用 力吹吸几次，促使原生质体与残存的细胞壁分离，并使串球状的原生质体分散。然后用 2000r/min离心10min，倾去上清液，以除去多余的溶菌酶。将沉下的原生质体悬浮于5mL 培养基中，用低速离心法(500r/min，离心5min)使残留的菌丝片断沉于管底，将上部 悬液移至另一消毒的离心管，反复几次，即可得到纯净的原生质体。分别吸取0.5mL两亲株的原生质体于同一离心管内混合，加入5mL聚乙二醇(PEG 1000)溶液(42gPEG溶于100mL培养基中，pH=7.2)，小心混匀，置于32'C水浴保温 5min。然后以2000r/niin离心10min，倾去上清液，再用培养基洗涤混合的原生质体1 次，以除去残存的PEG;用培养基作适当的稀释，每只平板涂0.1mL重组子(记作Y-3) 可以通过双抗生素筛选直接检出。四、 含重组子(Y-3)的除虫链霉菌突变株的生长繁殖及新的抗生素结构类t(物的产生 摇瓶培养含重组子(Y-3)的除虫链霉菌突变株。28°C， 220r/min培养。在下列时间 点12小时，16小时，20小时，24小时，36小时，48小时，60小时，72小时，84小 时收集菌体，4000rpm离心IO分钟。蒋菌体放在已称重的恒重滤纸上，置于8(TC，烘 干至恒重。称量菌体质量。可用菌体千重量对生长时间作图，即为菌体的生长曲线。每 一时间点均做三次对照。同时，可运用液相-质谱联用仪器等设备对发酵液产物进行相关 检测。序列表SEQUENCE LISTING<110>天津大学<120>融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用 <130> 20060310 <160> 23< 170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 753 <212〉 DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫f连霉菌) <400> 1atgaccagtg ttcagacgag cgacaactgg ctccggcgtt tccatccggc cgcggaggct 60ccgacgcgac tggtctgctt tccgcacgcg ggcggctcgg ccgcctactt ccacggtgtt 120tcccgtgcgc tctcgccggc cgtcgacgtc ttggcggtgc agtatccggg ccgtcaggac 180cggcggcacg agccgctcat cgacagcatc gacggcctgg ccgcccgggt acgggaggag 240ttggcgccgt ggacggaccg gccgttggcc ctgttcgggc acagtatggg cgccatggtg 300gcgttcgagg tggcgctgcg gctgacggcc gacggcgccg cgccgagcgt gctgttcgcc 360tcgggcaggc gggcgccgtc tcggtaccgc gaggaatccg tacacctcca tgacgatgcg 420ggcatcatgg cggagctgag ccgtctggac ggcaccgata cgcaggtact gaccgatccg 480.gagctgcggg agatggttct tccggcgttg cgcagcgact accgggcggt cgagacgtac 540cgctaccaac cggggccgcc gctgccctgc cccgtggtcg ccctggtggg cgacagcgat 600ccca鄉cca cggtcgscgs ggcccgcgcc tggggcgatc acacggccgg accgttcgaa 660ctctcggtct ttccgggtgg ccacttctat ctcaatgcgc acgcggaagc cgtcacggaa 720ttggtgcgga cgcgactggc gaccatcagg tga 753<210> 2<211> 351<212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌)<400〉 2tcaaggtgac gtaggtgttc accatggcgg agttcagggt cgtgctccag ccgaagtcac 60ccggacccgg cgaggtctct tgctgcgcgc cgcaggccac agcggcagcc ctctcgggtc 120cggcgcggca ccgcactggc ggcgctgtgt gcgctcaccc tcgccgcctg cggcaccgaa 180cgagcgggcg tcagggggcc gaaggccggc cccgcgctcg agacggtgga cacattgcgg 240ctggccttcc tggactcgct gaccaacacg tcccgcgtct tcgcaggtcc ttgacggtct 300 cttgacgaat ccggcggaca tggagggcgg ctgccgggta aggcgcgggg c 351<210> 3<211> 2850<212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫f连霉菌)<400> 3atgcagggag tttcctgtct gcacccccct cggaaaccag aagaactcac gctcgtcgac 60cgggaaacac agttccgcgc gctgcggctg gcccttaccg aatgcgcggc cggcacggtg 120aaactgctcg tcgccgaggg cggaatgggc t跑gaaaga gtacgttcct gggcgaggca 180ctgcacaccg ccgccgcctc cggcttcgcc gtcctgcgtg ccgccgggct tcccgcggac 240caccggcaac ccctcggcgt actgcagcaa ctgctgaacg accccgcccc cgaggacacc 300gcccgcaccg ccgtccgccc catgccggtg caacacgtcc gcggcgccct cgaacgcctc 360gccgccggcg ccccgctggc gatcggcatc gacgacgtac aggacgcgga cccggagtcg 420ctgcactgtc tgatgcgcct cacccgccac tcccccacct cgcggatcct gctgctgtgc 480accgccctgg cgtgcagtcc ggccgccgac ccggtactcg犯gccgagct gatgcgtcag 540accgccttcg aacgcatcac gctggactgc ctgtccctgg acggagtgac cgggctggtc 600tcggaccgct gcgcgcggcc cacggcgccc ccgccggcgg actactgcct gaccgtcacc 660gggggcaacc cgctgctgct g鄉gccctg ctcgaagagc acagcgaggc cgacgccccc 720tcggcacccc gcccggcgga gccctccgcg ctgcactccc cgccgcaggc cgccccgccg 780 cgcccggtcg tcggcggccg cttctaccag tccgtactgg cctgcctgtc ccgcacggag 840acggcgatca ggcagacggc cggcgccctc gccgtcctcg gcgggcgtgc gcgcgccgac 900ctgctccccc aactgctcgg cgcgagtccc gcgtcggtca cccgggggct gcgtgcgctg 960gaggcgacgg ggctgaccac ctccggccgt ttccggcacc cggtggccga ggccgccgcg 1020ctcgacgcac tggacccgag ccgccgtgcc cacctgcacc gccgagcggc ggcgctgcag 1080caccacgacg gcgcggcgcc gcgggacgtc gcccgccacc ttctcgcggc ccgccatgcg 1140gcgggcccct gggcggtgtc cgtgctgcgt gacgccgccg agcagtcgct ggcgcaggac 1200gacgtggcgt cggcggtctc ctgcctggaa ctcgcctacg gggcctgtgt ccgggaacgg 1260gaacgtccgg agatcaggat caggctcgcc gccgctttcg ggcgcaccaa catcgcggtg 1320gcggaagagc acctcgccga cctggtcgcc accttgcggg aaggagaatt gaccggccat 1380cagacggctt tactcgtccc tctgctcgtc aaccacggcc gcctcggcga agcgcgggag 1440gcgatggacc ggctcaacgc cgccgacgac gcgcgcggcc tgtgcgcgga cggcggcttc 1500ccgatggccg ctccgtggcc gtcgaccgca cacctcgccg cacgccgcga tcccgccgcg 1560cgccgcgatc ccggcacccg ccgcgatccc gccgacaagc cgttcctgcc ccggcagtcc 1620ggtgccccgc agccccggcc ggaggacggc cgtggccagc agccgacagc ggccttgtgg 1680gccctgcccg ga犯cggcac cagcgaggcg gccgcacacg ccgcggMca ggtactgcgg H40tcctccccgc tcaccgacag caccctcgtg ctcctggtga acgccgtgcg gatcctcgcc 1800cgcacgggcc ggtacgacac cgcggacatc tggtgccacc gcctgctcgg cgaggccacc 1860cgtcgccgtt gtcccggctg gcaggcgcac ctcctggcgg tgc^ggccga actctcgctg 1920tgccgtggcc tgctcgccga cgccaaggag tgcgcccagc gcgcactgac acacgtaccg 1980gggcacagcc gcagcgtctt cgcgggcggt ccgctggcct gccaggtcct cgcctgcacc 2040gcgatgggac gctacgacga agccacgcaa ctgctcagcc atccggttcc cgaggcgctg 2100ttccacagtg tgtacggcct ggggtacctg cgggcccggg gccatttcca cctggccatg 2160aaccgcctgc ccgccgccgt ccgcgacttc ctcaccgccg gccgggtggc gcgggagtgg 2220ggactggacc atccggtgct gctgccctgg cgtacggacg ccgcggaggc gttcctccgg 2280ctcggggaaa cgaagagggc cgaccaactc ctcaccgaac agctcgtctc cccgcacagc 2340ggcaacccgt acgtccgcgg caccgcgctg cgcctgcggg cccagaccgc ggcgccggcg 2400gaacggctcc ggctgctgag cgaggcggtc agtgacctcc agagctccgg cgaccgcctg 2460gcgctggccc gcgcactggc cgatctcggc gccgcgtatc acagccggaa cgagcccgta 2520cgggcgagcg ccacggtccg ccgcgcctgg cagctggcca aggagtgcgg agcccaggcc 2580ctgtgcgaca gcatcctgcc cagtcgcggc accaaggacc gggggcccga cggaagggcg 2640gccgcgaccg aggccctgct gagcgagtcc gagatgcgag tcgcgacact ggcggcgggc 2700ggcaacacca accgtgagat cgccggccgg ctctgcgtca ccgtcagcac ggtcgaacag 2760catctgacgc gggtctaccg caaactgaac atcacccgcc gcagggagct gccgacccgt 2820ctgcgacacc tcgcggacca ggccaactga 2850<210〉 4<2I1〉 1278<212〉 DNA<213〉 Kanamycin (卡那霉素)<400〉 4ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 60aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 120aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 180accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 240aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 300agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 360gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 420ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 480attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 540acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 600tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg 660gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 720agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 780ccttgctcct gccgagaaag taiccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 840tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 900tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 960gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 1020gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catg跑gaa aatggccgct tttctggatt 1080catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacategcgt tggctacccg 1140tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 1200cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 1260gggactctgg ggttcgaa 1278<2I0> 5<211〉 1194<212〉 DNA<213〉 Saccharopolyspora erythraea (糖多孢红霉菌)<400> 5atgctgttgc actgcgcgca cgcgaggtac gtatggaacc tcgccgtgga gcagcattcg 60cactggcaga agggccgcag gtccgctccc gggtttgccg agcaatgcaa gcagctcact 120gaagcccgcg ctgccagcga gtggttgcgc gctgggaacg tggatgtgca gcagcaagcg 180ctc貼ggact tcgcctecgc caagcaagct cggttcaccc ctggtttcgg tgagccg过ct 240tggcga犯ga agcac汪agca cga鄉cttc cgggtgatcg gaaccgaccg ggtaccagcc 300tgccgagacg acggaacacc gctgctcaac ggcaagggca agcaggtgat gtcccgctcg 360gtggtggtgc ggaaactcaa caaaaactgg gcacaagtca cagtcccagg ctgcggatgg 420gtacggttcc ggctctcccg ccgccaaccg ccggacgcga aaacgttccg ggtgacctgc 480cacaacggtc agtggcacgt tgcgttcgcc gtgatccccg agccgatcga ggcacctggc 540aacggtgaga ccgtgggtat cgaccggggc gtgacgatca ctgcgcacct ctccgacggt 600cgagtgctga actgcccgca gctcaccgcc aaggaacgcg ctcgggttcg taaacaccag 660cgccgtgccg cccgcgcagc caag咖agc cccgccaagc 3agccgagt3 cgccaaggtc 了20gcccagctca gagcgcggga agcgaaccgg cgcaaagact gggcggagaa gaccagcacc 780atgctggcca gcgaattcga tgtcatccgg ttcgaaaaac tcaacatccg caacatgacc 840cgcaccgcgc gcggaaccgt ggctgagccc ggccgcaacg tccgcgtcaa ggccggtctg 900aaccgcagca tccttgcgca gggctggggc atgctgcgat cccgcgccga acac咖gca 960ccaggccggg tcgaagacgt cccggcgccc tacaccagtc tgcgttgcag cgactgcgga 1020tggatcgaga agaactcacg caagagccaa gctgagttcg tctgcgtgtc ctgcggtttc 1080acctgcaacg ctgacctgaa cgcctcgatc aacgtcgcgg caggacatgc cggagggaca 1140 acaacgaccc ctggtcgttc acgtgtccgt gaacctcaac tcgccctccg gtga 1194<210〉 6 <211〉 438 <212〉 DNA<213〉 Saccharopolyspora erythraea (糖多？包红霉菌) <400〉 6gtgagttgga atcccccgcc tccaggcgag ggaggatgtc aaatccagaa gacaccggtg 60gtcttcgacg gggagctgac gctgctgccc atggggcagt acctgcaccg cgccctcggc 120ggcgactacg tcgccctcgc cgccacgcac accggcacca gcgcccccga gatagagctc 180gacgacagca gcgacagcgg cttcgccgtt cgggaggtgg atctgcccgc accggaggac 240ggaagcatcg aggccgcggc cgtcgcggcg cgcatcggaa cgggcctcgt cgacctgcgc 300gcgcaagctc ccggcctgga ccggatccgc tcccagagca cgtggatgcg gacgccgctg 360cgcgacgcgt tcgacgccgt gctcactgtt cccaccgcca ccgcggaagt ctcgacaccc 420cgtccggcgc gcgactaa 43 8<210> 7 <211> 774 <212〉 DNA '<213〉 Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌) <400〉 7atgaccagca actegccccg agcggttctc gccgccgagt ggatcaaggt gtggaccgta 60cgctcgacca gcttcaccct gctgctggcc ttcgtgctca gcaccggcct cggcaccgtt 120gtcgcgttca gctggcgtgg ccacatcgag cgcgtcgtca acttcagtcc gctcttcgcc 180ggcctgtacg gcgtgaccct cgggcagctc gccctcgttg tgttcggcgt cctgctcgtc 240ggctccgagt actcttccgg atcgatccgg acgtcactgt ccgcggtgcc ccggcgtggg 300ctgctctacg gcggcaaggt actggccggc acactggccg ccctcgccgg ctcgacggtc 360accgtgatcg tcacgttcgc gggggcgcag gcggccctcg gcccgtacgg catcacgctc 420actgcgcacg gggtcccggc tgcggtggtc ggcgccattg tctacctgac gctgatctgc 480accttgtcca tggggatcgc ggccatcgtg cgcagctcgg ccatctcgct cggcgtcctt 540ctcccgctgc tgttcctcgg ctcccaggga ctcggcaacg tccccgccct gaagcccgtc 600ctgcagtacc tgcccgacca ggccggcctg gaactgatgc gtattgccgg acctcccggc 660gacggacgct tcggccccga ctacgggccc agcacggctc tcgtcatcct gctggcctgg 720actgccgccg ccctgaccgg cggctacctg gtcctgcgcc gacgggacgc ctga 774<210〉 8 〈211〉 477 <212〉 DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌) <400〉 8cgcctggtcc tccgaactcc ccataggcca ggccgccttc gcgccgccgt ccctctggac 60 ccttgctcgc gggtgcggcg atggccttct cctccggctc gggcggtcaa tccgcccgag 120 ccgtttccgc ggtcaccgca ccgccataca taccggtcac ccggtattcc attcggtgtt 180 gcagcacgcg acccactgcg catcccactc gtgaattgtg gaccgccatc鄉ggcacgg 240 atgtctccag gaaggaactc cttcaccctc gcgaacacca cctcagaatc ccacgatcat 300 cagttaatca tcaaagtcag cgaccttgac actaccccgc ccaccagggc aaattcataa 360 cactgaccat cacctctgat gctgatcaac ccagcccgca cggccgcgac cgcttttgct 420 caagcaatcg aaatccccga gacacgcttt cttggaaaaa ggagaaataa gaacatc 477<210> 9<211〉 1584<212〉 DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌)<400〉 9gtgacacgta ttggattggt cgtcctcgcc ctggccgcgg ccctcgcggc gggcgccgcc 60gcggggtcga tatcgccgtg gtggtggttc gccgccgtcc cactcaccct gct鹏cctg 120ctgggcacgt gggacctttt.gcaacgccgg cattcggtgc tgcgcaacta ccccgtcctc 180gggcacgccc gcttcctcct ggagcggata cgtcccgaac tccagcagta cttcgtcgag 240 cggaacttcg acggccgccc cttcgaccgg gatgtgcgca gcatcgtcta cgagcgggcg 300 aagggtaccg acgccgagca gccgtacggc accgagcagg acgtctacca gcccggctac WOgagttcctga tcccgtcgat ggcgccccgc ccggtgccgc agacgccacc gcgggtgcgg 420atcggcgggc ccgactgcag ccgcccgtac gacatggcgc tgctgaatgt gtcggcgatg 480agcttcggct ccctgtcgtc gaacgcgatt ctcgccctca acgggggcgc cgcggccggg 540ggtttcgccc acgacaccgg cgagggcggc ctgtcggagt accacctgcg tcctggcggt 600gacctcgtct gggagatcgg caccggctac ttcggctgcc ggacccagga cggcgagttc 660gacccgaagg agttcgccga caaggcggcg cacgagcacg tgaagtgcgt gtcgctc汪aa 720ctctcgcagg gcgccaagcc cggcatcggc ggggtgctgc ccgggccgaa ggtcaactcc 780gagatcgcgc gggtgcggga tgtgcccgag gggcggacgg tgatctcgcc tccgtaccac 840cgggagttct ccaccccgcg cgaactcgtc ctcttcatcg ccaggatgcg ggagctgtcc 900ggcggcaagc cgaccggctt caaactctgc ccgggctcgc gccggcagtt cctcgccgtg 960tgcaaggcga tgctggagga gggtacggcc ccggacttca tcatcgtcga cggggccgag 1020ggcggcaccg gcgcggcgcc gctggagttc gccgatcacg tcggcacgcc gctcaccgag 1080gggctgctga ccgtgcacaa cgcccttgtc ggcgcgggcc tgcgcgaccg gatcaggatc 1140ggggcgagcg gcaagatcgc caccggcacc gatctggtca aacgcctgct ccagggtgcc 1200gactacggca acgccgcgcg ggcgatgatg ttcgccgtgg gctgcatcca ggcgcagcgg 1260tgcc3C3cg3 3C3cctgccc C3ccggtgtc 3ccaccc3gg 3cccccggcg tgcccgcgct 1320ctcgacgtcg gtgacaagac gctgcgcgtc cagcgcctcc aggaggcgac cgtggccagc 1380gcgctgcaga tcatggcgtc catgggggtc accgatccct cgcagctgcg tccgcacatg 1440ctccaccggc gtatcgaccc ctacaccgaa cgctcctacg acgagctcta tgagtggctg 1500cggcccgggc agttgctcgc cgagccgccc gctgcctggg cggccgactg gcacgccgcc 1560gaccccgacc gtttcaccgt gtga 1584<210> 10 <211> 28 <212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌) <400> 10cagaattcgt gcgtagctct gccatctc 28<210〉 11 <211> 28 <212> DNA<213> Streptomyces avermitilis(除虫链霉菌) <400> 11gcggtacctg ccccggatgg cggtccac 28<210> 12 <211> 28 <212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌) <400> 12gcctgcagcg gatgtctcca ggaaggaa 28<210> l孑<211> 28<212> DNA<213〉 Streptomyces avermitilis (除虫链霉菌)<formula>formula see original document page 25</formula>cagaattccc ccgcc犯gca agccgagt 28<210> 19 <211> 28 <212> DNA<213〉 Saccharopilyspora erythraea (糖多孢红霉菌) <400> 19gcggtacccg g鄉gcgagt tgaggttc28<210> 20 <211> 28 <212〉 DNA<213〉 Saccharopilyspora erythraea (糖多孢红霉菌) <400〉 20gcctgc鄉t gagttggaat cccccgcc28<210> 21 <211> 28 <212〉 DNA<213> Saccharopilyspora erythraea (糖多孢红霉菌) <400> 21ccaagctttt agtcgcgcgc cggacggg 28<210> 22 <211〉 28 <212> DNA<213> Ampicillin (氨节青霉素) <400〉 22cgggtaccat gagtattcaa catttccg 28<210> 23 <211> 28 <212> DNA<213〉 Ampicillin (氨节青霉素) <400〉 23ccggatcctt accaatgctt aatcagtg 28
权利要求
1. 一种抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇，其特征在于编码其生物合成涉及的基因包括阿维菌素合成基因簇上游处的任一段基因，满足此基因的失活不会影响菌株的生长发育以及抗生素的生产主要功能；阿维菌素合成基因簇下游处的任一段基因；红霉素合成基因簇下游处的任一段基因，满足此基因的失活不会影响菌株的生长发育以及抗生素的生产主要功能；卡那霉素抗性基因与氨苄霉素抗性基因。
2 、 一种抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇，其特征在于编码其生物合 成涉及的基因具体如下-1) aver-l: 504bp禾B aver-2: 507bp，位于阿维菌素产生菌除虫链霉菌(5^印to/^c^ mw7wY/fc ATCC 31271)中阿维菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间的相 邻的两段基因；aver-C: 651bp，位于阿维菌素产生菌除虫链霉菌(5^eptowyce;y mw7mY/fc ATCC 31271) 中阿维菌素生物合成基因簇下游aveG和yerDl基因之间的一段基因；2) Kan': 1278bp，位于pEGFP载体中的卡那霉素抗性基因；插入于aver-l和aver-2 基因之间，作为抗生素标记；3) ery-ORF6: 501bp和ery-ORF7: 438bp,位于红霉素产生菌糖多孢红霉菌 (&cc/zara/ 办印ora e^^raefl A-50)中红霉素生物合成基因簇下游ORF6和ORF7之间的相邻的两段基因；4) Ampf: 861bp， 位于pMD18-T载体中的氨节霉素抗性基因；插入于ery-ORF6 和ery-ORF7基因之间，作为抗生素标记。
3、 一种权利要求1所述的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇构造的重 组基因，其特征在于至少包括R-l : aver-l+Kanr+aver-2+阿维菌素合成基因簇+aver陽C;R-2:红霉素合成基因簇+61^-011 7+ Ampr + aver-C +ery-ORF6;R-3 : aver-l+ KaW +aver-2+部分阿维菌素合成基因簇+部分红霉素合成基因簇 +ery-ORF7+ Ampr + aver-C;所述的阿维菌素合成基因簇和红霉素合成基因簇中的相似功能域如下 阿维菌素合成基因簇中，所含功能域有酰基转移酶结构域AT13个，酰基载体蛋白ACP 13个，酮基合成酶结构域KS 12个，酮基还原酶结构域KR 10个，脱氢酶结构 i或DH6个，烯酰还原酶结构域ERO个；红霉素合成基因簇中，相似的功能域有AT7个，ACP7个，KS6个，KR 5个， DH 1个，ER 1个。
4、 根据权利要求3所述的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇构造的重 组基因，其特征在于所述的重组基因R-3再次发生交换，以每个功能域发生一次交换计 算，可产生的抗生素的种类AT 13X7 = 91; ACP 13X7=91; KS 12X6 = 72; KR10X5 =50; DH6X1=6， ER0X1=0，总计91+91+72+50+6+0=310。
5、 一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的基因序列与质粒、病毒 或表达载体所构建的重组载体。
6、 按照权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的基因 序列与质粒表达载体所构建的重组载体pKC1139。
7、 一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自(a) 它是用权利要求1所述的基因序列转化或转导的融合细胞；(b) 它是用权利要求6所述的重组表达载体转化或转导的融合细胞。
8、 一种根据权利要求2所述的新的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇制备阿维菌素结构类似物的方法，其特征在于包括下迷步骤1)将除虫链霉菌中阿维菌素合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间插入卡那霉 素抗性基因，得到改造后的重组基因组(1)从阿维菌素产生菌5^eptowyc^ flvmm'"fo ATCC 31271中提取总DNA;根据 已知的阿维菌生物合成基因簇序列(GenBank数据库登录号AB032524)，在阿维菌素生 物合成基因簇上游附近基因内设计两对引物aver-l: 504bp弓1物-averl-1: 5'—~^3': CAG/AATTC GTG CGT AGC TCT GCC ATC TC五coRl位点用下划线表示引物-averl-2: 5'—~^3': GCGGTAC/C TGC CCC GGA TGG CGG TCC AC 《iw I位点用下划线表示 aver-2: 507bp引物陽aver2-l: 5'—~^3': GCCTGCA/G CGG ATG TCT CCA GGAAGG AAPrfl位点用下划线表示引物-aver2-2: 5'—~^3': CCA/AGCTT CTG CAG TAC GCC GAG GGG TT历"dIII位点用下划线表示aver陽C: 651 bp引物-averC-l: 5'_~^3': GCG/TCGAC AAG GCC ACG GTC GAC GAG GC&/1位点用下划线表示引物-averC-2: 5'—~^3': GCCTGCA/G CCG GCG TTACAAAAG GTC CCPrfl位点用下划线表示进行PCR反应，反应体系MgCl23pL， 10 Xbuffer (Mg2+free) 5)aL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5pL，上、下游引物各lpL，模板DNA 1.5pL，加去离子水至总体 积为50nL反应程序95。C预变性5min; 94。C变性lmin, 60。C退火lmin， 72。C链延伸lmin， 如此进行3个循环；之后94。C变性30sec， 62。C退火lmin， 72。C链延伸lmin，如此进行 27个循环；最后72'C链延伸10min(2) 从pEGFP载体中PCR扩增卡那霉素抗性基因Kanf， 1278bp; 根据已知的pEGFP-Nl载体序列(GenBank数据库登录号U55762)，对目的基因设计两对引物 *Kanr: 1278bp引物-Kanr-l: 5'—~^3': CGGGTAC/C TTC AAA TAT GTA TCC GCT CAi^p"I位点用下划线表示引物-Kanf-2: 5'—~^3': CCG/GATCC TTA GAA CCC CAG AGT CCC GC BamH I位点用下划线表示进行PCR反应，反应体系MgCl23pL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5pL，上、下游引物各lpL，模板DNA 1.5^iL，加去离子水至总体 积为50pL反应程序95。C预变性5min; 94。C变性lmin， 51。C退火lmin， 72。C链延伸lmin， 如此进行3个循环；之后94。C变性30sec， 53。C退火lmin， 72。C链延伸lmin，如此进行 27个循环；最后72'C链延伸10min(3) 将纯化测序验证后的目的基因Kanf、 aver_i和aver_2基因以及aver-C基因连 于pMD18-T载体上；将连于pMD18-T载体上的aver-l基因应用限制性内切酶￡coR I和《;w I进行双酶 切，与被同样双酶切的连有Kanr基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；将连于pMD18-T载体上的aver-2基因应用限制性内切酶尸W I和///"dlll进行双酶 切，与被同样双酶切的连有Kanf和aver-l基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；将连于pMD18-T载体上的Kanf以及aver-1/2基因应用限制性内切酶￡coR I和///wd III进行双酶切，将含有Kanf以及aver-1/2的这段基因连于与被同样双酶切的pKC1139 质粒上；将含有目的基因的pKC1139重组质粒，转化至大肠杆菌ET12567中进行表达，得 到阳性克隆子；挑取单菌落(阳性克隆子)摇瓶培养，提取质粒，之后将所提质粒转化至除虫链霉 菌中进行表达，得到阳性克隆子，记作Y-l;2)将糖多孢红霉菌红霉素合成基因簇下游ORF7和ORF6基因之间插入氨苄霉素 抗性基因和"C"基因，得到改造后的重组基因组(1)从红霉素产生菌Sacc/wrap/fywora eo^raea A-50中提取总DNA;根据己知的 红霉素生物合成基因簇序列(GenBank数据库登录号U82823)，在红霉素生物合成基因 簇上游附近基因内设计两对引物ery國ORF6: 501 bp引物ery-l-l: 5'—~^3': CAG/AATTC CCC CGC CAAGCAAGC CGAGTEcoRl位点用下划线表示引物ery-l陽2: 5'—~^3': GCGGTAC/C CGG AGG GCG AGT TGA GGT TC/Q^I位点用下划线表示ery-ORF7: 438bp引物ery-2-l: 5'_~^3': GCCTGCA/G GTG AGTTGG AAT CCC CCG CCPWI位点用下划线表示引物ery-2-2: 5'—~^3': CCA/AGCTT TTA GTC GCG CGC CGG ACG GG //z'mini位点用下划线表示进行PCR反应，反应体系MgCl23pL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5nL，上、下游引物各lpL，模板DNA1.5pL，加去离子水至总体 积为50pL反应程序95。C预变性5min; 94。C变性lmin， 6(TC退火lmin， 72。C链延伸lmin， 如此进行3个循环；之后94。C变性30sec， 62。C退火lmin， 72。C链延伸lmin，如此进行 27个循环；最后72'C链延伸10min;(2) 从pUC18载体中PCR扩增氨苄霉素抗性基因Ampf， 861bp;根据pUC18载体序列(GenBank数据库登录号L08752)，对目的基因设计两对引物 Ampr: 861bp引物-ampl-l: 5'—~^3': CGGGTAC/C ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG^Wl位点用下划线表示；引物-ampl陽2: 5'—~^3': CCG/GATCC TTA CCA ATG CTT A AT CAG TG 万amH I位点用下划线表示；进行PCR反应，反应体系MgCl23^L， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5pL，上、下游引物各lpL，模板DNA 1.5pL，加去离子水至总体 积为50pL反应程序95。C预变性5min; 94"变性lmin， 51t:退火lmin， 72。C链延伸lmin， 如此进行3个循环；之后94。C变性30sec， 53。C退火lmin， 72。C链延伸lmin，如此进行 27个循环；最后72"C链延伸10min;(3) 将纯化测序验证后的目的基因Ampr连于pKC1139载体上，将纯化测序验证后 的目的基因ery-ORF6和ery-ORF7基因连于pMD18-T载体上；将连于pMD18-T载体上的aver-C基因应用限制性内切酶1和iV I进行双酶切， 与被同样双酶切的pMD18-T载体发生粘性末端连接；将连于pMD18-T载体上的ery-ORF6基因应用限制性内切酶&oR I和《/ " I进行双 酶切，与被同样双酶切的连有aver-C基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；将连于pMD18-T载体上的ery-ORF7基因应用限制性内切酶iV I和历wdIII进行双 酶切，与被同样双酶切的连有aver-C和ery-ORF6基因的pMD18-T载体发生粘性末端连接；将连于pMD18-T载体上的aver-C和ery-ORF6/7基因应用限制性内切酶五coR I和 历"dIII进行双酶切，将含有aver-C和ery-ORF6/7的这段基因连于与被同样双酶切的 pKC1139质粒上；将连于pKC1139质粒上的Am^基因应用限制性内切酶〖;w I和5amH I进行双酶 切，与被同样双酶切的连有aver-C以及ery-ORF6/7基因的pKC1139质粒发生粘性末端 连接；将含有目的基因Ampr、 aver-C以及ery-ORF6/7的pKC1139重组质粒，转化至大肠 杆菌ET12567中进行表达，得到阳性克隆子；挑取单菌落(阳性克隆子)摇瓶培养，提取质粒，之后将所提质粒转化至糖多孢红 霉菌中进行表达，得到阳性克隆子，记作Y-2;3)将分别含有上述两步所得两大重组基因组的两个细胞进行融合，基因组之间发生 同源双交换，得到一种新的重组基因组，筛选兼具卡那、氨苄两种抗性的融合细胞，获 得可以产生新的抗生素结构类似物的微生物(1) 将上述两种链霉菌突变株的新鲜斜面孢子接入培养基中，28'C振荡培养48h， 再转接到同一培养基中，继续培养24h,离心收集菌体，先用0.3mol/L蔗糖溶液洗涤2 次，再用培养基洗涤l次，菌体重悬于培养基中，每毫升菌体悬浮液加2 4mg溶菌酶， 混合均匀，置于32。C保温1.5h左右，取样镜检；至菌丝大部分裂解即停止溶菌，用滴管 用力吹吸几次，促使原生质体与残存的细胞壁分离，并使串球状的原生质体分散；然后 用2000r/min离心10min，倾去上清液，以除去多余的溶菌酶，将沉下的原生质体悬浮于 5mL培养基中，用低速离心法(500r/min,离心5min)使残留的菌丝片断沉于管底，将 上部悬液移至另一消毒的离心管，反复几次，即可得到纯净的原生质体；(2) 分别吸取0.5mL两亲株的原生质体于同一离心管内混合，加入5mL聚乙二醇 (PEG 1000)溶液，42g PEG溶于100mL培养基中，pH=7.2，小心混匀，置于32。C水浴保温5min，然后以2000r/min离心10min，倾去上清液，再用培养基洗涤混合的原生 质体1次，以除去残存的PEG，用培养基作适当的稀释，每只平板涂O.lmL重组子，记 作Y-3，可以通过双抗生素筛选直接检出；(3) 含重组子Y-3的除虫链霉菌突变株的生长繁殖及新的抗生素结构类似物的产 生摇瓶培养含重组子Y-3的除虫链霉菌突变株，28°C， 220r/min培养，在下列时间点 12小时，16小时，20小时，24小时，36小时，48小时，60小时，72小时，84小时收 集菌体，4000rpm离心10分钟，将菌体放在已称重的衡重滤纸上，置于8(TC，烘干至 衡重，称量菌体质量，用菌体干重量对生长时间作图，即为菌体的生长曲线，每一时间 点均做三次对照；运用液相-质谱联用仪器等设备对发酵液产物进行相关检测。
9、权利要求1-7任一项所述的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成基因簇的用 途，其特征在于，兼具卡那、氨苄两种抗生素抗性标记，其所在的微生物产生的抗生素 结构类似物。
全文摘要
本发明涉及融合阿维菌素及红霉素合成基因簇的组合生物合成应用。编码一种新的抗生素阿维菌素结构类似物的生物合成涉及的基因包括1)aver-1504bp和aver-2507bp，aver-C651bp，Kan^r1278bp，ery-ORF6501bp和ery-ORF7438bp；Amp^r861bp。对不同种聚酮类化合物的合成基因簇上游或下游进行抗生素标记，通过细胞融合技术，可以得到抗生素阿维菌素的结构类似物。本发明提供了产生新的抗生素结构类似物的微生物的方法，可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物、抗生素、基因或蛋白，亦为已知生物活性分子的高产和新微生物农药的创新提供新的技术和手段。
文档编号C12P19/62GK101265473SQ20071005691
公开日2008年9月17日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者乔建军, 玉 兰, 孙艳华, 凡 范, 黄惠娟 申请人:天津大学