专利名称：：荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子遗传学领域，涉及荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记及其应用。
背景技术：
：奶牛在高温(高湿)环境下可产生一系列的生理反应，出现热应激期现象，表现为食欲下降，采食量减少；体温升高，呼吸加快；营养物质吸收和利用率下降；机体内分泌机能紊乱，导致母牛泌乳量明显下降，发情周期延长，发情时间縮短，造成母牛受胎率降低和出现死胎；公牛精子质量恶化，繁殖力降低；还可使奶牛体内免疫球蛋白减少，机体抵抗力降低，使乳房炎、子宫内膜炎、胎衣不下等产科疾病发病率增高，对奶牛以后的繁殖及各种生产性能影响极大，严重者可至死亡，给养殖者带来巨大经济损失。通常将奶牛在高温环境下的呼吸频率、体温(直肠温度)升高和产奶量的下降作为评定奶牛热应激反应强弱的指标。动物的抗热应激的能力与物种、品种和个体有关。在奶牛品种中，娟姗牛的耐热能力强于荷斯坦牛；荷斯坦牛不同的品系和个体，其耐热能力也有明显的差异如以色列培育的荷斯坦牛的耐热能力强于原产地的奶牛，而即使在同一地区、同一群体，有些奶牛对高温的耐受性明显强于其他牛只，表现为对热应激的反应不明显，体温(直肠温度)、呼吸频率的上升不高，而生产性能的下降较少或不下降。研究证明，这种差异的本质是个体(在不同种群间是群体)的遗传上的差异，且热应激反应可能是一个数量性状。发现与该数量性状连锁的分子遗传标记，就能够选育出耐热奶牛个体(群体)，从而提高奶牛的抗热应激能力和生产力。热休克蛋白是一种与热应激有关的蛋白质，特别是HSP70作为重要的分子伴侣参与动物的热应激反应。HSP70蛋白可以帮助变性蛋白的重新折叠而恢复活性，它的分泌可抑制细胞的凋亡。有报道表明，在鱼类、昆虫和哺乳细胞系耐热的实验中，HSP70基因调控区和HSP70基因的表达密切相关，还有报道显示，HSP70基因启动子区多态与植物和动物适应不同环境条件以及人类抗病性和疾病的易感性有关联。在这些研究对象的HSP70的调控区发现碱基的替换、颠换、插入和缺失，可调节HSP70基因的转录的活性。目前尚未有将热休克蛋白70运用于荷斯坦牛抗热应激基因鉴别的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记本发明另一个目的是提供所述分子标记在荷斯坦牛抗热应激性基因鉴别中的应用。本发明通过PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)的方法，检测HSP70基因调控区的多态性，并对其与奶牛耐热特性进行关联分析，得到奶牛抗热应激的遗传标记，加快抗热应激奶牛个体与群体的选择进度。本发明的目的是通过下列技术措施实现的荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记，该分子标记为SEQIDN0.3。所述分子标记在荷斯坦牛抗热应激性基因鉴别中的应用。所述的应用，其鉴别的方法包括下列步骤a.抽提荷斯坦牛基因组DNA，设计荷斯坦牛HSP70基因调控区的扩增引物，进行PCR扩增；b.分析扩增产物，若出现SEQIDNo.3即为具有抗热应激特性的荷斯坦牛。进一步，其鉴别的方法包括下列步骤a.抽提荷斯坦牛基因组DNA，以SEQIDNo.l、SEQIDNo.2为上下游引物，进行PCR扩增；b.以PCR-SSCP分析扩增产物的单核苷酸的多态性，若出现SEQIDNo.3即为抗热应激的荷斯坦牛。利用所述分子标记选育抗热应激荷斯坦奶牛的方法，该方法包括下列步骤-.a.测定荷斯坦牛HSP70基因调控区的基因型；b.选择具有SEQIDNo.3的公牛与母牛配种；c.得到的子代母牛即为具有抗热应激特性的荷斯坦奶牛。本发明的有益效果本发明公开了荷斯坦奶牛HSP70基因调控区的7种基因型(即AA、AB、AC、CD、CC、BB和BC型)中AA型具有良好的抗热应激性能，并且AA型具有稳定的遗传性，具有AA型的荷斯坦奶牛日平均产奶量较其他基因型高，运用此特征可辅助培育抗热应激的产奶量高的荷斯坦奶牛。本发明提供的基因鉴别方法检测成本低，采样简单，血样、耳样及奶样均可提取基因组DNA;检测方便快速，检测结果不受外界环境影响，可以对犊牛迸行抗热应激能力的早期评价，从而实现抗热应激奶牛的早期辅助选择。图1是荷斯坦牛HSP70特异性基因位点的分子标记图谱。图2是标准及部分奶牛的测定结果电泳图谱。其中l-标准对照，2-16样本测定(2-8母牛，9-12公牛，13-16母牛。其中，13号6与9配种产的母牛，14号为3与10所产，15号为8与12所产，16号为4与11所产)。图3是荷斯坦奶牛7种不同基因型扩增产物的DNA序列。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例11DNA提取采取被检测奶牛的血样、组织样或奶样(三种样本任选其一)，按金冬燕等[1]和田雨[2法，提取样本DNA。2应用本发明所筛选的引物SEQIDNo.l、SEQIDNo.2，对提取的DNA和标准品DNA进行PCR-SSCP分析，并对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺电泳，对电泳图谱进行基因多态性分析，具体操作过程如下用上述引物在PE9600扩增仪上进行PCR扩增PCR反应体积为12.5^1，其中10xbuffer1.25^1，25mMMgCl20.8^1，2.5mMdNTPsl(al，Taq酶(5u/jal)0.25|il，模板DNA100ng，20nM引物各0.6^1,加水至12.5^1。PCR反应体系为DNA94。C预变性5min后，94。C变性45s，6(TC退火30s，72'C延伸50s，循环30次，最后72'C延伸7min。对上述扩增产物在2。/。的琼脂糖凝胶上电泳，观察是否只有目的条带125bp,若有则取2pl的PCR产物，加入8nl变性缓冲液(98%甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025°/。二甲苯青、10mmo1/LEDTA(pH8.0)、2%甘油)，98。C变性8min，再置冰上5min，然后在15%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(100ml聚丙烯酰胺溶液中含29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺)，电泳缓冲液为0.6xTBE(lxTBE配方为Tris-base10.8g;硼酸5.5g;0.5MpH8.0EDTA4ml加双蒸水至1000ml。取lx丁BE600ml,加双蒸水至1000ml)，170V，15h,银染，拍照，观察PCR-SSCP电泳图谱，凝胶成像系统拍照。以PCR-SSCP结果从上至下为1、2、3、4条带的样品DNA定义为AB型，作为标准品DNA。如果检测样本只有2和4条带即为目标基因型AA，标准品图及样品鉴定结果见图2。标准品DNA:根据测序结果，选取AB型奶牛的样品DNA为标准品DNA，进行PCR-SSCP分析，电泳结果从上至下可分l、2、3、4带。标准品主要是为了对照区分AA与BB和CC。荷斯坦奶牛7种不同基因型扩增产物的DNA序列见图3。研究发现荷斯坦奶牛呈现7种基因型，即AA、AB、AC、CD、CC、BB和BC型见图1;在HSP70DNA序列中6184、6185、6202、6203及6282位点存在差别。各基因型序列及SNPs位点见图3。(这几个位点是7种基因型存在差别的位点，是采用本发明特异性引物得到的PCR产物分析具有不同条带的产物测序的结果)。实施例2:AA型个体具有稳定的遗传性。根据追踪研究证明，AA型母牛个体的父母，其父母双方均含有A基因(两方均为AA纯合型；或一方为纯合AA型，另一方为AB或AC杂合型；或两方均为AB或AC杂合型)，证明AA型基因能遗传见图2。实施例3:荷斯坦牛HSP70基因调控区不同基因型与抗热应激性能的关系1、荷斯坦牛抗热应激(HSP70基因调控区)位点的基因频率与基因型频率按上述描述
发明内容的测定方法，采集荷斯坦牛血样，检测该遗传标记的多态性，结果见表l。表l荷斯坦牛的基因型<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、不同基因型奶牛的直肠温度、呼吸频率和产奶量的变化利用SPSS11.5软件，对不同基因型荷斯坦牛直肠温度、呼吸频率和产奶量进行差异分析，结果见表2和表3。表2荷斯坦牛各基因型的直肠温度和呼吸频率指标气温基因型AAABCCACBCCDBB直肠温度36。C39.3639.7939.4040.0140.3639.9039.6815。C38.6038.8038.4138.3238.513謂38.50呼吸频率36'C82.08a91.25b98.00c88.71b89.81b93.00bc8謹b15°C40.40a43.57b44.53b43.62b47.30c45.00bc42.51b注同行不同字母表示两者比较差异显著(P<0.05或<0.01)，相同字母表示两者比较差异不显著。表3荷斯坦牛不同基因型日平均产奶量的差异比较(环境温度36T:)基因型AAABACBCBBCC日平均产奶26.11±22.46±23,26±19.42±18.17±17.45±量4.213.642.443.293.271.77差异程度abbccd注相同字母间差异不显著，不同字母间差异显著(P<0.05或O.Ol);CD基因型太少无法进行统计。结果显示荷斯坦牛AA基因型在高温(36°C)环境下，平均直肠温度(39.36'C)与平均呼吸频率(82.08次/分钟)在所有基因型中处于最低水平；但日产奶量显著高于其它基因型(P<0.01),说明AA基因型奶牛在热应激环境下具有比其他基因型更好的抗热应激能力(表2-3)。实施例4:AA基因型奶牛抗热应激性能对日平均产奶量的影响。通过分析表一，表二，表三的数据得知该遗传标记对奶牛热应激期间日平均产奶量贡献率18.65%。对夏季(36°C)降低直肠温度贡献率为5.12%。，对夏季(36°C)降低呼吸频率的贡献率10.12%。实施例5:选育AA型奶牛根据标记的图谱，对含有AA的奶牛进行直接选育，对含有AB或AC基因型的利用纯合AA型公牛进行改良，再对后代进行选育。这样就可以在较短的时间内培育出具有抗热分子标记的奶牛，结合生理指标和生产性能的测定，可以加快抗热性奶牛的育种进程。具体操作步骤如下(1)首先选择配种所需要的公牛。通过测定种用公牛的基因型，使其具备所需要的AA基因型。(2)对现有的初生(母)犊牛或成年母牛DNA进行PCR-SSCP分析，鉴定是否带有AA(或A)基因型(基因)。(3)用含有AA基因型的父本与含有AA(或A基因)基因型的母本配种，选择具有AA基因型的后备母牛。(4)在上述基础上，可以结合测定被选择奶牛的相关生理指标与生产性能，将具有较强生理抗热特性、生产性能较高的AA型(即具有SEQIDNo.3)作为种用。或者选择AA基因型的公牛与AA基因型母牛配种，得到的子代母牛即为具有抗热应激特性的荷斯坦奶牛。参考文献.北京:科学出版社，1992:463-469.[2]田雨.从牛奶中分离DNA方法的建立[J].乳业科学与技术，2006，3:112-113.<110>南京农业大学<120>荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记及其应用<歸3〈210>1〈211>20<212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉上游引物〈400>1gagactattt"gggagg"tia20〈210〉2〈211〉18〈212〉DNA〈213>人工序列〈220>〈223〉下游引物〈400〉2ggctgaaacatcgtggtg18〈210>3〈211>125<212>DNA〈213>天然序列，来自荷斯坦牛(Holstein)〈220>〈223〉AA型的HSP70基因调控区<400>3gagactatttgggaggctaaaga犯tactcacacccccccccaccctggctgtccccaca60aaagtcagtcttgggaagtaggccaaggcattgcatagaattaaagccaccacgatgttt120cagcc12权利要求1、荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记，该分子标记为SEQIDNO.3。2、权利要求1所述分子标记在荷斯坦牛抗热应激性基因鉴别中的应用。3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于鉴别的方法包括下列步骤a.抽提荷斯坦牛基因组DNA，设计荷斯坦牛HSP70基因调控区的扩增引物，进行PCR扩增；b.分析扩增产物，若出现SEQIDNo.3即为具有抗热应激特性的荷斯坦牛。4、根据权利要求2所述的应用，其特征在于鉴别的方法包括下列步骤a.抽提荷斯坦牛基因组DNA,以SEQIDNo.l、SEQIDNo.2为上下游引物，进行PCR扩增；b.以PCR-SSCP分析扩增产物的单核苷酸的多态性，若出现SEQIDNo.3即为抗热应激的荷斯坦牛。5、利用权利要求1所述分子标记选育抗热应激荷斯坦奶牛的方法，该方法包括下列步骤a.测定荷斯坦牛HSP70基因调控区的基因型；b.选择具有SEQIDNo.3的公牛与母牛配种；c.得到的子代母牛即为具有抗热应激特性的荷斯坦奶牛。全文摘要本发明属于分子遗传学领域，涉及荷斯坦牛抗热应激性育种的分子标记及其应用。该分子标记为SEQIDNO.3，利用此分子标记可以辅助培育具有抗热应激特性且产奶量较高的荷斯坦牛。文档编号C12Q1/68GK101423872SQ20081024471公开日2009年5月6日申请日期2008年12月15日优先权日2008年12月15日发明者崔群维,王根林,蔡亚非,闫玉琴申请人:南京农业大学