专利名称：一种高效降解木质素的菌种及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌种的筛选、纯化和鉴定方法及其应用，特别是涉及高 降解木质素菌种的筛选纯化，以及培养该高效降解木质素菌种的方法及其应用。
背景技术：
木质素是植物中含量仅次于纤维素的一种丰富的大分子次生代谢产物。据 估算，世界每年可由植物产生约600万吨木质素。木质素具有重要的生物学功能。 在木质化过程中，木质素渗入到细胞壁，以提高植物体的机械强度；木质素由于 具有疏水性而有利于疏导组织的水分运输；木质素还有利于植物体抵抗病菌微生 物等不良外界环境的侵袭。然而，木质素的存在并不利于人类的某些重要经济用 途，尤其是在制桨造纸工业中，制浆造纸的中心环节是利用大量的化学品将原料 中的木质素与纤维素分离，纤维素用于造纸，而分离的木质素形成造纸废液，造 成严重的环境污染，且脱木质素的化学药品投入及废液的碱回收处理大大增加了 造纸成本。
在自然界中，大多微生物个体虽然个体微小，但生长旺盛繁殖快，若其具 有降解木质素能力，将能有效的降解木质素。目前发现的能降解木质素的微生物 主要是真菌，根据真菌降解木材时引起其性状变化不同，将它们分为白腐真菌， 褐腐真菌和软腐真菌。白腐真菌降解木质素能力一般高于降解纤维素能力，其他 两种降解木质素能力弱于降解纤维素能力。关于真菌能够降解木质素，大多认为 其能产生能一些降解木质素酶。目前，研究比较多，降解能力较强的酶有三种， 即木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase/Lip)、锰依赖过氧化物酶(Manganases peroxidase/Mnp)和漆酶(lacase)。除了上述3种重要的酶外，其他的如葡萄糖 氧化酶、过氧化氢酶及一些还原酶和蛋白酶等都参与或对木质素的降解有一定的 影响b
近年来，某些真菌降解木质素己开始应用于工业生产和环境处理。如黄原孢毛平革菌和Phlebia brevispora等白腐菌已应用于造纸工业中的生物制浆，生 物漂白等过程。Setliff利用真菌对杨木进行了预处理，结果表明，与未经真菌处 理相比，在盘磨机磨至相同游离度的情况下，杨木可以降低20%的能耗。
用木质素降解菌处理饲料可提高动物对饲料的消化，并且已经突破了秸秆 仅用于反刍动物饲料的禁区，对饲养猪、鸡的实验效果已有报道。而且秸秆可以 转化为有机肥料，但自然转化的过程较长，应用白腐菌可以加快它的转化速度。 此外，木质素降解菌还可以应用于污水处理，土壤恢复等领域。
目前研究及应用的菌种存在对木质素降解的特异性和活性不足等缺点，因 此，筛选产酶量高、抗性强的菌种，从而改进生产工艺是国内外研究的主要热点。 本实验从长白山腐朽的木材中筛选获得了能较强降解木质素的菌种，其在造纸 业，畜牧业，以及环境保护等方面具有很大意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种筛选获得高活性的降解木质素的菌种的方 法，该方法包括利用马铃薯培养基进行培养获得单克隆菌株，而后利用苯胺兰平 板、分光光度计、木质素平板、纤维素培养液以及紫穗槐木材中实际测试从而获 得对木质素降解能力强而对纤维素降解能力弱的菌种。
本发明的另一个目的是提供高活性的降解木质素的菌种，其特征在于生长 繁殖迅速，对木质素降解能力强而对纤维素降解能力很弱。
目前， 一些降解木质素的微生物已开始应用于工业生产和环境处理。如黄 原孢毛平革菌和Phlebia brevispora等白腐菌已应用于造纸工业中的生物制浆, 生物漂白等过程。Setliff利用真菌对杨木进行了预处理，结果表明，与未经真菌 处理相比，在盘磨机磨至相同游离度的情况下，杨木可以降低20%的能耗。用木 质素降解菌处理饲料可提高动物对饲料的消化。而且秸秆可以转化为有机肥料,
但自然转化的过程较长，应用白腐菌可以加快它的转化速度。此外，木质素降解 菌还可以应用于污水处理，土壤恢复等领域。
本发明将取材于长白山的质地松软的腐朽木材用无菌的蒸馏水没过浸泡两 小时，然后将取200微升液体均匀涂到马铃薯培养板(PDA)上，28r培养2 天，选取不同位置的菌落于选择培养基上多次划板传代，获得单克隆菌株。本发明在获得多株单克隆菌株后，继而采用下述方法进行了菌种的筛选， 从而获得了具有高活性木质素能力而对纤维素降解活性低的菌种。
首先使用苯胺兰法初步选择菌种，将菌种分别接种到选择培养板苯胺兰平 板上进行培养，观察不同天数脱色情况，选出脱色能力强的菌种。我们在实验中 以水为空白分别对苯胺兰溶液和未加苯胺兰的选择培养液进行全波长扫描，发现 苯胺兰溶液在625nrn处有吸收峰而未加苯胺兰的培养液在此处无吸收，故选择 625nm测定不同浓度的苯胺兰溶液的吸光度，做出标准曲线，求得线形回归方程。 将不同克隆的菌种接种到含苯胺兰的培养液中，培养五天，测定降解的苯胺兰的 量。选出降解能力强的菌种。
将苯胺兰法筛选出来的菌种接种到以木质素作为唯一碳源的培养基上，观 察不同天数的生长状态，定性的确定其利用木质素的能力强弱。
在此基础上，我们进一步利用纤维素法对菌种进行进一步筛选。将滤纸剪 成0.6cmX1.6cm的滤纸条，加缺碳源的培养液10ml，高压灭菌后，接种有较高 降解木质素能力的菌种，空白管为含滤纸片的培养液，置于28'C摇床里150转 震荡培养，定时观察滤纸崩溃情况，崩解速度越快降解纤维素能力越强，反之亦 然。从而初步获得对木质素降解能力强而对纤维素降解能力很弱的菌种。
在初步获得较理想的菌种后，我们利用紫穗槐木材对我们筛选获得的菌种 进行了实际测试。将紫穗槐枝条去皮，烘干，削成碎片，准确称量，高压灭菌， 接种前几步晒选出来的菌种，空白对照为不接种的菌的紫穗槐，阳性对照为购自 广东微生物所的白腐菌GIM3.383， GIM3.393培养环境保持湿润。对每一菌种降 解的紫穗槐在不同天数时用酸不溶解木质素提取方法提取木质素，计算其降解木 质素以及纤维素的量，筛选出降解纤维素很弱而降解木质素很强的菌种。重复该 实验。
结果显示本发明所获得的菌种具有高降解木质素的活性和很低的降解纤维 素的活性，其性能优于上述购买的对照菌种。本发明的这些研究结果将会为该菌 种在造纸工业中的应用提供基础。
具体实施例方式
以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐 明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。 实施例l:菌种分离与纯化
(1) 培养基的配制
马铃薯培养基(PDA):马铃薯200g去皮，切成小块煮沸30min，然后用 纱布过滤，滤液中再加蔗糖20g，琼脂15g，补水至1000ml。 115。C灭菌20min。
(2) 菌种的分离与纯化
将取材于长白山的质地松软的腐朽木材置于50毫升无菌离心管中，用无菌 的蒸馏水没过浸泡两小时，然后将取200微升液体均匀涂到马铃薯培养板(PDA) 上，28。C培养2天，再从长出的菌中，用接种环挑取不同位置的20-40个菌落至 马铃薯培养基平板划线，将平板置于28'C培养2天，重复该步骤至少2次，获 得单克隆菌株。
实施例2:苯胺兰法初步选择菌种
(1) 苯胺兰平板法真菌降解木质素一般是由于该菌产生了LiP及MnP等 可以降解木质素的酶，这些酶可以使得染料苯胺兰脱色，因此可以用来监测氧化 物型木质素酶，本实验采用苯胺兰平板法对菌种进行初步筛选。将菌种分别接种 到选择培养板苯胺兰平板上进行培养，同时用购于广东省微生物研究所的白腐菌 GIM3.383和GIM3.393为对照，观察不同天数脱色情况，选出脱色能力强的菌 种。
(2) 分光光度计法以水为空白分别对苯胺兰溶液和未加苯胺兰的选择培 养液进行全波长扫描，发现苯胺兰溶液在625nm处有吸收峰而未加苯胺兰的培 养液在此处无吸收，故选择625nm测定不同浓度的苯胺兰溶液的吸光度，做出 标准曲线，求得线形回归方程。因此不同克隆的菌种接种到含苯胺兰的培养液中， 同时用购于广东省卫生研究所的白腐菌GIM3.383和GIM3.393为对照，培养五 天，利用分光光度计较为精确的测定降解的苯胺兰的量，选出降解能力强的菌种。
实施例3:菌种的进一步筛选 (1)培养基
A、选择培养基蛋白胨3g， MgS04.7H20 (X5g,酒石酸铵0. 1 g, KH2P04
60.5g，MnSO4, 0.04g,CuSO4.H2O 0曹g，苯胺兰O.lg,琼脂18g，加蒸馏水至 1000ml 。 115。C灭菌20min。
B、木质素降解培养基木质素lg，酒石酸铵O. 1 g，MgSO40.5g,KH2PO40.5g， MnS04 0.04g, CuS04 .H20 0.007g，琼脂18g，加蒸馏水至1000ml。 115。C灭菌 20min。
C、纤维素崩解培养液KH2P04 2.0g, (NH4)2S04 1.4g, MgS04.7H20 0.3g, CaCl2 0.3g,尿素0.3g,蛋白胨0.5g, FeSO4.7H20 0.005g， MnS04 0.0016, ZnS04 0.0017g， CoCl2 0.002g,加蒸馏水至1000ml ，压力115。C灭菌20min。
(2) 木质素平板法筛选
将苯胺兰法筛选出来的菌种以及GIM3.383和GIM3.393为对照接种到以木 质素为唯一碳源的降解培养基上，观察不同天数的生长状态，按照其生长状态， 定性的确定其利用木质素的能力强弱。
(3) 纤维素法进一步筛选
将滤纸剪成0.6cmX 1.6cm的滤纸条，加纤维素崩解培养液10ml，高压灭 菌后，接种有较高降解木质素能力的菌种，空白管为含滤纸片的纤维素崩解培养 液，置于28'C摇床里150转震荡培养，定时观察滤纸崩溃情况，崩解速度越快 降解纤维素能力越强，反之亦然。选出崩解很弱者以及很强者。'
实施例4:紫穗槐木材中实际测试菌种效能
将紫穗槐枝条去皮，烘干，准确称量，削成碎片，高压灭菌，接种上述实 施例筛选出来的菌种，空白对照为不接种的菌的紫穗槐，阳性对照为购自广东省 微生物研究所的白腐菌GIM3.383， GIM3.393培养环境保持湿润。对每一菌种降 解的紫穗槐在不同天数时用酸不溶解木质素提取方法提取木质素，计算其降解木 质素以及纤维素的量，筛选出降解纤维素很弱而降解木质素很强的菌种。重复该 实验。
实施例5:所获菌种的鉴定
白腐真菌是一种能够引起木材白色腐朽的担子菌，它腐生在木材或树木上， 使木材上出现袋状、片状或者环形的淡色海绵状团块，并因此得名。它能够降解 其他微生物无法或很难降解的污染物，主要是依靠其胞外氧化酶——过氧化物 酶、过氧化锰酶、漆酶氧化降解。(1) 肉眼观察
菌落形态采用在固体培养板上28。C培养四天，肉眼观察菌丝长满平板，相
互交错连接，呈白色絮状；在液体培养液中28°C， 150rpm/min，培养四天时， 白色菌体相互抱团，形成球形絮状物。
(2) 光学显微镜下观察
使用六胺银染色法对该菌染色，光学显微镜观察该菌菌丝构成，粗细均匀， 两侧菌丝壁平行，有横隔，有分枝，呈放树枝状排列。
(3) 酶学的鉴定
过氧化物酶的检测将该菌株接种于选择培养基加苯胺兰的平板上保温培 养3天，菌体及菌丝周围的苯胺兰颜色变浅许多，证明有过氧化物酶存在。
漆酶分析检测将该菌在PDA培养基上培养4天，将0.04 mmol愈创木酚 加入至15mL浓度为95%的乙醇溶液中，滴定至PDA培养基培养的菌落边缘， 经4小时滴定区变浅红色，说明该菌也分泌漆酶。
从菌体形态以及生理生化特征来看来看该菌属于白腐真菌中的担子纲、非褶 菌目，伏革科，显革菌属的黄孢原毛平革菌类。
实验结果
1. 菌种的分离
将质地松软的腐朽木材置于50ml离心管中，用高压过的蒸馏水没过浸泡两小 时，然后蘸取该液体划在马铃薯培养板(PDA)上，30度培养2天，然后在从不 同位置挑菌，划板，培养，再次挑菌，划板，培养，共获得单克隆菌种36株(编 号1-36)。
2. 苯胺兰法初步选择菌种
36株菌种中有8株(序号为l， 2， 8， 15, 18， 21， 28， 34，)培养4天后 就出现脱色环，对照组GIM3.383， GIM3.393在4天时亦可见脱色环，11号在6 天时能出现脱色环，有7株序号为(4， 7， 16, 24， 26， 30， 31)的菌株培养7 天后出现脱色环，有3株(序号为l， 2， 18) 7天时将蓝色脱得很淡。由于未加 苯胺兰的选择培养液以水为空白在625nm处没有吸收峰(图2)，而苯胺兰溶液 却在此处有强吸收峰(图3)，如图l，图2所示，再选择不同浓度的苯胺兰溶液做吸光度标准曲线(图4)，获得线形回归方程yi.l43973x-0.01645相关系数Y 2=0.99198，再将苯胺兰平板法选出9株(1， 2， 8， 11， 15， 18， 21， 28， 34) 脱色能力较强的菌株以及对照组GIM3.383， GIM3.393使用分光光度计法对其不 同时间的脱色能力进行研究，实验结果如表1，从中可以看出7株(1， 2， 8， 15， 18， 28， 34)有较强的降解苯胺兰的能力。
表1 不同时间的苯胺兰法测定的结果
编号 第一天稀释10倍测第三天稀释10倍测第六天稀释10倍测
定OD625/苯胺兰降解定OD62s/苯胺兰降解定OD625/苯胺兰降解
量(Xl(T8mol) 量(Xl(T8mol) 量(Xl(T8mol)
空白0.3931/0.000.3925/0.000.3910/0.003
10.3920/0.000.3228/9.960.1446/35.6
20.3919/0.000.2889/14.820.1257/38.32
80.3920/0.000.3550/5.290.2347/22.17
110.3930/0.000.3825/1.510.2532/20.13
150.3930/0.000.3224/10.160.2321/23.16
180.3929/0.000.3223/10.160.1680/32.38
210.3928/0.000.3820/1.550.2523/20.22
280.3926/0.000.3245/9.800.1824/30.26
340.3927/0.000.3533/5.670.1920/28.89
GIM3.3830.3926/0.000.3531/5.690.179/30.75
GIM3.3930.3928/0.000.3422/7.240.185/29.87
3. 木质素法复筛菌种
苯胺兰紫外法筛选的有较高活力的菌株(1， 2， 8， 15， 18， 28， 34)接种 到木质素作为唯一碳源的降解培基上，培养观察，发现6株(编号为l， 2， 15， 18， 28， 34)生长较迅速，三天就能长满培养皿，证明其降解木质素能力强，能 以木质素作为碳源生长，8号生长缓慢，利用木质素能力差。再将这6株细菌在该 培养基上多次培养驯化。
4. 纤维素法复筛菌种将上述6株菌种(编号为l， 2， 15， 18， 28， 34)接种到含滤纸条及15ml纤 维素崩解培养液50ml离心管中，空白对照为含有滤纸条及15ml纤维素崩解培养 液，培养到第6天时15号的滤纸条出现破溃，8天时较严重破溃，其他的6管的滤 纸条没有变化。
5.紫穗槐木材中实际测试
将l， 2， 18， 28， 34以及购自广东微生物所的GIM3.383， GIM3.393作为阳
性对照接种到2份高压灭菌过的2g紫穗槐木屑中，分别在培养10和40天时采用酸 不溶解法提取其剩余的木质素，计算木质素和纤维素降解率，计算方法是木质 素降解率=(降解前木质素的质量-降解后的木质素的质量)/降解前木质素的质 量X100。/。；纤维素降解率=[(降解前木材的量-降解后的木材的量)-(降解前木 质素的量-降解后的木质素的量)]/木材中纤维素的量X100。/。。从表中可以看出2 号降解木质素能力最强，降解纤维素能力最弱，为最佳降解木质素菌种。
表2菌种对紫穗槐木材中木质素与纤维素降解作用的测试结果
编号IO天时降解的百分比40天时降解的百分比木质素降解率纤维素降解率木质素降解率纤维素降解率
空白0000
129.03%18.84%51.68%29.72%
235.48%14.50%65.17%18.12%
1832.25%23.18%56.17%20.72%
2829.03%23.18%60.68%26.12%
3429.03%21.73%61.80%21.63%
GIM 3.38332.25%18.84%61.79%22.52%
GIM 3.39329.03%24.63%62.92%34.23%
权利要求
1.一种高活性的降解木质素的菌种，其特征在于生长繁殖迅速，对木质素降解能力强而对纤维素降解能力很弱。
2. 按照真菌鉴定的方法，对权利要求l中的菌种进行生理生化鉴定，其中所说的菌种为白腐真菌中的担子纲、非褶菌目，伏革科，显革菌属的黄孢原毛平革菌类。
3. 根据权利要求1中所描述的菌种特征，该菌种可用于造纸原材料的处理，及废水处理等方面。
全文摘要
本发明涉及微生物菌种的筛选、纯化和鉴定方法及其应用，特别是涉及高效降解木质素菌种的筛选纯化，以及培养该高效降解木质素菌种的方法及其应用。
文档编号C12N1/14GK101538536SQ20081005051
公开日2009年9月23日 申请日期2008年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者张新民, 颜炜群 申请人:吉林圣元科技有限责任公司