专利名称：一种同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种寡核苷酸芯片及其应用，尤其涉及基于下游引物Tamara标记和多 重PCR扩增的可同时检测五种海洋环境常见肠道病毒的寡核苷酸芯片及其在检测海洋环 境中人致病性肠道病原体病毒中的应用，属生物芯片和环境微生物监测技术领域。
背景技术：
随着我国沿海城市人口的增长，城市生活污水的排海量逐年增加，导致越来越多的 人类致病性病毒进入海洋环境。许多病毒颗粒在海洋环境中具有很强的耐受能力，可通 过污染海产品、娱乐用水等途径使人受到感染，进而引发传染病的爆发流行。因此，进 行海洋环境人致病性病毒快速检测系统研发，是目前我国海洋生态环境监测和公共安全 健康工作所迫切需要的。
生物芯片/微阵列技术是上个世纪末期产生的高通量平行检测技术，不仅能够同时检 测多种病毒，而且在一张基片上能够同时检测多个样本，已经在基因表达谱分析和病原 体的平行检测方面得到应用。
在芯片杂交检测过程中，样品的荧光标记是极其关键的一个步骤，特别是对于RNA 样品由于其易于降解造成的引物区的缺失也会增加检测的假阴性率，探索更快速和有效 的标记技术将对基因芯片技术的应用和推广具有重要的实用价值。与其他的掺入标记方 法相比，下游引物Tamara标记的方法标记效率较高，可以显著提高杂交后芯片的信号 稳定性，相对的降低了检测的成本。然而，在现有技术的检索中还未发现用多重引物PCR 的方法对海洋环境中存在的能引起人类腹泻的多种病毒的靶基因进行同时扩增，采用 Tamara标记下游引物，以实现对多种海洋环境人致病性肠道病毒的平行检测的应用。
发明内容
针对现有技术的不足和实际检测的需要，本发明要解决的问题是提供一种能同时扩 增多种能引起人类腹泻的肠道病原体的靶序列并提高标记效率的寡核苷酸芯片及其在 海洋环境及海贝样本病原体检测中的应用。
本发明的技术构思是用多重引物PCR的方法对海洋环境中存在的能引起人类腹泻的 的多种病毒的靶基因进行同时扩增，采用Tamara标记下游引物，因此使得扩增出来的 所有PCR产物的下游5，端均被Tamara标记，以增加标记效率来提高病原体检测的敏感 性，实现对多种海洋环境人致病性肠道病毒的平行检测的目的。
本发明所述的同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片，由表面醛基化修饰的载玻片 基片和阵列涂布于其上的五种肠道病毒病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照
制成，其中所述阴性对照为点样浓度为IOlxM的JEV探针，其序列为NH2- (GH2)
ATTGAC;所述阳性对照为点样浓度为10pM的合成标记探针，探针的序列为,(OE) 64bly(dl) 15"Tarara4所述空白对照为双蒸水；
其特征在于所述五种肠道病毒病原体探针是5条54 70mer的、点样浓度均为10 uM的HAV(甲型肝炎病毒)、ROV (轮状病毒)、NOV (诺如病毒)、ASV (星状病毒)和 ADV (肠道腺病毒)病原体探针；其中
3所述HAV病原体探针序列为HAV-P: NH2- (CH2)6~Pol (dT) lMTMAGATOCACAGTATOCAGnTGGGAArrMCAATCAGAGTTTGGTCAGAGCrGAACATTGGAAaG;
所述ROV病原体探针序列为ROV-P: NH2- (CH2)6~Pol (off) 15"TTATGTCTGTATTATOCMCTGMGCMGTACOMTCMTGATGGTG/OGG;
所述NOV病原体探针序列为NOV-P: NH2- (CH2)6"Po1 (dT) 15""GGTAGCAGMGACCTTCnTCTCCTAG0GTGGTGGATGTGGGTGACTTCACMTATCMTCM0GAG;
所述ASV病原体探针序列为ASV-P: NH2- (CH2)6"Po1 (dT) 15""GMTTCGTTGTCAT舰0CAGGTGCATrATGTGrrATAGACA000CTGAAGGAAAAGGGACAGGTT;
所述ADV病原体探针序列为ADV-P: NH2- (CH2)6~Pol (dT) 15"CrACrT0GTATAnurGGATCTATT0OCrAOCTGGATGGCACCrTCTAOCTTMOCACACrTTCMG;
所述芯片的阵列布局如图1所示。
本发明所述的同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片在检测海洋环境中人致病性肠道病原体病毒中的应用。
其中所述同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片应用于同时检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和肠道腺病毒。
上述芯片应用方法是采用Tamara荧光染料分别标记五种病毒下游引物的5'末端，然后对待检样本中设定的HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒靶基因进行多重PCR扩增将Tamara掺入到靶序列，实现对待检样本中病原体特异基因的同时扩增标记，然后与经37'C水合、3600raJ条件下紫外交联、2. 6g/L的NaBH4还原过程处理后的权利要求l所述寡核苷酸芯片在杂交盒中65。C杂交6 8h，然后将芯片洗脱甩干后用Scanarray 4000扫描仪扫描，用Quantarray 3, 0定量分析软件分析扫描图像的荧光强度值以确定标本中是否具有病原体。
其中所述HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒靶基因是HAV的VPS基因(AF396408)、R0V的VP7基因(AB118022)、N0V的NSP基因(EU703722)、 ASV的NSP区基因(AB308374)和ADV的六邻体基因(AY027809)。
上述杂交中使用的杂交液成分是50%甲酰胺、5XSSC、 0,5%SDS、 0, P/。鲑鱼精DNA。上述洗脱中使用的洗脱液成分是2XSSC、 0.2冗SDS和2XSSC。
本发明的长片断寡核苷酸芯片能同时检测引起人类腹泻的多种肠道病毒，极适用于海水及海贝样本的检测。应用本发明所述的下游引物Tamara标记和多重PCR扩增寡核苷酸芯片技术体系能进一步研究开发包括检测其他水质环境中肠道病毒的寡核苷酸芯片及相应的应用。
试验结果显示本发明的寡核苷酸芯片检测结果与PCR法检测结果无显著性差异，两者具有较高的符合率。
本发明建立的基于下游引物Tamara标记和多重PCR扩增的长片段寡核苷酸芯片技术体系与现有的单个病毒的检测技术相比，具有灵敏度与PCR相当、但是特异性高的特点，是一种具有广泛应用前景的技术体系，能广泛适用于海洋环境检测，卫生监督，海关检
疫及科研等领域。
图l为本发明的寡核苷酸芯片阵列分布其中@:阳性对照；@:阴性对照；(g):空白对照；①,⑥为HAV探针；②，⑦:ROV探针；③，⑧NOV探针；④,⑨ASV探针；⑤,⑩ADV探针。
图2不同探针浓度对杂交荧光强度的影响；
其中每个浓度点4为四个平行重复点， 一张芯片点两个阵列，从左往右依次为50uM 、 30uM 、 lOuM 、 5uM四个不同浓度。图3不同浓度的荧光标记产物的杂交结果；
其中A E依次为核酸浓度依次为100pg/u 1、 10pg/ii 1、 lpg/u 1 、 0. lpg/ti 1、0.01p官/u;左上角四个点为阳性对照。图4五种病原体探针特异性检验结果；
其中A为HAV两条探针杂交结果；B为ROV两条探针杂交结果；C为NOV两条探针杂交结果；D为ASV两条探针杂交结果；E为ADV两条探针杂交结果，左上角四个点位阳性对照。
图5以ASV探针为对象同批次寡核苷酸芯片重复性检测结果。其中A、 B、 C为标记产物在同一批次的杂交结果；左上角四个点为阳性对照。图6以ASV探针为对象不同批次寡合苷酸芯片重复性检测结果。其中A为标记产物第一次的杂交结果；B第二次的标记产物与芯片的杂交结果；C第三次的标记产物与芯片的杂交结果。阵列分布同图5。图7 Tamra标记的海洋贝类样本PCR的杂交结果；
其中A E依次为单一感染HAV、 R0V、 NOV、 ASV和ADV其中一种病毒的海贝阳性样本多重PCR扩增结果的杂交结果。F 1为感染两种病毒海贝样本多重PCR扩增产物的杂交结果。
具体实施例方式
实施例1下游引物Tamara标记多重PCR扩增标记方法的寡核苷酸芯片制备及杂交方
法
1.探针的设计合成
利用探针设计软件ArrayDesigner4.2，设计五种病毒特异探针，同时设计阳性对照
探针(pc)、阴性对照探针(m:)各一条，序列如下所示
HAV-P: NH2-咖)6"Pol(dT)15"TTAAAGAT0CACAGTAT0CAGnTGGGMTTMCMTCAGAGnTGGTCAGAGCTGAACATTGGMCAG;
R0V-P: (NH2-咖)6~Pol (dT) 15~TTATGTCTGTATTAT0CAACTGAAGCAAGTACTCAMTCMTGATGGTGACTGG;
NOV-P: NH2-咖)6~Pol (dT) 15~GGTAGCAGAAGA0CTIUrrTCnrrAGCGTGGTGGATCTGGGTGACTTCACAATATCAATCAAOGAG;
ASV卡NH2-咖)6"Po1 (dT) 15"GMrT0GTTGTCAT農0CAGGTGCATTATGTGTTATAGACAC00CTGMGGAAAAGGGACAGGTT;
ADV"P: NH2-咖)6"Pol(dT)15"CrAaT0GTATATrCrGGATCrArr00CTA0CrGGATGG
CAOCnUTAOCTTMOCACAaTTCMG;
PC:隆(CH2) frPoly(dT) 15"T腿。IC: NH2- (CH2) 6~Poly(dT)152.芯片的制备
选择上述设计的5条探针用3XSSC分别稀释成20raM/L，采用Cartisan5500点样仪将探针点至到醛基化修饰的玻片表面上，每个探针点四个重复，以Tamara修饰的探针(PC)为阳性对照，以乙脑探针(tC)为阴性对照，双蒸水为空白对照。每个对照也点四个重复，阵列上探针的分布如图1所示.在湿盒中进行水合温育,水和温度为37°C。过夜干燥。UV交联，紫外能量为3600 mj，将芯片放于2。6g/L的NaBH4还原10min,洗脱后4 'C避光保存备用。3.耙基因的标记
下游引物Tamara标记方法多重PCR选择HAV的VPS基因(AF396408) , ROV的VP7 gene基因(AB118022) ， NOV的NSP基因(EU703722) ， ASV的5，端NSP区基因(AB308374)， ADV的Hexon(六邻体)基因(AY027809)扩增标记。扩增体系10Xbuffer5ul ， 25 mmol/L MgCl23p 1, 0. 25画1 / L d,l u 1 ， 20 u mo1/1上下游引物各1。 5ul (其中下游引物5，末端为Tamara荧光标记)，DNA模板5p1. rTaq DNA聚合酶0, 5Ul， ddH2035nl,短暂离心。扩增程序94。C5min， 94。C45s， 42。C45s, 72。C延伸lmin。扩增35个循环，72'C延伸10min。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果，余下进行芯片杂交。
4. 样品检测
将荧光标记的靶DNA PCR扩增产物溶于杂交液中(5XSSC 、 0. 5%SDS、 50%甲酰胺、0.W鲑鱼精DNA),取标记的DNA溶液加到芯片的表面，加盖玻片(小心不要有气泡)放入杂交盒中，65。C杂交8h;取出后，先用2XSSC(0,2 MSDS)冲洗，然后用2XSSC洗涤，再离心甩干。将芯片用Scanarray 4000扫描仪扫描，扫描参数为激光强度100%， PMT100 %。用Quantarray 3, 0定量分析软件分析扫描图像的荧光强度值。计算出每个阵列中阴性对照点4个重复点的平均值(mean)和标准差(s)，得出95%的参考范围(均数土2s)然后计算出每种探针的4个重复点荧光值的平均值，若此平均值高于均数+2为阳性，低于均数-2s则为阴性，对结果进行判读。
5. 芯片的稳定性及重复性检测以ASV病毒为例，对同一批芯片进行三次平行杂交，对不同批次进行杂交，测定芯片的稳定性和重复性。结果显示同一批次的变异系数为1.42，不同批次的变异系数为1.5%。，
实施例2芯片制备条件的优化
1.1探针点样浓度的优化选用ASV标准株进行DNA扩增标记,采用醛基化玻片为基片，采用Pixy5500点样仪用SMP2点样针以不同浓度点样，点样浓度分别为50umol/L、30umol/L、 10umol/L、 5wmol/L，共4个梯度，选择杂交效果最好的点样浓度。
经过3次重复试验表明，探针浓度在10umol/L时，荧光强度已经达到肉眼可见清晰的杂交信号。
1. 2紫外交联的优化选用ASV标准株进行DNA扩增标记，采用醛基化玻片为基片，紫外交联的能量分别选择1200mJ、 2400mJ和3600mJ，选择杂交效果最好的交联能量。
经过3次重复试验表明紫外交联的能量选择3600mJ杂交效果最好。
61.3杂交温度和杂交时间的优化实验中通过对杂交液(50%甲酰胺、5XSSC、0.5%SDS、 0. 1%鲑鱼精DNA)在不同温度(温度分别为50 °C、 55 。C、 65 。C)、不同杂交时间(杂交时间分别为2 h、 4 h 、 6 h、 9 h)的条件下杂交信号的比较，来选择长片段探针最优化的杂交条件。
经过3次重复试验表明杂交时间为6h以上，杂交温度为65 'C可以获得最高的荧光强度。
结果确定
1. 探针浓度的确定
芯片杂交洗脱后，经过扫描得到不同浓度的探针杂交后的扫描荧光强度。扫描结果如图3所示，可以看出探针浓度在10 ii mol/L时就可以得到满意的效果，因此实验中采用10 ixmol/L作为最终探针点样浓度。
2. 寡核苷酸微阵列对靶基因检测敏感性的确定
以ASV为实验菌株，提取其基因组DNA，各取2 u 1作为模版进行荧光标记扩增，标记产物用核酸定量仪进行DNA定量，然后用双蒸水l: IO定量稀释为浓度为100pg/ul、10pg/yl、 lpg/ul、 0. lpg/ix、 0.01pg/yl五个浓度，与芯片杂交，结果显示在浓度为lpg/P 1时，荧光强度值高于阳性点荧光值的均数+2s，显示其敏感性为1pg。
3. 优化芯片的杂交条件
采用70mer寡核苷酸探针，探针点样后37'C水合，然后在3600mJ条件下进行紫外交联固定效果最好。杂交液成分为50%甲酰胺、5XSSC、 0.5%SDS、 0. 1%鲑鱼精DNA，杂交时间为6-8h，杂交温度为65°C。
实施例3.五种病毒的长片段寡核苷酸芯片对海洋环境标本的检测结果
应用本发明的以下游引物Tamara标记和多重PCR扩增的寡核苷酸芯片进行海洋贝类样本五种肠道病原体标本检测，方法如实施例l，结果见表l。
表l:海洋贝类样本五种肠道病原体标本检测结果
HAVROVNOVASVADV
+ -+ -+ .+ -+ -
Per detection11 1498 15229 13111 14918 142
Chip detection7 15310 15024 1369 15116 144
Chi-square test =119.891义2 =59.173,2=96.718,2=135.73义2 =127.5
p =0.250j3 =0.687p =0.227p =0.500p =0.625
Kappa values0.8830.6480.7540.8940.869
sensitivity72.73%75%72.41%81.80%83，33*M>
specificity100%97.50%97.84%100%99.30%
a) Kappa〉0。75，consistency is satisfactory :b)p>0. 05，no significance
结果显示本发明的寡合苷酸芯片检测结果与PCR检测法相比，结果无显著性差异，
7两者具有较高的符合率。但是与PCR相比有更高的检测特异性，适合海洋环境及海产品检测。
综上所述，本发明的基于下游引物Tamara标记和多重PCR扩增的寡核苷酸芯片与海洋环境中存在的五种肠道病毒的常规检测的PCR方法相比符合率较高，建立的70mer长片段寡核苷酸芯片技术体系与现有的PCR单个检测方法相比，敏感性相当、特异性高的特点，是一种具有广泛应用前景的技术体系。序列表
〈110〉山东省医药生物技术研究中心
<120>—种同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片及其应用
<141>2009-7-8
<160>6
<210〉1
<211>69
<212>DNA
<213>AX)W!J <221>HAV~P DNA序列 〈222〉(1)…(69) <400>1
ttaaagatcc acagtatcca gtttgggaat taacaatcag agtttggtca gagctgaaca 60 ttggaaceig 69
<210〉2
<211>54
<212〉DNA
〈213〉AX)^U
〈221>R0V-P DNA序列
〈222〉(1)…(54)
<400>2
ttatgtctgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatca atgatggtga ctgg 54
〈210〉3
<211〉67
<212>薩
〈213>AX/^iJ
〈221>N0V-P DNA序列
〈222〉(1)…(67)
<400>3
ggtagcagaa gaccttcttt ctcctagcgt ggtggatgtg ggtgacttca caatatcaat 60 caacgag 67<210>4
<211〉67
<212〉DNA
〈213〉AI^U <221>ASV-P DNA序列 〈222〉(1)…(67) 〈400>4
gaattcgttg tcataaaacc aggtgcatta tgtgttatag acacccctga aggaaaaggg 60 acaggtt 67
<210〉5
<211>67
〈212>腿
〈213〉AX)WJ
〈221>ADV-P DNA序列
〈222〉(1)…(67)
〈400>5
ctacttcgta tattctggat ctattcccta cctggatggc accttctacc ttaaccacac 60 tttcaag 67
〈210>6
〈211〉70
<212>DNA
〈213〉AX)WlJ 〈221>JEV DNA序列 〈222〉(1)…(70) <400〉6
gtgcaaacaa ggtttcactg atcgtgggtg gggcaacgga tgtggacttt tcgggaaggg 60 aagcattgac 70
权利要求
1.一种同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片，由表面醛基化修饰的载玻片基片和阵列涂布于其上的五种肠道病毒病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其中所述阴性对照为点样浓度为10μM的JEV探针，其序列为NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-GTGCAAACAAGGTTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGAC；所述阳性对照为点样浓度为10μM的合成标记探针，探针的序列为NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamara；所述空白对照为双蒸水；其特征在于所述五种肠道病毒病原体探针是5条54～70mer的、点样浓度均为10μM的HAV、ROV、NOV、ASV和ADV病原体探针；其中所述HAV病原体探针序列为HAV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-TTAAAGATCCACAGTATCCAGTTTGGGAATTAACAATCAGAGTTTGGTCAGAGCTGAACTTTGGAACAG；所述ROV病原体探针序列为ROV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-TTATGTCTGTATTATOCAACTGAAGCAAGTACTCAAATCAATGATGGTGACTGG；所述NOV病原体探针序列为NOV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-GGTAGCAGAAGACCTTCTTTCTCCTAGCGTGGTGGATGTGGGTGACTTCACAATATCAATCAACGAG；所述ASV病原体探针序列为ASV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-GAATTCGTTGTCATAAAACCAGGTGCATTATGTGTTATAGTCACCCCTGAAGGAAAAGGGACAGGTT；所述ADV病原体探针序列为ADV-PNH2-(CH2)6-Pol(dT)15-CTACTTCGTATATTCTGGATCTATTCCCTACCTGGATGGCACCTTCTACCTTAACCACACTTTCAAG；所述芯片的阵列布局如图1所示。
2. 权利要求1所述同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片在检测海洋环境中人致病 性肠道病原体病毒中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸 芯片应用于同时检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和肠道腺病毒。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述芯片应用方法是采用Tamara荧光 染料分别标记五种病毒下游引物的5'末端，然后对待检样本中设定的HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒靶基因进行多重PCR扩增将Tamara掺入到靶序列，实现对待检样本中病 原体特异基因的同时扩增标记，然后与经37X:水合、3600mJ条件下紫外交联、2. 6g/L的 NaBH4还原过程处理后的权利要求1所述寡核苷酸芯片在杂交盒中65'C杂交6 8h，然 后将芯片洗脱甩干后用Scanarray 4000扫描仪扫描，用Quantarray 3. 0定量分析软件 分析扫描图像的荧光强度值以确定标本中是否具有病原体。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述HAV、 R0V、 N0V、 ADV和ASV病毒耙 基因是HAV的VPS基因(AF396408)、 ROV的VP7基因(AB118022)、 NOV的NSP基因(E訓3722)、 ASV的NSP区基因(AB308374)和ADV的六邻体基因(AY027809)。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测五种肠道病毒的寡核苷酸芯片及其应用，所述芯片由基片和涂布于其上的五种肠道病毒病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其中所述病原体探针是5条54-70mer的HAV-P、ROV-P、NOV-P、ASV-P、ADV-PV1探针；本发明采用多重PCR对多种病原体靶序列进行同时扩增，采用下游引物Tamara标记的方法对PCR产物进行荧光标记，标记的PCR产物与芯片进行杂交实现对病原体准确检测，检测灵敏度与PCR相当，特异度高。检测效率和准确性明显缩短。本发明的技术体系适用于海水及海洋生物标本监测，食品卫生监督，海关检疫及相关的临床检测等领域。
文档编号C12Q1/70GK101654713SQ20091001773
公开日2010年2月24日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者岳龙涛, 樊景凤, 韩金祥, 高雪芹 申请人:山东省医药生物技术研究中心;国家海洋环境监测中心