用于可准确控制的细胞培养的微流体芯片的制作方法

专利名称：用于可准确控制的细胞培养的微流体芯片的制作方法
技术领域：
本技术涉及细胞培养。更特别地，本技术涉及在微流体芯片上的可进出微孔中培养细胞。
背景技术：
细胞培养是生物及医学研究的基本步骤。现有的细胞培养技术通常是劳动密集型 的，并且受到静态细胞培养生长介质的约束，其监测和控制都很难实现，并且对于生物过程 并不直观。此外，部分地由于细胞培养生长介质的高度静态性质，现有的细胞培养技术需要 将培养中的细胞或细胞群转移至多个培养介质中(经常是使用移液器)，损伤培养中的细 胞或细胞群的风险很高。微流体设备允许将动态介质用于细胞培养，这种介质可进行监测和控制，通过自 动或手动的反馈手段动态地调节细胞培养的营养和环境。然而，微流体设备目前仅局限于 单细胞培养和非常小的细胞群。例如，许多微流体设备不适于培养胚胎细胞以及无法装入 微流体设备中微通道的其他大型细胞。此外，有些细胞过于脆弱，或者是培养物本身过于脆 弱，因此鉴于细胞培养物经过微流体设备的微通道时所经受的剪切力和压力，预计无法进 行成功的细胞培养实验。例如，对于干细胞培养来说，脆弱性特别成问题。概述本技术提供在微流体芯片中的图案化微孔阵列，使得培养中的细胞或细胞群易于 接近。在微流体芯片中的图案化微孔可将芯片上微流体通道技术与涉及移液的常规生物医 学实验方法结合起来。很多实施方案可包括该微孔阵列的动态控制的流体环境以及该微孔 阵列的动态控制的气体环境。在一些实施方案中，细胞培养设备包括一个或多个相互连接的具有图案的层，该 图案包括至少一个微流体通道。所述设备包括至少一个细胞培养孔，其一端开口并具有侧 壁，所述至少一个微流体通道与所述至少一个细胞培养孔的侧壁呈流体连通，并且最大通 道宽度显著小于该至少一个细胞培养孔的最大宽度。在一些实施方案中，所述一个或多个相互连接的层包括两个或更多个相互连接的 层，其中该至少两个或更多个相互连接的层限定了所述至少一个微流体通道。在一些实施方案中，所述至少一个细胞培养孔的最大宽度为最大通道宽度的至少 10倍。在一些实施方案中，所述至少一个细胞培养孔的最大宽度为最大通道宽度的至少60倍。在一些实施方案中，所述设备包括与所述至少一个微流体通道呈流体连通的至少 一个可控阀，该至少一个可控阀设置成可选择性地限制流体运输通过该至少一个微流体通 道。在一些实施方案中，该可控阀是挠曲阀(flexure valve)。在一些实施方案中，所述设备还包括与该至少一个微流体通道呈流体连通的至少 一个泵，该至少一个泵设置成运输流体通过该至少一个微流体通道。在一些实施方案中，所 述至少一个泵是蠕动泵。
在一些实施方案中，所述一个或多个相互连接的层包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。 在一些实施方案中，该设备还包括可移去的顶层，其适于覆盖所述至少一个细胞培养孔中 的每一个。在一些实施方案中，所述至少一个细胞培养孔含有至少一个多能细胞。在一些 实施方案中，该设备还包括外部可进出端口，其与所述至少一个微流体通道中的至少一个 呈流体连通。在一些实施方案中，该设备还包括至少一个传感器，其位于该至少一个细胞培养 孔附近，并设置成观察置于该至少一个细胞培养孔中的一组测试细胞的物理性质。该设备 包括与该至少一个传感器联通的控制器以及与该控制器联通的至少一个流体流动调节器。 该控制器控制所述至少一个流体流动调节器，从而应答于该至少一个传感器所观察到的物 理性质而调节通过该至少一个微流体通道的流体运输。在一些实施方案中，该设备还包括选自以下的传感器图像传感器、流速传感器、 离子组成传感器、温度传感器、压力传感器、光传感器和光谱传感器。在一些实施方案中，培养测试细胞的方法包括将至少一组测试细胞转移通过设置 在至少一个细胞培养孔一端的开口以及运输流体通过至少一个微流体通道，所述微流体通 道与该至少一个细胞培养孔的侧壁呈流体连通。所述至少一个微流体通道中每一个的最大 通道宽度均显著小于所述至少一个细胞培养孔的最大宽度。所运输的流体有助于培养置于 所述至少一个细胞培养孔内的所述至少一组测试细胞。
在一些实施方案中，运输流体通过所述至少一个微流体通道的动作包括改变所述 至少一个微流体通道内的压力，所述压力改变驱动所述至少一个微流体通道与至少一个细 胞培养孔的相应孔之间的流体。在一些实施方案中，改变该至少一个微流体通道内的压力 包括泵送流体通过该至少一个微流体通道。在一些实施方案中，所述泵送流体通过该至少 一个微流体通道包括使用注射器和蠕动泵中的至少一种。在一些实施方案中，该方法还包括通过至少一个阀来调节通过所述至少一个微流 体通道的流体运输。在一些实施方案中，该方法还包括测量选自以下的至少一个参数微流 体通道流体的速度、微流体通道流体的离子组成、细胞培养孔的温度、细胞培养孔的压力、 透光率、反光率和细胞培养孔的光谱数据。在一些实施方案中，该方法还包括可逆地密封可移除顶层，所述可移除顶层适于 覆盖设置在所述至少一个细胞培养孔中每一孔一端的开口。在一些实施方案中，所述至少 一组测试细胞包括至少一个多能细胞。在一些实施方案中，该方法还包括感测置于所述至少一个细胞培养孔内的至少一 组测试细胞的物理性质，以及应答于所感测的物理性质而调节通过所述至少一个微流体通 道的流体运输。在一些实施方案中，细胞培养设备包括用于贮存至少一组测试细胞的装置，所述 至少一组测试细胞可通过设置在一端的开口转移；还包括运输流体通过至少一个微流体通 道的装置，所述微流体通道与贮存装置的侧壁呈流体连通。所述至少一个微流体通道中每 一个的最大通道宽度均显著小于该贮存装置的最大宽度，其中所运输的流体有助于培养置 于该贮存装置内的所述至少一组测试细胞。以上概述仅用于说明，并不旨在以任何方式进行限制。除了上文所述的说明性方 面、实施方案和特征以外，其他方面、实施方案和特征在参考附图及下文的详细描述之后将是很明显的。


基于下文对附图所示本技术实施方案更为具体的描述，本技术的以上及其他方 面、特征和优点将是很明显的，在附图中，相似的标记在不同的视图中均代表相似的部分。 附图不一定按比例绘制，相反，重点在于展示本技术的原理。图1显示本技术一个实施方案中细胞培养设备的一个说明性实施方案的横截面 侧视图。图2显示本技术另一个实施方案中细胞培养设备的一个说明性实施方案的横截 面侧视图。图3A显示本技术一个实施方案中细胞培养设备的一个说明性实施方案的俯视透 视图。图3B显示图3A所示细胞培养设备的一个说明性实施方案的横截面侧视图。
图4显示通过移液器将至少一个测试细胞和培养基转移至图3A和图3B所示细胞 培养设备的一个说明性实施方案中的至少一个细胞培养孔中。图5显示在本技术一个实施方案的至少一个细胞培养孔中生长的成纤维细胞培 养物的一个说明性实施方案的显微照片。图6显示本技术一个实施方案的细胞培养设备的一个说明性实施方案，该设备包 括在至少一个细胞培养孔附近的至少一个传感器、与该至少一个传感器相联通的控制器以 及与该控制器相联通的至少一个流体流动调节器。图7显示微流体芯片的一个实施方案的示意图。图8显示一个示例性微孔中成纤维细胞的显微照片。图9显示一个示例性微孔中HeLa细胞的显微照片。图IOA显示一个示例性微孔中人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微照片。图IOB显示培养皿中HUVEC的显微照片。详细描述在下面的详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在附图中，类似的符号通常表 示类似的组成部分，除非上下文另有说明。详细描述、附图和权利要求书中描述的例示说明 性实施方式不意在限定。在不偏离本文所述的主题的精神或范围的情况下，可以采用其他 实施方式，并且可以做出其他变化。通过提供包括直径约2_3mm的至少一个细胞培养孔的图案化多层微流体设备，本 技术填补了传统静态细胞培养技术与微流体设备中动态细胞培养之间的缺口。这样，例如， 该微孔阵列可容纳较大的细胞，如胚胎细胞。此外，可以通过可伸缩顶层接近细胞培养物。 所述可伸缩顶层有效地将细胞培养物密封在可控环境中。可以使用常规方法通过移液器将细胞递送至该至少一个细胞培养孔中。装入细胞 后，可通过微通道递送培养基。所述微通道可用于对所述至少一个细胞培养孔进行补料和 排出。由此，所述培养基保持新鲜，并且例如可以监测培养基的浓度和相对速度，以改变和 确定细胞生长。微流体设备可由弹性体构成，例如聚二甲基硅氧烷(PDMA)。除了所述至少一个细胞培养孔以外，该微流体图案化多层设备还可包括微阀和微泵。所述微流体设备的微阀和 微泵可通过气动方式控制，或者通过注射器控制，例如其中与所述至少一个微流体通道中 的至少一个呈流体连通的外部可进出端口可容纳多种皮下注射针，例如6号至36号针。包括至少一个细胞培养孔的该微流体设备在尺度和数量上均可放大。微孔阵列可 包括1、2和3维阵列。所述微孔阵列可包括将在第一微孔中培养的细胞依次转移至第二微 孔的机制，其中所述第一和第二微孔可提供受流体或水性细胞培养基以及气体介质之一约 束的不同生长环境。可用于细胞培养的本技术的设备图1显示本技术一个实施方案中一个细胞培养设备100的侧视图，该设备包括背 层105和一个相互连接的层110。在一些情况下，它可称为微流体芯片。所述相互连接的 层110包括其中限定的图案。该图案包括至少一个微流体通道130。该图案还可以包括至 少一个细胞培养孔125’、125”(通称为125)，每个均与至少一个所述微流体通道130呈流 体连通。细胞培养孔125具有在一端的开口 126和侧壁131，所述至少一个微流体通道130 与该至少一个细胞培养孔125的侧壁呈流体连通。微流体通道130的最大通道宽度均显著 小于任何细胞培养孔125的最大宽度。背层105 —般为所述一个或多个相互连接的层110提供支持。背层105可以是 柔性的、半刚性的或刚性的，这取决于预期的应用。在一些实施方案中，背层105由水晶 (crystal)或玻璃构成。背层105可以基本上是平面的，例如平板玻璃或半导体晶片衬底。 在一些实施方案中，背层105可以是非平面的。例如，背层可以为圆柱状，相互连接的层沿 着该圆柱的内表面或外表面中的一个或多个在其上形成。在一些实施方案中，细胞培养孔125的最大宽度为微流体通道130最大宽度的至 少10倍。在一些实施方案中，所述至少一个细胞培养孔125的微流体通道130最大宽度为 微流体通道130最大宽度的至少60倍。在一些实施方案中，所述细胞培养设备100的所述 一个相互连接的层110包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施方案中，该细胞培养设备100还包括一个或多个外部可进出端口 115、 120，分别与至少一个所述微流体通道130呈流体连通。在一些实施方案中，该设备100还 包括顶层135，其适于覆盖所述至少一个细胞培养孔125中每一个。顶层135可以是可移除 的，选择性地允许进出一个或多个所述细胞培养孔125的开放端126。顶层125可以是刚性 的、半刚性的或柔性的，这取决于预期的应用。在一些实施方案中，可移除的顶层135可以 是半透明的，允许至少一些光透过，或者可以是透明的，提供进入所述一个或多个细胞培养 孔125的窗口。可移除的顶层135可包括以下之一 PDMS、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和玻
^^ ο在一些实施方案中，所述至少一个细胞培养孔125含有至少一个测试细胞165和 培养基170。在一些实施方案中，测试细胞165为多能细胞。在一些实施方案中，测试细胞 165和培养基170通过移液器160转入和转出所述至少一个细胞培养孔125。在一些实施 方案中，可移除的顶层135提供了接近所述至少一个细胞培养孔125中测试细胞165和培 养基170的操作出入口。设备100的至少一个优点是其允许通过移液器160转移测试细胞165和培养基170，而无需任何测试细胞165流过任何的微流体通道130。测试细胞165流过所述至少一个微流体通道130的步骤的去除降低了对测试细胞165的剪切力和压缩力，剪切力和压缩力可能损伤脆弱的测试细胞165。而且，培养基170通过所述至少一个微流体通道130流到 所述至少一个细胞培养孔125的侧壁，这降低了对测试细胞165的湍流效应，并降低了测试 细胞165本身堵塞所述至少一个微流体通道130的机会，因为测试细胞165可以置于所述 至少一个微流体通道130的侧壁进入点的上方或下方。此外，测试细胞165的大小也不受 微流体通道130尺寸的限制。在一些实施方案中，可将测试细胞165转移至附着在所述至少一个细胞培养孔 125的侧面或底面。在一些实施方案中，可将测试细胞165转移至浸没于细胞培养孔125内 的培养基170中。在一些实施方案中，可将测试细胞165转移至漂浮在细胞培养孔125内 的培养基170的顶部或在顶部附近。在一些实施方案中，可通过以下一种或多种方法在转 移过程中控制测试细胞165在细胞培养孔125中的位置静电荷、静磁矩、化学结合机制以 及对细胞培养孔125的壁的表面附着。在一些实施方案中，在将测试细胞165和培养基170转移至所述至少一个细胞培 养孔125之后，将可移除顶层135可逆地密封在所述至少一个细胞培养孔125上。该密封通 过将细胞培养孔125与外部环境隔离而有效地隔离了测试细胞165和培养基170的环境。细胞培养设备100的一个或多个相互连接的层110还可包括可移除的顶层135，其 适于覆盖所述至少一个细胞培养孔125中每一个。在一些实施方案中，可移除的顶层135 是透明的。可移除的顶层135包括以下之一 PDMS、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和玻璃。可 移除的顶层135为操作者提供了接近所述至少一个细胞培养孔125中测试细胞165和培养 基170的物理途径，而透明的顶层135为操作者提供观察途径。在一些实施方案中，可以监测并控制测试细胞165的环境。例如，在一些实施方案 中，对测试细胞165的监测可包括以下一种或多种测量至少一个微流体通道130的流速、 测量至少一个微流体通道130的流体离子组成、测量至少一个细胞培养孔125的温度、测量 至少一个细胞培养孔125的压力、测量测试细胞165和培养基170的透光率、反光率和光谱 数据。在一些实施方案中，测量所述至少一个细胞培养孔125中流体的离子组成可包括 使用带有激光诱导荧光(LIF)检测器的毛细管电泳(CE)来进行测量。在一些实施方案中， 测量光谱数据可包括测量以下的一种或多种测试细胞165的光谱、红外光谱(IR)、傅里叶 变换红外光谱(FTIR)和核磁共振(NMR)谱。在一些实施方案中，光谱数据通过透明的可移 除顶层135获得。在一些实施方案中，通过进一步使可移除顶层135对于一部分IR光谱而 言也是透明的，从而通过透明的可移除顶层135获得IR和FTIR光谱数据。在细胞培养设 备100的所述一个或多个相互连接的层110中缺少顺磁性及铁磁性材料的条件下，可获得 NMR数据。在一些实施方案中，设备100包括环境腔控制，用于控制以下的一种或多种一个 或多个细胞培养孔125中的温度、压力、分压和化学环境。在所述至少一个细胞培养孔125 的环境腔的一个示例性化学控制中，所述化学环境为氧(O2)环境。例如，可以通过外部热装 置(如加热器，例如电阻加热器、放热/吸热化学反应、热电冷却器/加热器以及任何合适 的热交换器，如散热装置)来控制温度。可以通过向细胞培养孔125中引入一种或多种化 学品或化合物来控制所述化学环境。这样的化学品或化合物可通过一个或多个微通道130以及细胞培养孔125的开放端126引入和/或除去。在密封可移除顶层135和控制化学环境的另一个实施方案中，可以将反应性催化剂(如钼(Pt))附着在可移除顶层135的下侧，以促进以下一种或多种之间的化学反应至 少一个细胞培养孔125中的未浸没测试细胞165与培养基170表面。在密封可移除顶层135和控制化学环境的另一个实施方案中，可通过一个或多个 所述微通道130和透明的可移除顶层135将辐射反应性催化剂(例如UV辐射)引导至所 述至少一个细胞培养孔125中，以促进以下一种或多种之间的化学反应至少一个细胞培 养孔125中的未浸没测试细胞165与培养基170表面。依赖于UV辐射作为催化剂的两个 细胞反应实例是动物细胞化学中维生素D的演化以及植物细胞化学中的光合作用。在一些 实施方案中，可以通过一个或多个底层和一个或多个相互连接的层将这样的辐射反应性催 化剂引入所述至少一个细胞培养孔125中。在一个实验或一组实验之后，可以从一个或多个所述细胞培养孔125中收获测试 细胞165。在一些实施方案中，收获包括揭下可移除顶层135、移出一个或多个测试细胞 165 (例如通过移液器160移出)。可将所述一个或多个测试细胞165转移至第二实验或 分析站。可移除顶层135能够可逆地重新放回，从而重新密封所述一个或多个细胞培养孔 125。如上文所述，所述一个或多个相互连接的层110可以设置成限定以下的一种或多 种细胞培养孔125，至少一个微流体通道130，一个或多个外部可进出端口 115、120，以及 就此而言的其中任何其他图案。这些结构125、130、115、120可以通过本领域技术人员已知 的技术形成，例如模塑、压花、激光打孔和激光烧蚀、常规打孔、软刻蚀和多孔层压。图2显示细胞培养细胞设备200的一个实施方案的横截面侧视图，其包括两个相 互连接的层110a、110b。图2展示了由两个相互连接的层110a、IlOb共同形成的至少一个 微流体通道130。例如，可以在相互连接的层IlOaUlOb其中一个上形成开放通道(即沟 槽)，由此在另一个相互连接的层被放置成与该沟槽的长形开口邻接时形成微通道130的 腔。在另一些实施方案中，可以在相互连接的层IlOaUlOb的每一个上形成互补的开放通 道(即沟槽)，从而使对准之后的相互连接的层彼此接触放置形成微通道130的腔。通过两 个相互连接的层IlOaUlOb共同形成至少一个微流体通道130的一个可能的优点是易于制 造。由两个相互连接的层110a、IlOb共同形成的所述至少一个微流体通道130允许软 刻蚀以在第一个相互连接的层IlOa中成型所述至少一个微流体通道130的第一部分，并在 第二个相互连接的层IlOb中成型所述至少一个微流体通道130的第二部分，避免了对本领 域技术人员已知的方法(例如模塑、压花、激光打孔和激光烧蚀、常规打孔和多孔层压)的需要。图3A显示了本技术一个实施方案中细胞培养设备100的一个实施方案的俯视透 视图，该设备包括多个相互连接的层110。图3B显示本技术一个实施方案中设备100的横 截面侧视图，该设备包括多个相互连接的层110。在一些实施方案中，该细胞培养设备100还包括至少一个可控阀350、355。例如， 可控阀350、355可以装在至少一个可控阀通道340、345中，所述可控阀通道与至少一个微 流体通道130呈流体连通。一个或多个所述可控阀350、355可以设置成选择性地限制流体运输通过至少一个所述微流体通道130和各自的可控阀通道340、345。在一些实施方案中，一个或多个所述可控阀350、355可以是挠曲阀。作为替代或补充，细胞培养设备100包括一个或多个泵360、365，它们定位成与至 少一个所述微流体通道130呈流体连通。所述一个或多个泵360、365中每一个均设置成运 输流体通过至少一个微流体通道130。在一些实施方案中，一个或多个所述泵360、365可以
是蠕动泵。图4显示通过移液器160将至少一个的测试细胞165和培养基170转移至本技术 一个实施方案中细胞培养设备100中一个或多个所述细胞培养孔125中。在一些实施方案 中，使用机械泵(如注射器421)转移一个或多个的所述测试细胞165和培养基170通过与 至少一个微流体通道130呈流体连通的外部可进出端口 422。外部可进出端口 422可由从 至少一个微流体通道130延伸至设备100外表面的腔形成。例如，外部可进出端口 422可 以从置于可移除顶135下方的设备100之上表面选择性进出。外部可进出端口 422的直径可以等于或显著不同于所述一个或多个相互连接的 微流体通道130。例如，外部可进出端口 422可以为圆柱状，直径为约0. Imm至约5. 0mm，而 微流体通道130的直径可以小得多。例如，在一些实施方案中，外部可进出端口 422的直径 允许通过皮下注射针423进出外部可进出端口 422，例如其中外部可进出端口 422的大概直 径0. 1-5. Omm与36号-6号皮下注射针的外径(OD)相近。圆柱状外部可进出端口 422可 以至少延伸至所述至少一个微流体通道130的一定深度，或者可以更深。例如，外部可进出 端口 422可以伸入相互连接的层中约2-3mm的深度。在一些实施方案中，外部可进出端口 422为圆锥状，从设备100外表面处的第一直径转变成相对于所述外表面一定深度时的不 同(如更小)直径。在一些实施方案中，所述细胞培养孔125中每一个的外形可为圆柱状，从开放端 延伸到孔的底面。所述圆柱状外形可以是正圆柱体，也可以是斜圆柱体。该圆柱体的横截 面形状可以为圆形、椭圆形、多边形或者不规则。在一些实施方案中，所有的细胞培养孔125 在形状和大小上基本相似。或者，至少一些细胞培养孔125在大小和形状中的一项或多项 中可以彼此不同。细胞培养孔125的底可以是平的或者不平的。一般而言，细胞培养孔125的尺寸可容纳测试细胞165的大小和培养基170的体 积。例如，细胞培养孔125可以为正圆柱，直径约2-3mm，并延伸约4-6mm的深度。在一些实 施方案中，所述至少一个微流体通道130的横截面宽度可以为约100微米，深约10微米。一个或多个细胞培养孔125与一个或多个微流体通道130呈流体连通。一个或多 个微流体通道130可以沿细胞培养孔125的顶面、底面或侧面与相应的细胞培养孔125相 交。对于微流体通道130与侧面相交的实施方案，相交点可置于顶面或底面中的一个附近 或者其间的任何位置。因此，如图1和2所示贮存沿孔125底部分布的测试细胞165的细 胞培养孔125可以在侧壁上显著位于测试细胞165上方的点与至少一个微流体通道130相 交。这样，可以将流体转移进和/或出细胞培养孔125，而不被测试细胞165阻塞，并且优选 地使因流体流动而对测试细胞165产生的任何剪切力最小化。在一些实施方案中，可以按照本领域技术人员所熟知的技术气动激活安置在至少 一个可控阀通道340、345中的至少一个可控阀350、355，所述可控阀通道与至少一个微流 体通道130呈流体连通。例如，所施加的负压可驱动至少一个可控阀350打开，以允许培养基170从至少一个微流体通道130进入至少一个细胞培养孔125。所施加的正压可驱动至 少一个可控阀350关闭，以阻止培养基170从至少一个微流体通道130流入至少一个细胞 培养孔125。类似地，所施加的负压可驱动至少一个可控阀355打开，以允许培养基170从至少 一个细胞培养孔125进入至少一个微流体通道130。所施加的正压可驱动至少一个可控阀 355关闭，以阻止培养基170从至少一个细胞培养孔125流入至少一个微流体通道130。作为气动激活至少一个可控阀350、355的一个替代实施方案，至少一个可控阀 350,355可被至少一个微流体通道130中的正微流体分压所激活。正分压可驱动至少一个 可控阀350、355打开，允许培养基170进入至少一个细胞培养孔125。作为气动激活至少一个可控阀350、355的一个替代实施方案，可将至少一个可控 阀350、355的内径(ID)制成足够小，使得至少一个可控阀350、355表面处或表面附近的表 面张力阻止扩散进出所述至少一个细胞培养孔125。在关于至少一个可控阀350、355的上述提到的每一个实施方案中，可能需要差别 性分压力将培养基170从至少一个微流体通道130驱动到至少一个细胞培养孔125中，并 可能需要差别性分压力将培养基170从至少一个细胞培养孔125驱动到至少一个微流体通 道130中。在一些实施方案中，可以例如通过皮下注射针423将培养基170直接注入外部可 进出端口 115，以及例如通过皮下注射针423将培养基170从外部可进出端口直接移出，或 者通过真空泵，从而提供差别性分压力。例如，如上文所述，外部可进出端口 115、120、422 的直径允许皮下注射针423进出端口，其中例如外部可进出端口 115、116、422的直径与36 号_6号皮下注射针423的外径(OD)相近。在一个替代性实施方案中，所述差别性分压力可由至少一个蠕动泵360、365来提 供，所述蠕动泵可位于至少一个微流体通道130中。在一些实施方案中，所述至少一个蠕动 泵360、365将外部可进出端口 361、366与至少一个微流体通道130隔开。所述至少一个蠕动泵360、365可提高所述至少一个微流体通道130中相对于所述 至少一个细胞培养孔125的压力，驱动培养基170通过安放在至少一个可控阀通道340、345 中的至少一个可控阀350、355进入至少一个细胞培养孔125。所述至少一个蠕动泵360、365可降低至少一个微流体通道130中相对于至少一个 细胞培养孔125的压力，将培养基170通过安放在所述至少一个可控阀通道340、345中的 至少一个可控阀350、355从至少一个细胞培养孔125中移出。在一些实施方案中，至少一 个蠕动泵360、365可包括一个或多个依次激活的气动挠曲微阀。细胞培养设备100的一个或多个相互连接的层110可包括弹性体。弹性体是包括 但不仅限于碳、氢、氧和/或硅的长聚合物链的集合。在其玻璃化温度(Tg)以上的弹性体 是无定形聚合物，在此情况下各个链有可能存在相当大的链段运动，使得弹性体具有流体 的性质。弹性体可通过在固化剂存在下加热来固化。固化指交联过程。交联是使聚合物链彼此连接的共价键。交联是热固性塑性材料的特征性质。交联阻止聚合物链紧密堆积，防 止形成结晶区。交联结构中受到限制的分子移动性限制了聚合物材料在负荷下的延伸。交联通过热和/或压力所起始的化学反应来形成，或者通过将未聚合或部分聚合的树脂与多种化学品混合来形成，可以在通常为热塑性的材料中通过暴露于辐射(例如但 不限于紫外(UV)辐射、红外(IR)辐射和电磁(EM)辐射)来诱导交联。交联的弹性体能在 长度的5%至700%间可逆伸长，而没有宏观变形。许多不饱和弹性体(例如天然存在的橡胶)在硫存在下固化，这一过程称为硫 化。通过硫化而固化的弹性体包括但不限于天然橡胶、聚异戊二烯、丁基橡胶、卤化丁基 橡胶、聚丁二烯、丁苯橡胶、丁腈橡胶、氢化丁腈橡胶、和氯丁二烯橡胶例如聚氯丁二烯 (polychloroprene)、Neoprene 禾口 Baypren0饱和弹性体不能通过硫化来固化。不能通过硫化来固化的弹性体包括但不限于乙 丙橡胶、表氯醇橡胶、聚丙烯酸酯橡胶、硅酮橡胶、氟硅橡胶、含氟弹性体以及一般而言任何 合成橡胶例如VITON (Ε. I. Du Pont deNemours & Company的注册商标)、以及任何含氟弹 性体(FKM)和全氟弹性体(FFKM)如TECN0FL0N(意大利Solvay Solexis S. p. Α.的注册商 标)和全氟弹性体、四氟乙烯/丙烯橡胶、氯磺化聚乙烯和乙烯_乙酸乙烯酯。既不属于饱和弹性体也不属于不饱和弹性体的弹性体包括但不限于热塑性弹性 体、聚氨酯、节肢弹性蛋白(resilin)、弹性蛋白(elastin)、聚酰亚胺、酚醛树脂和聚二甲 基硅氧烷(PDMS)。这类弹性体具有低玻璃化温度(Tg)，通常比室温低得多，因此在室温或 室温附近具有流体特性。
例如，PDMS具有许多有利于微浇铸、微模塑和微图案化的材料特性。PDMS的玻璃 化温度极低，Tg = -120°C。因此，PDMS的粘度在室温下相对低，与蜂蜜的粘度近似，其中η 约等于1750cP。这使得PDMS可以以流体的特性在母模中流动。PDMS在室温至80°C的温度下固化。PDMS在添加一组固化剂时固化，所述固化 剂包括以下至少一种钼催化剂络合物、甲基氢硅氧烷共聚物和二甲基硅氧烷共聚物。固 化通过硅氢化(乙烯基封端的PDMS基团(SiCH = CH2)与氢硅烷(SiH)基团之间的交 联)来进行。前体(在此实施例中为PDMS)通过固化过程变硬。已固化PDMS的粘度约为 5. 1+/-0. 9X107cP，使得固化PDMS的粘度约在玻璃的工作点(n = IO6cP)与软化点(η = 109 5cP)之间。可以使用溶剂来降低前体的粘度。用于PDMS的示例性溶剂包括甲醇、甘油和水。 诸如二氯甲烷、非环烃和环烃、芳烃、卤代化合物、醚和胺的溶剂在生产具有精细结构的微 流体通道时可能引起损伤，因为这组溶剂扩散到PDMS中并使PDMS前体膨胀，损害母模的精 细结构，并有效地封闭相互连接的多层图案中的微流体通道。诸如丙酮、1-丙醇和吡啶的溶 剂使PDMS膨胀的程度较低。前体或者前体和溶剂在固化之前必须除气。前体中溶解并滞留的任何残留气体颗
粒很容易逃逸到母模处，附着在关键结构上，在制成的微流体通道中形成空洞。脱气可以
通过将整个母模、前体和刚性衬底支持层置于真空室中来进行。真空室应该设置成不高于
20-25mm汞柱的压力。PDMS的脱气可进行30分钟至2小时，这取决于母模的图案密度和几
何大小。一些气泡可能仍然滞留，附着在母模表面上，但在向真空室重新充入空气后会破 m农。在连续微流体通道模制之间清洁母模能延长母模的寿命，使得母模可用于制造多 达50个或更多的PDMS微流体通道图案。用于清洁母模的溶剂可包括但不限于甲醇、甘油 和水，与用于降低前体粘度的溶剂相同。残留溶剂(清洁步骤之后未蒸发的溶剂)可扩散到接下来的PDMS前体应用中。像上文对用于降低前体粘度的溶剂所描述的那样，如果选择不正确，清洁步骤之后的残留溶剂可使PDMS的体积在最精细的母模特征部位处膨胀。与弹性体微流体通道图案(例如上述优选实施方案中微流体通道设备100的一个 或多个相互连接的层110)相关的特征尺寸可以小至约30nm，这是标准光刻术特征尺寸极 限的约60%。特征尺寸的纵横比可高达约2. 0或者更高，而几乎没有特征变形。图5显示了在本技术一个实施方案的至少一个细胞培养孔125中生长的成纤维细 胞培养物500的显微照片。该显微照片在收获测试细胞165的步骤之前在原位拍摄并提供， 由于可移除顶层135的透明而得以实现。图6显示了细胞培养设备100的一个替代系统构造，其包括至少一个细胞培养孔 125附近的至少一个传感器660。该系统包括与所述至少一个传感器660联通的控制器665， 以及与控制器665联通的至少一个流体流动调节器670。在一些实施方案中，将至少一个传 感器660设置成观察置于该至少一个细胞培养孔125中的测试细胞群165和培养基170的 物理性质。测试细胞和培养基170的物理性质可包括温度、压力或分压力、化学组成、亮度、 颜色、澄清度、大小、外形、数目、重量。相应地，根据待测的具体物理性质来选择一种或多种 合适的传感器。传感器可选自包括以下的组图像传感器、流速传感器、离子组成传感器、温 度传感器、压力传感器、光传感器和光谱传感器。图像传感器包括用于获得细胞培养孔125内测试细胞165及培养基170的电子图 像的电荷耦合器件(CCD)或其他合适传感器。光传感器包括光电二极管、雪崩光电二极管 和光电晶体管，设置成检测以下的一种或多种测试细胞165和/或培养基170所发射的 光、它们的透光率和反光率。温度传感器包括热电偶和温度计。压力传感器包括气压计以 及应力或应变计。在一些实施方案中，控制器665设置成调节至少一个所述流体流动调节器670，由 此应答于所述至少一个传感器660所观察到的一个或多个物理性质而调节通过该至少一 个微流体通道130的流体运输。在一些实施方案中，控制器665为微处理器。控制器665 可包括应答于该至少一个传感器660所得数据而处理指令的软件、硬件和固件中的一种或 多种。在一些实施方案中，数据处理包括对来自图像传感器的图像数据进行图像处理。该 图像可以是例如可得自显微镜的放大图像。控制器665通过调节通过所述一个或多个微流 体通道130的流体流动来调节一个或多个细胞培养孔125的环境。例如，可以根据传感器 测定的测试细胞165的大小和/或重量，由控制器665来改变通过培养基170流动而对容 纳测试培养细胞165的细胞培养孔125提供的养分的体积和/或速率。因此，该系统能以 闭环形式运行，根据监测孔125内测试细胞165和培养基170的传感器的反馈，改变细胞培 养孔125的环境。上述测量、反馈和/或光谱测量、记录和显示技术中的一种或多种或者其任何部 分都可以在计算机硬件或软件或二者之结合中执行。所述过程可以根据本文所述方法和附 图，使用标准编程技术在计算机程序中执行。使用程序代码来输入数据，以实现本文所述功 能，并产生输出信息。将输出信息应用于一种或多种输出设备，例如显示器。每种程序均可 以高级程序化编程语言或面向对象编程语言来实现，以与计算机系统通信。然而，必要时所 述程序也可以汇编语言或机器语言来实现。在任何情况下，该语言都可以是编译型语言或解释型语言。此外，该程序可以在为该目的预先编制的专用集成电路中运行。每种这样的计算机程序均优选地存储在可由通用或专用可编程计算机读取的存储介质或设备(例如ROM或磁盘)中，用于在该存储介质或设备由计算机读取以实施本文 所述方法时设置和操作该计算机。所述计算机程序在程序执行时也可以存在于缓冲存储器 或主存储器中。所述分析方法也可以作为配置了计算机程序的计算机可读存储介质来实 现，其中如此设置的该存储介质设置使计算机以特殊的预定方式运行，以实现本文所述功 能。微流体芯片700的一个示例性实施方案的示意图示于图7。微流体芯片700包括 以平面方式排列的细胞培养孔704a、704b、704c……(通称为704)。至少一些细胞培养孔 704包括位于一端的开口，提供细胞培养孔704内部体积的直接出入口。微流体芯片700还 包括一个或多个微流体分配通道702。示例性设备700包括直线排列的这些微流体分配通 道702。至少一个所述微流体分配通道702与外部可进出端口 710呈流体连通。外部可进 出端口 710可用于向设备700中注入和/或从中抽出流体，例如使用注射器或泵或任何其 他本文所述合适的泵送方法。每个细胞培养孔704均通过各自的微流体通道706与微流体分配通道702之一呈 流体连通。如本文所述，至少一些微流体通道706与细胞培养孔704的侧壁相交。微流体 通道706与微流体分配通道702相交处形成的接口 708可以是无限制的流体接口。或者， 接口 708可包括可控的流体流元件708，例如可控的微流体阀。类似地，两个或更多个微流 体分配通道702的相交处所形成的一个或多个接口 712也可以是无限制流体接口。或者， 接口 712可包括可控的流体流元件708，例如微流体阀。一个或多个这些阀708、712可使用 用于控制微流体设备内流体流的成熟技术来控制。一般而言，细胞培养孔704的尺度显著 大于微流体通道706的横截面尺度。在示例性实施方案中，每个细胞培养孔704的半径约 为1. 5mm,每个细胞培养孔704的大小能至少容纳约30 μ L。在运行时，如本文所述可以通过开放进出端口将细胞培养物注入一个或多个细胞 培养孔704。可以选择性地将流体(如养分)导入一个或多个细胞培养孔704中并选择性 地导出废物，从而为细胞培养物提供可控的环境。流体可通过所述一个或多个外部可进出 端口 710注入或移出设备700。在一些实施方案中，细胞培养孔704的排列可第一个测试实例涉及培养成纤维细胞。在接种成纤维细胞之前，用50 μ g/mL纤连 蛋白孵育微孔1小时。成纤维细胞在 ο μ L培养基中加入。在5% CO2下以37°C孵育细胞。 图8是在微孔中生长4小时后成纤维细胞的显微照片。第二个测试实例涉及培养HeLa细胞。用I型胶原孵育微孔1小时。HeLa细胞在 10 μ L培养基中加入。在5% CO2下以37°C孵育细胞。图9是在微孔中生长10小时后HeLa 细胞的显微照片。第三个测试实例涉及培养内皮细胞。用50 μ g/mL纤连蛋白孵育微孔1小时。人 脐静脉内皮细胞(HUVEC)在10 μ L培养基中加入。在5% CO2下以37°C孵育细胞。图IOA 是在微孔中生长2小时后HUVEC细胞的显微照片。图IOB是在与图IOA所示微孔基本相同 的生长条件下在培养皿中生长2小时后HUVEC的显微照片。已经描述了本技术的多种实施方案。尽管如此，应该理解，可以进行多种改动，而 不偏离本技术的构思和范围。
本说明书中提到的所有出版物、专利申请、授权专利及其他文献均以参考方式并 入本文，其范围如同对每篇出版物、专利申请、授权专利或其他文献均单独指出以参考方式 整体并入本文。对于以参考方式并入本文的文本中的定义，其程度以不与本文的定义冲突 为准。等同方案本公开内容不限于本申请中所述的具体实施方案。对于本领域技术人员而言显而 易见的是，可以进行许多修改和改变，而不偏离其构思和范围。结合上文的描述，本公开内 容的范围内除本文所列举以外的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言将是很 明显的。这些修改和改变也落入权利要求书的范围内。本公开内容仅受限于所附的权利要 求书以及这些权利要求的等同方案的完整范围。应当理解，本公开内容不受限于具体的方 法、试剂、化合物、组合物或生物体系，它们当然是可以变化的。还应当理解，本文使用的术 语仅用于描述具体的实施方案，而不旨在限制。另外，当以马库什组的形式描述本公开内容的特征或方面时，本领域技术人员会 明白，本文也涵盖了该马库什组的任何个体成员或成员亚组而言的描述。
就像本领域技术人员可以理解的那样，对于任何及全部目的，特别是就提供书面 描述而言，本文公开的所有范围还包括任何及所有的可能小范围及其小范围组合。任何 列出的范围可以很容易地认为是对同一范围分成相等的至少两部分、三部分、四部分、五部 分、十部分等而进行了描述。作为非限制性的实例，本文讨论过的每个范围可以容易地分为 前三分之一、中间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解，词语例如“多达”、 “至少”、“多于”、“少于”等包括所提到的数值，并且如上所述指可以分成小范围的范围。最 后，本领域技术人员会理解，范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组表示 具有1个、2个或3个细胞的组。类似的，具有1-5个细胞的组表示具有1个、2个、3个、4 个或5个细胞的组，依此类推。本文中公开了多个方面和实施方式，而其它方面和实施方式对于本领域技术人员 将是显而易见的。本文中公开的多个方面和实施方式的目的在于例示说明，并非旨在限定， 真正的范围和精神由下面的权利要求书表明。
权利要求
细胞培养设备，其包含一个或多个其中具有图案的相互连接的层，该图案包含至少一个微流体通道；至少一个细胞培养孔，其具有位于一端的开口以及侧壁，所述至少一个微流体通道与该至少一个细胞培养孔的侧壁呈流体连通，并且最大通道宽度显著小于该至少一个细胞培养孔的最大宽度。
2.权利要求1的设备，其中所述一个或多个相互连接的层包括两个或更多个相互连接 的层，其中所述至少一个微流体通道由该两个或更多个相互连接的层来限定。
3.权利要求1的设备，其中所述至少一个细胞培养孔的最大宽度为最大通道宽度的至 少10倍。
4.权利要求1的设备，其中所述至少一个细胞培养孔的最大宽度为最大通道宽度的至 少60倍。
5.权利要求1至4中任一项的设备，还包含与所述至少一个微流体通道呈流体连通的 至少一个可控阀，所述至少一个可控阀设置成可选择性地限制通过所述至少一个微流体通 道的流体运输。
6.权利要求5的设备，其中所述可控阀为挠曲阀。
7.权利要求5或6的设备，还包含与所述至少一个微流体通道呈流体连通的至少一个 泵，所述至少一个泵设置成运输流体通过所述至少一个微流体通道。
8.权利要求7的设备，其中所述至少一个泵是蠕动泵。
9.权利要求1至8中任一项的设备，其中所述一个或多个相互连接的层包含聚二甲基 硅氧烷(PDMS)。
10.权利要求1至9中任一项的设备，还包含可移除顶层，其适于覆盖所述至少一个细 胞培养孔中的每一个。
11.权利要求1至10中任一项的设备，其中所述至少一个细胞培养孔含有至少一个多 能细胞。
12.权利要求1至11中任一项的设备，还包含与所述至少一个微流体通道中至少一个 呈流体连通的外部可进出端口。
13.权利要求1的设备，还包含至少一个传感器，其位于所述至少一个细胞培养孔附近，并设置成观察置于所述至少 一个细胞培养孔内的一组测试细胞的物理性质；与该至少一个传感器联通的控制器；和与该控制器联通的至少一个流体流动调节器，其中该控制器控制该至少一个流体流动调节器，从而应答于该至少一个传感器所观察 到的物理性质而调节通过所述至少一个微流体通道的流体运输。
14.权利要求13的设备，还包含选自以下的传感器图像传感器、流速传感器、离子组 成传感器、温度传感器、压力传感器、光传感器和光谱传感器。
15.用于培养测试细胞的方法，其包括转移至少一组测试细胞通过设置在至少一个细胞培养孔之一端的开口 ；和运输流体通过与所述至少一个细胞培养孔之侧壁呈流体连通的至少一个微流体通道， 所述至少一个微流体通道中每一个的最大通道宽度均显著小于所述至少一个细胞培养孔的最大宽度，其中所运输的流体有利于培养置于所述至少一个细胞培养孔内的所述至少一 组测试细胞。
16.权利要求15的方法，其中运输流体通过所述至少一个微流体通道的动作包括改变 该至少一个微流体通道内的压力，所述压力改变在所述至少一个微流体通道与所述至少一 个细胞培养孔的相应孔之间驱动流体。
17.权利要求16的方法，其中所述改变该至少一个微流体通道内的压力包括泵送流体 通过所述至少一个微流体通道。
18.权利要求17的方法，其中所述泵送流体通过所述至少一个微流体通道包括使用注 射器和蠕动泵中的至少一种。
19.权利要求15至18中任一项的方法，还包括通过至少一个阀来调节通过该至少一个 微流体通道的流体运输。
20.权利要求15至19中任一项的方法，还包括测量至少一个选自以下的参数微流体 通道的流体流速、微流体通道的流体离子组成、细胞培养孔的温度、细胞培养孔的压力、透 光率、反光率以及细胞培养孔的光谱数据。
21.权利要求15至20中任一项的方法，还包括可逆地密封可移除顶层，所述顶层适于 覆盖设置在所述至少一个细胞培养孔中每个孔一端的开口。
22.权利要求15至21中任一项的方法，其中所述至少一组测试细胞中至少其一包括至 少一个多能细胞。
23.权利要求15的方法，还包括感测置于所述至少一个细胞培养孔内的所述至少一组测试细胞的物理性质；和应答于所感测的物理性质，调节通过所述至少一个微流体通道的流体运输。
24.细胞培养设备，其包含贮存至少一组测试细胞的装置，所述至少一组测试细胞可通过设置在一端的开口来转 移；和通过与该贮存装置的侧壁呈流体连通的至少一个微流体通道来运输流体的装置，所述 至少一个微流体通道中每一个的最大通道宽度显著小于该贮存装置的最大宽度，其中所运 输的流体有利于培养置于该贮存装置内的所述至少一组测试细胞。
全文摘要
本文公开了用于在至少一个细胞培养孔中培养细胞的设备。该设备包括一个或多个其中具有图案的相互连接的层，该图案包含至少一个微流体通道、具有位于一端的开口和侧壁的至少一个细胞培养孔，所述至少一个微流体通道与该至少一个细胞培养孔的侧壁呈流体连通，并且最大通道宽度显著小于该至少一个细胞培养孔的最大宽度。该设备包括与微流体通道呈流体连通的可控阀和可控泵中的至少一种，所述阀和泵设置成可选择性地限制通过微流体通道的流体运输。在一些实施方案中，该设备包括可移除的顶层，其适于覆盖所述至少一个细胞培养孔中的每个孔。
文档编号C12N5/22GK101827931SQ200880004220
公开日2010年9月8日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者黄岩谊 申请人:北京大学