专利名称：一种核酸等温扩增检测甲肝病毒的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及甲肝病毒或减毒疫苗的RNA扩增检测技术。
背景技术：
甲型肝炎病毒(H印atitis A virus,HAV，简称甲肝)是病毒性甲型肝炎这一传染病的病原体，它属于细小RNA病毒，基因组为一条约含有7400个核苷酸的正链RNA，病毒颗粒呈廿面体结构、大小约27 32nm。甲肝病毒主要经过粪口途径传播，饮水的污染往往是造成甲肝流行的主要原因，在我国成人中HAV感染率约为50 70% ;据卫生部公布资料显示，全国甲型肝炎发病率在16/10万左右，同时甲型肝炎作为一种世界性传染病，全球约40亿人受到其威胁。HAV病毒感染后可在体内潜伏14 45天，其临床症状包括发热、疲倦、恶心厌食和腹部不适等，同时2/3的感染成人会出现黄疸，当HAV急性感染时可能导致人死亡、死亡率为1 3%。。近年来，在我国由于人口流动的增加，加快了甲肝的传播范围和速度，发病特点呈现病毒感染向大年龄推移、易感人群不断累积、甲肝流行危险性增加。目前控制预防甲肝流行的主要手段是使用甲肝减毒活疫苗进行免疫接种预防。
除了 HAV的预防控制，也需要一种灵敏快速的检测方法用于HAV病毒的诊断。目前甲肝病毒的检测方法主要有病毒培养、抗原或抗体检测、RNA检测四种。病毒培养需接种在敏感细胞上，但由于生长缓慢，需3 4周时间，因此不用于临床HAV常规诊断。抗原或抗体检测在临床检测中使用广泛，但由于方法学上抗体需在病毒感染后一段时间出现、并且抗原抗体存在非特异性反应，影响了检测的灵敏度和特异性。HAV RNA检测主要是通过逆转录_聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)技术实现，特别是近年荧光RT-PCR技术的发展，推动了HAV RNA检测的进步。虽然荧光RT-PCR技术检测HAV RNA灵敏度很高，但使用时需要复杂昂贵的循环变温设备，并且对操作人员的技术要求较高，限制了该技术的大规模推广使用。核酸等温转录扩增和纳米金探针检测方法(Nucleic Acid Isothermaland Transcriptional Amplification with GoldNano-particle Probes, NITAG)是一种利用纳米金探针快速检测恒温扩增产物的新型核酸检测技术(原理参见附图1)。具体说来，NITAG技术首先利用一种多酶复合体所具有的逆转录酶、RNase H和依赖DNA的RNA聚合酶活性，在体外等温扩增核酸模板获得大量RNA扩增子，然后纳米金标记的寡核苷酸探针和这些RNA中的靶序列杂交形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网络结构，由此引发纳米金粒子光学性质的变化，产生杂交信号以杂交液/板/试纸颜色变化显示，存在相互作用的杂交液/板/试纸显示为蓝色，没有作用的显示为红色。利用该技术，微量RNA模板可通过等温扩增的模板拷贝数和纳米金探针检测的显色信号双级放大而得到检测，该检测技术具有无需特殊昂贵设备、检测灵敏快速、结果直观可见等优点。目前采用NITAG技术检测HAV RNA的应用尚无公开报道，通过检测可以快速有效地诊断甲肝病毒或其减毒疫苗，具有检测准确灵敏、快速简便的特点。
发明内容
所要解决的技术问题 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于NATAG技术的甲肝病毒或减毒疫苗RNA检测方法和试剂盒，对来自HAV的RNA进行等温扩增和纳米金探针检测。
技术方案 本发明提供一种基于NITAG技术扩增甲肝病毒或减毒疫苗RNA的5'端非编码区(5，-UTR)寡聚核苷酸引物对和探针，其中引物对具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列(SEQ ID N0:25'端含有能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列)；检测探针具有SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的序列(前者5'端和后者3'端分别经过己烷巯基化处理)，捕获探针具有SEQ IDNO :5的序列(5'端生物素Biotin标记)。
SEQ ID N01 :5， —CTTCCAgggCTCTCCCCTTgC-3' 21bp SEQ ID N02 :5， -AATTCTAATACgACTCACTATAggg AAgATCAAAgAggTTCATg-3， 44bp SEQ ID N03 :5， HS-(CH2)6-[gAgCTgTAggAgTCTAAAT] 19bp SEQ ID N04:5， [gACgTCACCTTgCAgTgTT]-(CH2)6_SH 3， 19bp SEQ ID N05 :5' BI0TIN-ggTCAACTCCATgATTAgCAT—3， 21bp 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于85%的序列； 或者上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。 在实施方案中，本发明提供一种基于NITAG技术的扩增检测HAV RNA 的方法和试剂盒，所述方法包括步骤 (1) RNA模板在60 7(TC下解链后降温； (2)加入逆转录酶、RNase H和RNA聚合酶，在引物的引导下于37 42。C进行等温扩增，获得RNA扩增子； (3)利用纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针和生物素标记的寡核苷酸捕获探针检测RNA扩增子，通过在层析膜的显色反应获得检测结果，显色条带的存在是样品中甲肝病毒RNA的指示。 本发明提供一种利用上述检测方法进行HAV RNA等温扩增的检测试剂盒，其组成为NITAG反应缓冲液、纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针、生物素(或地高辛)标记的寡核苷酸捕获探针、以及固定有亲和素(或抗地高辛抗体)标记的层析膜。组装形成的试
剂盒在-2(rc下保存。 具体而言，本发明是通过以下方式实现的 本发明的甲肝病毒RNA NITAG检测技术包括样本处理、RNA等温扩增以及纳米金探针检测三个步骤。样本处理步骤是从甲肝病毒细胞培养物样本中提取RNA模板的过程，扩增检测对象是从样本中提取获得的RNA模板。利用提取获得的甲肝病毒RNA模板经过逆转录酶、核糖核酸酶H(RNase H) 、RNA聚合酶(RNA Pol)等温扩增出的大量RNA扩增子，并结合烷巯基化寡核苷酸标记的纳米金探针检测，通过层析膜显色反应实现对RNA模板的检测。
本发明的等温扩增体系包括RNA模板、引物及缓冲液等组成，检测体系包括纳米金探针、捕获探针及缓冲液等组成，其具体操作为将待测标本提取的RNA置入反应缓冲液，在60 70 (最优选65) t:和37 42 (最优选41) 。C下先后处理5min，加入混合酶，在37 42(最优选41) t:下反应90 120min ;然后再将RNA扩增产物与纳米金检测探针以及生物素标记捕获探针缓冲液混合检测，在37 65t:处理5min冷却后在膜上层析显色。
本发明的等温扩增反应缓冲液各组分的终浓度为20 60mM Tris-HCl (pH8. 0 9. 0)、30 90mM KCl、10 20mM MgCl2、0. 5 5mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 、 1 10mM核糖核苷三磷酸(NTPs)、4 20mM二硫苏糖醇(DTT)、10 20% (v/v) 二甲基亚砜(DMSO);所说的两种引物(包括带有RNA聚合酶启动子识别序列的引物I和第二链cDNA合成引物II)终浓度各为0. 1 1 ii mol/L ;所说的混合酶液各组分在20 P L反应体系中的量为4 75U逆转录酶、8 3000U RNA聚合酶(识别特异启动子序列的T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶)、0. 05 0. 3U RNase H酶、10 50U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)和0. 05 5iig小牛血清白蛋白(BSA)。所说的检测反应缓冲液各组分的终浓度为0.3mol/L NaCl，lOmM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，5iimol/L纳米金探针、liimol/L生物素标记捕获探针。层析膜为固定有亲和素的硝酸纤维膜或尼龙膜(保存于干燥环境)。 本发明所用的纳米金颗粒大小为1 100nm，按照粒径不同可以采用柠檬酸三钠还原法、白磷还原法或者抗坏血酸还原法。 本发明所述纳米金寡核苷酸检测探针的制备过程为 (1)纳米金颗粒的制备在煮沸搅拌HAuCl4溶液(lmM，500mL)回流的情况下，迅速加入50mL 38. 8mM柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色将由灰黄变为深红，继续回流15min，然后冷却至室温，最后用0.45yM的膜进行过滤，即得到约13nm粒径的金颗粒。这种纳米金溶液具有518 520nm处的特征表面等离子体吸收峰。纳米金颗粒上的寡核苷酸探针长度为10 100bp，连接前需要先经过巯基化或烷巯基化处理并纯化。 (2) 3'或5'烷巯基标记的寡核苷酸在纳米金颗粒上的修饰取纳米金溶液5mL(约17nm)2. 50D烷基寡核苷酸探针(由上海生工合成，稀释终浓度3.61ymol/L)混合并孵育16小时左右，然后将混合溶液置于0. lmol/L NaCl， lOmM磷酸盐缓冲液中并保持40小时，接下来在1400r/min至少离心25min以除去未反应的试剂。除去上清液，剩余的红色油状沉淀再用缓冲液清洗，离心后保存在O. 3mol/L NaCl，10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，探针终浓度为10iimol/L。通过红外光谱的测定证明，每个金颗粒表面被修饰了许多探针，因此才有可能在多核苷酸检测过程中形成聚合网络结构。 (3)层析膜的制备将2mg/ml亲和素以2iU/cm的量加到纤维膜或尼龙膜上，在湿度40^、温度4(TC的环境内自然干燥3小时；然后将膜贴于撕去不干胶的硬纸板上，上端用滤纸覆盖层析膜、压紧贴上不干胶固定，最后用割膜机切割成4mm宽的试纸条状备用(保存于干燥环境)。 本发明检测过程中的层析膜显色反应为溶液杂交后层析显色过程。溶液杂交显色法即将等温扩增产物10 ii L(约lOpmol)加入至含有20 ii L纳米金-烷巯基化寡核苷酸检测探针、10ii L生物素化捕获探针的1. 5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65t:，将混合物平衡5min，最后放入层析膜试纸条、经过5 10min后进行观察，如果纳米金探针与扩增产物靶序列杂交，会在膜上形成蓝紫色的条带，表示RNA检测阳性，从而显示甲肝病毒的存在，否则将不会出现条带。
有益效果
本发明建立了利用NITAG技术检测甲肝病毒或减毒疫苗RNA的方法，从原理上分
析，等温扩增和纳米金探针均能放大检测信号，等温扩增放大的是RNA分子的拷贝数，纳米
金探针放大的是显色信号，加上层析步骤使显色的杂交复合物聚集为一个窄小条带，结果
观察更为简便和直观，所以比NASBA扩增后的电化学发光检测技术更灵敏，使实际应用于
HAV RNA检测成为可能；和荧光RT-PCR技术检测HAV比较，其优点在于 (1)由于NITAG技术只能扩增RNA模板，这可以避免荧光RT-PCR扩增DNA产物污
染引起假阳性检测结果的发生。 (2)只需常规水浴等温反应就能实现检测，无需昂贵的循环变温荧光PCR仪器。
(3)检测结果通过显色条带目视可见，非常直观。
(4)由于扩增效率高于PCR反应，并且采用了纳米金信号放大，检测灵敏度较高。
(5)探针无需荧光标记，试剂检测成本较低。 采用本发明技术，甲肝病毒或减毒疫苗的RNA扩增效率、检测灵敏度和特异性大大的提高，并降低了 PCR扩增检测的假阳性率。本发明的技术方案设计合理，样本实验能在分子水平上证明甲肝病毒或减毒疫苗RNA的存在，表明该方法切实可行。基于NATAG技术的甲肝病毒或减毒疫苗RNA检测方法和试剂盒，可以作为评价病毒活化状态的辅助实验手段，具有现实的临床意义和应用价值。
图1为NITAG扩增检测甲肝病毒RNA技术原理示意图
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，Trizol试剂购自Invitrogen公司，限制性内切酶购自上海申能博彩生物公司，逆转录AMV酶、T7 RNA聚合酶、RNase H、RNase Inhibitor和BSA均购自美国Promega公司，引物和探针均由上海生工公司合成。 实施例1甲肝病毒NITAG检测试剂盒的配制和组成 试剂盒组成 (1) 2xNITAG反应缓冲液 每10ii1 2XNITAG反应缓冲液中各组分浓度为80mM Tris-HCl(pH8. 3)、160mMKCl、24mM MgCl2、2mM dNTPs、4mM NTPs、10mM DTT、30% (v/v) 二甲基亚砜(DMSO)、两种引物(SEQ ID No : 1和SEQ ID No :2)各为0. 4 ii mol/L。
(2)混合酶 每5ii l混合酶中含有6. 5U逆转录酶、32U T7RNA聚合酶、0. 1U RNaseH酶、25U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)禾P 2. 1 y g小牛血清白蛋白(BSA)。
(3)探针
6
包括10 ill 4 ii mol/L生物素标记的捕获探针(SEQID No :5) 、20 ii 1纳米金颗粒标记检测探针(SEQ ID No :3和SEQ ID No :4各10 ii 1)。
(4)固定有亲和素标记的层析膜 将2mg/ml亲和素以2 y 1/cm的量加到纤维膜或尼龙膜上，在湿度40% 、温度40°C的环境内自然干燥3小时；然后将膜贴于撕去不干胶的硬纸板上，上端用滤纸覆盖层析膜、压紧贴上不干胶固定，最后用割膜机切割成4mm宽的试纸条状备用(保存于干燥环境)
组装形成的试剂盒在-20 °C下保存。
自备试剂 氯仿、异丙醇、DEPC处理的灭菌双蒸水及用它配制的75%乙醇。
实施例2甲肝病毒培养物的HAV RNA NITAG检测 以下通过介绍甲肝病毒和甲肝病毒减活疫苗提取的RNA NITAG检测来举例说明本发明的实施。 RNA提取:采用甲肝暴发点患者粪便或血清样本、以及甲肝病毒减活疫苗样本，分别取250 ill (粪便取生理盐水漂洗后低速离心上清液)加入500 ii 1 Trizol提取试剂，用移液器反复吹打混匀，室温放置5分钟，加入200ia氯仿，用手来回振荡混匀15秒，室温放置5分钟，4t: 12， OOOrpm离心15分钟，将上清移入新的离心管，加入200 异丙醇，旋涡振荡5秒，冰浴沉淀10分钟，4°C 12， OOOrpm离心10分钟，弃上清，加入500 y 1预冷的DEPC水配制的75%乙醇洗涤，上下颠倒10次，4°C 10， OOOrpm离心5分钟，吸干上清，沉淀室温干燥10-20分钟，加入10 ii 1 DEPC处理的水稀释混匀，立即使用进行NITAG扩增检测。
NITAG扩增检测:取5 y L的提取处理后的RNA模板置入10 y L2x等温扩增反应体系缓冲液，在65"和4rC下先后处理5min，加入5 y L混合酶液，在41。C下反应120min ;取10 L等温扩增产物加入至含有20 L纳米金-烷巯基化寡核苷酸探针、10 P L生物素化捕获探针的1. 5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65t:，将混合物平衡5min，最后放入层析膜试纸条、经过5 10min后进行观察，层析膜上形成蓝紫色的条带，说明甲肝病毒或减活疫苗RNA检测阳性。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉上海复星医药(集团)股份有限公司
上海复星医学科技发展有限公司
吴大治，夏懿 〈120〉 一种核酸等温扩增检测甲肝病毒的方法及试剂盒 〈130>HAV RNA 〈140>CN 〈141>2008-10-10 〈160>5 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>21
〈212>DNA
<213>Hepatitis A virus〈400>1
cttccagggc tctccccttg c 〈210〉2 〈211>44 〈212>DNA 〈213〉H印atitis A virus 〈400〉2 aattct朋te cgactcacte taggg朋gat c朋agaggtt catg 44 〈210>3 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉H印atitis A virus 〈220〉 〈221〉己烷巯基 〈222>(1). . (17) 〈223>y = HS-(CH2)6_ 〈400>3 ygagctgtag gagtctaaat 20 〈210>4 〈211>20 <212>DNA 〈213〉H印atitis A virus 〈220〉 〈221>己烷巯基 <222>(1). . (16) 〈223>y = - (CH2) 6-SH 〈400>4 gacgtcacct tgcagtgtty 20 <210>5 〈211>22 〈212>DNA 〈213〉H印atitis A virus 〈220〉 〈221〉生物素 〈222〉 (1) (19) 〈223>y = biotin- 〈400>5 yggtcaactc catgattagc at 2权利要求
一种甲肝病毒(HAV)核酸等温扩增检测方法，采用逆转录-转录和纳米金探针检测层析杂交原理，其扩增对象为从HAV中提取的RNA模板；其特征在于，RNA模板通过采用逆转录酶、核糖核酸酶H以及RNA聚合酶等温扩增，产生的大量RNA扩增子和纳米金颗粒标记的检测探针、生物素(或地高辛)标记的捕获探针结合形成杂交复合物引起光学性质变化，最后该复合物和固定在层析膜上亲和素(或抗地高辛抗体)结合形成显色检测条带。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，采用了扩增HAV靶基因的寡聚核苷酸引物和探针 引物具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列，其中SEQ ID NO :25'端含有RNA聚合酶识 别的启动子序列；检测探针具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO :4序列；捕获探针具有SEQ I D NO :5序列。这些引物和探针或者是包含有上述序列的向5'端或和3'端延长的序列；或者 与上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其步骤依次包括(1) RNA模板在60 7(TC下解链后降温；(2) 加入逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶，在引物的引导下于37 42。C进行等 温扩增，获得RNA扩增子；(3) 利用纳米金颗粒标记的寡核苷酸探针检测扩增子，并被生物素标记寡核苷酸探针 结合捕获，通过层析膜上的条带显色反应获得检测结果。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的逆转录酶为鸟成髓细胞瘤病 毒逆转录酶或鼠白血病病毒逆转录酶；所说的RNA聚合酶为T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。
5. 根据权利要求1和5所说的检测方法，其特征在于，所说的T3RNA聚合酶所识别特异 性启动子序列为5'AAT TCAATT AAC CCT CAC TAAAGGG3';所说的T7RNA聚合酶所识别特异 性启动子序列为5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG G3'。
6. 根据权利要求l所述的检测方法，其特征在于，所用的纳米金颗粒直径为1 100nm，纳米金颗粒上的寡核苷酸探针SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4长度为10 lOObp，且 连接前经过巯基化或烷巯基化处理；所用的捕获探针SEQ ID NO :5长度为10 50bp，其5' 端可为生物素或地高辛标记。
7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所用的固定有亲和素或抗地高辛抗 体(对应于捕获探针5'端标记生物素或地高辛)的层析膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的显色反应为杂交后在层析膜 上出现蓝紫色显色条带。
9. 一种利用权利要求l所述检测方法组装的试剂盒，其组成为包含有引物I和II、逆 转录酶、核糖核酸酶H、 RNA聚合酶的反应缓冲液、纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针、生 物素(或地高辛)标记的寡核苷酸捕获探针、带有亲和素(或抗地高辛抗体)标记的层析 膜。
10. —种利用权利要求1所述检测方法组装的甲肝病毒核酸等温扩增检测试剂盒，可 以用于甲肝病毒或甲肝减毒疫苗中分离的RNA检测。
全文摘要
本发明涉及一种核酸等温扩增检测甲肝病毒(HAV)或减毒疫苗的方法及其试剂盒，检测步骤依次包括甲肝病毒RNA模板在60～70℃下解链后降温；加入逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引导下于37～42℃进行等温扩增，获得RNA扩增子；然后利用纳米金探针和捕获探针检测扩增子，通过层析杂交显色反应获得检测结果。杂交膜出现显色条带为RNA阳性，无条带为阴性。采用本方法的试剂盒可快速准确地检测甲肝病毒或甲肝减毒疫苗中的RNA。
文档编号C12Q1/70GK101760562SQ20081020168
公开日2010年6月30日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者吴大治, 夏懿 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星医学科技发展有限公司