专利名称：：一种假单胞菌酯酶及其用于制备光学纯扁桃酸及其衍生物的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株假单胞菌以及利用该菌株所产酯酶催化2-乙酰氧基苯乙酸对映选择性水解(脱乙酰化)生产光学扁桃酸或其衍生物的用途。
背景技术：
：扁桃酸(a-羟基苯乙酌是一种重要的化工和制药中间体，其中光学纯的扁桃酸具有独特的生理功能，在制药工业中主要被用作关键的手性砌块，(5)-扁桃酸可以合成治疗尿失禁的药物，(i)-扁桃酸可以用于合成e-内酰胺阻断剂。光学纯的扁桃酸也是常用的手性化合物拆分试剂，具有非常重要的商业价值和广阔的应用前景。所以，如何获得纯的扁桃酸单一对映体就成为人们所关注和研究的重要课题。目前制备光学纯扁桃酸的方法主要分为物理法、化学法和生物法。物理方法主要是利用色谱法结合光学衍生物拆分扁桃酸，代价高，处理量小，其工业应用价值不大。化学方法主要是用其它手性试剂拆分(例如UnitedStatesPatent4,260,815)和酸碱拆分(UnitedStatesPatent4,259,521)，不仅步骤多、过程繁琐，产品的得率和光学纯度也不能令人满意。生物法的应用较为广泛，常见的有利用氧化酶直接拆分扁桃酸外消旋体(Tetrahedron:Asymmetry,2005，16:2113-2117)，利用还原酶不对称还原苯甲酰甲酸(UnitedStatesPatent6,777,224)，利用单加氧酶催化苯乙酸的直接羟化反应(Tetrahedron:Asymmetry,2007,18:2537-2540)，利用腈基水解酶催化扁桃腈水解反应(UnitedStatesPatent5，296,373)和利用酯水解酶催化水解扁桃酸的酯化产物，例如扁桃酸甲酯和扁桃酸乙酯(EnzymeMicrobialTechnology,2006，39:930-935)等方法。但至今尚未见有利用酯水解酶催化扁桃酸的2-羟基乙酰化产物水解而制备光学纯扁桃酸的报道。
发明内容本发明目的之一在于，提供一种能够生产(5)-扁桃酸及(及)-扁桃酸的的假单胞菌;本发明目的之二在于，提供利用上述的假单胞菌生产(S)-扁桃酸及(i)-扁桃酸的用途。本发明人从土壤中经过筛选和分离，得到一株能够选择性催化2-乙酰氧基苯乙酸对映选择性水解生产(5)-扁桃酸及(i)-扁桃酸的假单胞菌/^/^owomwsp.ECU1011，该菌株已于2009年1月13日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号为CGMCCNo.2872。本发明的菌株具有如下微生物学特征1.微观形态特征球状，不产芽孢，革兰氏染色阴性，大小约为2pmX3阿。2.平板固体培养基上的菌落特征(3(TC培养24h):圆形，边缘整齐；低凸面；乳白色。3.生长环境可在温度1050'C生长，在pH5-9，盐浓度07。/。(w/v)的条件下生存。本发明的菌株i^ew由wo"assp.ECU1011(保藏号CGMCC2872)主要用于对映选择性水解2-乙酰氧基苯乙酸以得到(S)-扁桃酸及(i)-扁桃酸，其主要操作步骤如下将CGMCC2872菌株接种至丰富培养基，接种量为1~10%(v/v)，在2040'C(优选2535。C)状态下培养l3天，离心洗涤之后得到菌体。其中丰富培养基的组成为甘油15g，蛋白胨5g，酵母膏5g，NaCllg，MgS040.2g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，自来水1000ml，将pH值调节为7.0，经121。C灭菌20分钟。将摇瓶培养得到的菌体加入到含有底物的缓冲溶液中，催化底物的对映选择性水解，分离得到(5)-扁桃酸及剩余的(i)-2-乙酰氧基苯乙酸，其中(及)-2-乙酰氧基苯乙酸经由化学方法水解并且重结晶后，可得到(i)-扁桃酸。此生物催化拆分过程的菌体浓度为10200g/1，底物浓度为10100mM，反应温度为2045'C，pH5.0~9.5，反应时间为0.524h。底物的转化率和产物的对映体过量值("p)采用液相色谱分析，分析条件为手性OD-H柱(ChiralcefOD-H柱，cp4.6mmx250mm，日本Daicel公司出品)；流动相正己烷/异丙醇/三氟乙酸(94:6:0.2,v/v)，流速为lml/min;紫外检测器，波长228nm;柱温25'C。出峰时间(/)-扁桃酸，20.5min;(5)-扁桃酸，18.4min;(及)-2-乙酰氧基苯乙酸，13.9min;(5)-2-乙酰氧基苯乙酸，12.6min。上述缓冲溶液可以是pH为5.09.5的磷酸盐、柠檬酸盐或甘氨酸一NaOH缓冲液。上述底物的最佳选择是2-乙酰氧基苯乙酸，也可以是2-乙酰氧基-2，-氯苯乙酸、2-乙酰氧基-3，-氯苯乙酸和或2-乙酰氧基-4，-氯苯乙酸。本发明所设计的酶促拆分的产物(5)-扁桃酸及(及)-扁桃酸的光学纯度高，对映体过量值^)可以达到98.1%和>99%，转化率接近50%的理论最大转化率；催化剂稳定性良好，具有广泛的工业应用前景。下面通过具体的实施例对本发明的内容作进一步的阐述。实施方式以下通过实施例对本发明的技术内容做进一步描述，其目的在于更好地理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围。实施例l菌株CGMCC2872的培养将菌株CGMCC2872接种到含有丰富培养基的种子液中，在30'C，180rpm下培养12小时；其中丰富培养基组成为甘油15g，蛋白胨5g，酵母膏5g，NaCllg,MgS040.2g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，自来水1000ml，调节pH值为7.0。将种子液接种至丰富培养基中，接种量为5。/。v/v,在30'C、180rpm下培养18小时。培养结束后，于IO，OOOrpm离心得到含酶菌体。实施例2不同候选菌株对于乙酰氧基苯乙酸的水解按照实施例1所述方法得到不同候选菌株的湿菌体用浓度为0.85%w/v的生理盐水洗漆3次，按照lg湿菌体对10ml反应液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸浓度为20mmol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，在30'C，180rpm条件下反应12小时后加入0.1。/Dv/v的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，振荡萃取l分钟，离心取上清液，加入无水硫酸钠静置过夜，以液相色谱仪检测反应的转化率和产物的光学纯度。表l候选菌株的催化性能比较微生物菌株反应时间(h)eep(%)转化率(％)ECUlOll1898.145.5ECU10121290.447.3ECU10131293.534.5ECU10141288.946.4ECU10151291.850.5ECU10161693.749.0ECU10171297.644.4ECU10181286.430.2表1结果说明从土壤中筛选的这8株菌均具有很高的对映选择性催化活性，其中ECUlOll(保藏号CGMCC2872)在底物的转化率和产物的光学纯度方面效果较好。实施例3不同底物浓度对CGMCC2872反应特性的影响按照实施例1所述方法培养得到CGMCC2872的湿菌体，用浓度为0.85%w/v的生理盐水洗涤3次，按照lg湿菌体对10ml反应液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸浓度分别为5、10、20、40、60和100mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，在30'C，180rpm条件下反应一定的时间，确认反应完全后，加入0.1。/。v/v的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，震荡1分钟，离心取上清液，加入无水硫酸钠静置过夜，用液相色谱仪检测反应的转化率和产物的光学纯度。表2不同的底物浓度对CGMCC2872反应特性的影响底物浓度(mmol/L)反应时间(h)eep(%)转化率(％)5498.147.510698.048.3620898.045.5401298.147.4601697.249.61004895.520.8表2结果显示，在0-60mmol/L范围内的不同底物浓度下，CGMCC2872能够始终达到良好的反应速率和产物光学纯度。当底物浓度在100mmol/L附近时，菌株CGMCC2872由于受到高浓度酸性底物的影响，菌体活力有所下降，反应速率有所减慢，可以通过增加菌体浓度或酶的活力来解决。实施例4不同温度对CGMCC2872反应特性的影响按照实施例1所述方法培养得到的CGMCC2872湿菌体，用浓度为0.85%w/v的生理盐水洗涤3次，按照lg湿菌体对应10ml反应液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸浓度为20mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，分别在20、25、30、35、40、45和50'C，180rpm条件下反应2小时，确认反应完全后，加入0.1%(v/v)的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，震荡1分钟，离心取上清液，加入无水硫酸钠静置过夜，以液相色谱仪检测反应的转化率和产物的光学纯度。表3不同温度对CGMCC2872反应性能的影响反应温度('C)反应时间(h)eep(%)转化率(％)25298.212.330298.019,135298.026.340298.136.045292.437.550269.550.4表3结果显示，在温度低于30'C的时候反应速率较慢，在3040'C下可以达到较好的反应效果，在40'C以上的温度下虽然反应速度更快，但是产物的光学纯度下降较多，主要是因为在较高的温度下底物的自发水解反应比较严重，无选择性的自发水解导致了产物光学纯度的下降。实施例5不同pH对CGMCC2872反应性能的影响按照实施例1所述方法得到CGMCC2872湿菌体用浓度为0.85%w/v生理盐水洗涤3次，按照lg湿菌体加入10ml反应液的比例，加入到底物2-乙酰氧基苯乙酸浓度为20mmol/L的pH5.0的柠檬酸盐缓冲溶液、pH6.0、6.5、7.0和8.0的磷酸盐缓冲溶液以及pH9.0的甘氨酸一氢氧化钠缓冲溶液中，分别在30'C，180rpm条件下反应2小时左右，确定反应完全后加入0.1%v/v的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，振荡萃取l分钟，离心取上清液，加入无水硫酸钠静置过夜，以液相色谱检测反应的转化率和产物的光学纯度。表4不同pH对CGMCC2872反应性能的影响pH反应时间(h)eep(%)转化率(％)5.0297.14.76.0298.022.76.5298.019.57.0298.118.38.0296.410.69.0266.93.1表4结果表明，在pH6.07.0的弱酸性范围内，反应可以达到较好的转化率和产物光学纯度。在pH6.0以下，反应速度下降；在pH7.0以上，反应速度和产物的光学纯度都有所下降。说明在酸性和碱性环境下菌体的酶活力有所下降，在碱性环境下底物的无选择性自发水解明显加剧，影响了产物的光学纯度。实施例6菌株CGMCC2872对扁桃酸衍生物的水解反应结果按照实施例1所述方法得到的CGMCC2872湿菌体用浓度为0.85%w/v生理盐水洗涤3次，按照lg湿菌体对10ml反应液的比例，加入到分别含有20mmol/L2-乙酰氧基苯乙酸、2-乙酰氧基2，-氯苯乙酸、2-乙酰氧基3，-氯苯乙酸、2-乙酰氧基4'-氯苯乙酸、扁桃酸甲酯和扁桃酸乙酯的pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，分别在3(TC，180rpm条件下反应12小时左右，确认定反应完全后，加入0.1%v/v的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，振荡萃取l分钟，离心取上清液，加入无水硫酸钠静置过夜，以液相色谱仪检测反应的转化率和产物的光学纯度。表5菌株CGMCC2872对扁桃酸及其衍生物的水解拆分反应结果底物产物构型eep(%)转化率(％)HPLC检测用柱2-乙酰氧基苯乙酸98.145.7ChiralcelOD-H2-乙酰氧基-2，-氯苯乙酸97.244.2Chiralcel②AD-H2-乙酰氧基-3'-氯苯乙酸97.140.2Chiralcel②OD-H2-乙酰氧基-4，-氯苯乙酸97.550.7ChiralcelOD-H扁桃酸甲酯42.123.6Chiralcel⑧OD-H扁桃酸乙酯39.556.7Chiralcel頃AD-H表5结果表明，对于可以归属于扁桃酸及其衍生物的乙酰化产物的底物，假单胞菌株CGMCC2872对它们的催化水解反应都具有对映体选择性。对于扁桃酸的酯化产物，则菌株CGMCC2872对其催化水解的选择性不甚理想。实施例7添加有机溶剂对菌株CGMCC2872催化反应性能的影响按照实施例1所述方法得到的CGMCC2872湿菌体，用浓度为0.85%w/v的生理盐水洗涤3次，按照lg湿菌体对应10ml反应液的比例，加入到乙酰氧基苯乙酸浓度为20mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，分别加入体积含量为5%8种有机溶剂1)9DMSO,2)DMF,3)MeOH,4)EtOH,5)1-PrOH,6)2國PrOH,7)Glycol,或8)EtOAc,在30°C，180rpm条件下反应12小时，确定反应完全后加入0.1%v/v的浓硫酸终止反应。加入氯化钠和乙酸乙酯，振荡萃取l分钟，离心取上清液，加入无水硫酸钠静置过夜，以液相色谱仪检测反应的转化率和产物的光学纯度。表6添加有机溶剂对菌株CGMCC2872反应性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6结果显示，添加有机溶剂对此反应的选择性及反应速率并无明显促进作用。实施例8利用CGMCC2872菌体制备光学纯(5)-扁桃酸及(及)-扁桃酸按照实施例l中所述方法，在lL丰富培养基中培养得到CGMCC2872湿菌体10g,加入100ml乙酰氧基苯乙酸浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，30'C，180rpm条件下反应12小时，反应结束后加入0.1%v/v的浓硫酸终止反应。加入氯化钠去除乳化，用60ml乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，加入无水硫酸钠过夜。旋转蒸发萃取液得到黄色液态的产物与底物混合物。用少量乙酸乙酯溶解后通过硅胶柱层析进行分离，流动相为乙酸乙酯:石油醚:甲酸=10:1:0.2^/力，将分离后的底物和产物分别加入无水硫酸钠过夜。旋转蒸发后得到(5)-扁桃酸和(及)-乙酰氧基苯乙酸，前者为白色晶体，后者为黄色液体，久置后为淡黄色晶体。将(及)-乙酰氧基苯乙酸溶解于浓度为5%的稀氨水中，50°C,180rpm条件下反应12小时得到(及)-扁桃酸溶液，加浓硫酸调pH到l之后加入乙酸乙酯萃取，重结晶后得到(i)-扁桃酸晶体。最终得到(5)-扁桃酸的光学纯度为98.1。/。ee,得率为20.4%;(及)-扁桃酸的光学纯度>99%ee,得率为17.3%。权利要求1.一种产酯酶的假单胞菌Pseudomonassp.ECU1011，保藏号为CGMCCNo.2872。2.—种以权利要求1所述的假单胞菌生产光学纯扁桃酸及其衍生物的用途，其特征在于催化外消旋的2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物生产(5)-扁桃酸或其衍生物。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于将权利要求1所述的假单胞菌尸w^to/nomwsp.ECU1011进行发酵培养，以培养后的整体细胞作为催化剂，在磷酸盐缓冲液中，催化外消旋的2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物的对映选择性水解反应，然后从反应混合物中收集水解的产物(5)-扁桃酸或其衍生物，以及残余的底物(及)-2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的残留的(及)-2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物再进行化学水解和重结晶，再得到(i)-扁桃酸或其衍生物。5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的细菌发酵培养的培养基组成如下甘油10~80g/L，蛋白胨1~20g/L，酵母膏1~20g/L，NaCl0.1~3g/L,MgS040.1~3g/L，KH2PO40.1~3g/L。6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，发酵培养的条件为pH5~9，温度15~40°C，相对于发酵培养基体积的接种量为l~10%v/v，培养时间为12-48h。7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的水解反应所用的缓冲液为磷酸盐、柠檬酸盐或者甘氨酸一氢氧化钠缓冲液。8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的底物为羟基被酰化的扁桃酸或其衍生物。9.根据权利要求3或8所述的用途，其特征在于，所述的底物浓度为10~100mM，反应温度为20~50°C，反应时间为l24h。全文摘要本发明公开了一株产酯酶的假单胞菌以及使用该菌所产的酯酶催化2-乙酰氧基苯乙酸或其衍生物的对映选择性水解，制备(S)-扁桃酸、(R)-扁桃酸或其衍生物的用途。所述的酯酶为利用土壤分离菌—假单胞菌Pseudomonassp.ECU1011(保藏号为CGMCCNo.2872)培养所得的菌体。采用本发明公开的假单胞菌酯酶催化2-乙酰氧基苯乙酸的对映选择性水解生产(S-扁桃酸及(R)-扁桃酸的工艺新颖，反应条件温和，产物和底物的对映体纯度高，对映体过量值(ee)分别为98.1％和＞99％。该生物催化剂的底物谱广泛，可用于多种扁桃酸衍生物的手性拆分，具有很好的工业应用前景。文档编号C12R1/38GK101538542SQ200910049768公开日2009年9月23日申请日期2009年4月22日优先权日2009年4月22日发明者江潘,许建和,鑫鞠申请人:华东理工大学