专利名称：草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉水生动物病毒的诊断试剂盒及其应用，主要是针对草鱼呼肠孤病毒 (GCRV，Grass carp reovirus)第六基因片段保守部分的诊断试剂盒及检测方法。
背景技术：
草鱼出血病病毒(Grass Carp Hemorrhage Virus, GCHV)，属于水生呼肠孤病毒， 病毒颗粒为二十面体对称的球形颗粒，其成熟病毒直径为75nm，具有双层衣壳，无囊膜，其 基因组由11条dsRNA组成，在pH3-ll范围内十分稳定，对氯仿和乙醚有抗性。国际病毒分 类委员会第五次会议决定在呼肠孤病毒科中正式新建水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus， ARV)，并将草鱼出血病病毒纳入该属，命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)，但有别于其它六个亚型(A-F)的水生呼肠孤病毒的代表种，而单独列为第七个亚型 (G)的代表种。GCRV是我国分离的第一种鱼类病毒，也是中国在国际上首次完成全基因序 列分析的第一株水生呼肠孤病毒，并且各基因序列已登录GenBank。该病毒是水生呼肠孤病 毒属中毒力最强的病毒，能引起草鱼出血病的流行。该病流行于我国各地养殖区，尤以长江 流域和广东、广西、福建最为普遍，流行季节在每年5月初和10底之间，水温在20°C开始流 行，最适流行水温为27°C -30°C，死亡率可达50% -80%。每年造成数万吨鱼产量损失，严 重影响我国草鱼养殖业的发展。目前对于草鱼病毒病还未有特效的治疗方法，推行草鱼的 健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。早期快速诊断草鱼呼肠 孤病毒是目前草鱼养殖所采取的主要预防措施的前提，也是减少草鱼损失的有效途径，因 此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大草鱼养殖者急切盼 望的。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来 的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方 法建立后，很快被应用于实践中。虽然关于GCRV RT-PCR方法也有文献报道，但只有用于设 计引物的原株病毒为PCR阳性，扩增不出其它GCRV的相应片段，本试验根据GenBank已发 表的GCRV及其它水生呼肠孤病毒的第六基因片段，在保守区设计了一对GCRV特异性引物， 建立了 GCRV快速诊断方法，在国内外尚无报道。该方法的建立为草鱼呼肠孤病毒的快速诊 断和病原调查提供技术支撑。
发明内容
本发明目的是利用GCRV基因保守区序列设计一对引物，建立GCRVRT-PCR反应体 系，在此基础上优化和设计，提供草鱼呼肠孤病毒的快速基因诊断试剂盒和检测方法。该试 剂盒操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于草鱼出血病的快速检测及草鱼鱼种 和草鱼养殖过程中的GCRV的跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率；也可用于 草鱼肾细胞系(CIK)分离病毒的鉴定，为病毒的进一步研究奠定基础，具有很高的实用价 值。本发明提供的草鱼呼肠孤病毒的基因诊断试剂盒包括
1)内脏组织中病毒 RNA 提取试剂=DEPC /K ；蛋白酶 K(lmg/mL，pH8. 0) ；SDS(1% )； 酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70%乙醇；2)细胞感染病毒的RNA提取试剂=Trizol ；氯仿；异丙醇；70%乙醇；DEPC水；3)RT反应试剂成分:5XAMV Buffer, dNTP, DEPC水，，反向引物Rl，RNA酶抑制剂 RNAsin (RI)，反转录酶 AMV ；4) PCR 反应试剂成分10 X PCR buffer (含 mg2+)，dNTP Mixture (各 2. 5mmol/L)； 特异性寡核苷酸引物Fl和引物Rl ；DEPC水和Taq E(5U/uL)，5)所述的特异性寡核苷酸引物Fl和Rl 是根据GCRV第六基因片段保守区序列设 计的，其DNA序列分别如下正向引物Fl :5，-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3，反向引物Rl 5，-TTGGAGACGAACATAGACGC-3使用草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因诊断试剂盒检测方法程序如下(1)肝脾肾组织中病毒RNA的提取发病鱼的组织60-100mg加入500 μ L DEPC水捣碎勻浆，8，000-10，000r/m离心 5-10min，取上清，加40 μ L蛋白酶K和40 μ Ll % SDS，37°C孵育30min ；再加入600 μ L酚 /氯仿/异戊醇((25/24/1))，充分混勻30S, 10，000-12，000r/m离心5-lOmin，取上层水 相；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1))混合液，充分混勻30S，10，000-12，OOOr/m离心 5-lOmin取上层水相；加入等体积的异丙醇，混勻后室温15-20min或_20°C lh_2h，沉淀核 酸，12，OOOrpm离心lOmin，弃上清，70%乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。(2)草鱼肾细胞(CIK)感染病毒的RNA的提取染毒的CIK细胞液反复冻融三次，取250 μ L病毒悬液，加750 μ L Trizol高速混 勻，室温3-5min,再加200 μ L氯仿剧烈摇晃，室温3_5min ；12, 000r/m离心10_15min，吸上 清450-500 μ L，再加入等体积异丙醇，室温沉淀15-20min，12，000r/m离心10_15min，70 % 乙醇洗涤，吹干。再加入适量DEPC水溶解，备用。(3) RT-PCR 扩增RT反应反应体系共25 μ LRNA 模板13.5yLRnasin (RI) 0. 5 μ L (20U)所述反向引物Rl lyL(120nmol/L)置于72°C水浴中作用lOmin，冰浴5min。然后依次加入5 X AMV Buffer 5. O μ LdNTP4 μ L (每种 dNTP 溶液浓度均为 2. 5mmol/L)AMV 反转录酶1 μ L (5U)置于42°C水浴中作用lh，再95°C作用5min灭活AMV。PCR反应反应体系为50yL反转录模板LOyL10 X PCR Buffer 5. O μ L (含 Mg2+)dNTP4 μ L (浓度同上)
5
Taq E所述正向引物Fl所述反向引物RlDEPC-H20
0. 25μ L(l. 25U) 1 μ L 1 μ L
37. 75 μ LPCR扩增程序(1)95°C 3min(2) 94 °C 50s(3) 52°C 50s(4) 72°C 50s(5)回到第2步，重复30次(6) 72 °C 7min(7) 4 °C 5min(4)电泳、PCR产物结果判定取PCR产物5 μ L，制备1 %琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成 像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，PCR阳性结果为436bp。使用阳性或阴性对照的目的是用于比较扩增产物的电泳结果，以便判断待测样品 是否含有草鱼呼肠孤病毒。若含有GCRV，则从电泳结果可以观察到与阳性对照位置相同的 条带；若不含GCRV，则与阴性对照一样不具有这一条带。
图1为实施例二中草鱼组织中草鱼呼肠孤病毒检测结果。M. DL2000DNA Marker ；1. GCRV 阳性对照；2-6.检测样品(其中 2-4 样品 RT-PCR检 测结果在436bp处有一条带，显示GCRV结果为阳性，而5-6为阴性)；7.阴性对照图2为实施例三中CIK细胞感染病毒检测结果。M. DL2000DNA Marker ；1. GCRV阳性对照；2-4.检测样品(RT-PCR检测结果全为阳 性)；5.阴性对照
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。实施例一草鱼呼肠孤病毒的基因诊断试剂盒该试剂盒由以下各部分构成(提取组织和细胞中病毒各10样份)1、组织中病毒RNA提取液A、B、C、D液各1管，A为0. 5mL蛋白酶K(4°C冰箱保存)， B为0. 5mL 1% SDS，C为SmL酚/氯仿/异戊醇混合液，D为SmL氯仿/异戊醇混合液。2、细胞中病毒RNA提取液a，b各1管，a为IOmL Trizol液，b为2. 5mL氯仿(也 可自备)。3、E液，1管，内装异丙醇(也可自备)，共10mL。4、F液，2管，IOmL/管，内装70%乙醇(也可自备)。5、G 液，2 管，5mL/管，内装 DEPC 水。6、RT反应液H、I液各1管，内装RT反应液(25 μ L体系)，其中H液30 μ L/管，包括反向引物 Rl(120nmol/L)禾Π RNAsin(RI) (40U/ μ L) ；I 液 200 μ L/管，包括 5XAMV Buffer, dNTP Mixture (各 2. 5mmo 1/L)，反转录酶 AMV (5U/ μ L)。7、RT-PCR反应液(J液)，1管，ImL/管，内装RT-PCR反应液(50 μ L体系)， 包括 10XPCR buffer (含 mg2+)，dNTP Mixture (各 2. 5mmol/L)；正向引物 F1、反向引物 Rl (120nmol/L) ；ddH20 和 Taq E (5U/ μ L)。8、阳性对照(K液)和阴性对照(L液)，各1管，25yL/管，分别内装GCRV阳性模 板和阴性模板。该试剂盒中一对特异性引物序列如下 Fl :5’ -ATCCCGTATATCTATGGCTT-3， Rl :5’ -TTGGAGACGAACATAGACGC-3 RT反应液体系(25 μ L体系)如下 Rnasin(RI)0. 5 μ L
1 μ L 5. 0μ L 4μ L 1 μ L
行
反向引物Rl 5XAMV Buffer dNTP AMV
RT-PCR反应液体系(50 μ L体系)如下 10 X PCR Buffer (含 Mg2+) 5. 0 μ L
dNTP
正向引物Fl 反向引物Rl DEPC-H2O Taq E
使用实施例-
4μ L 1 μ L 1 μ L 37. 75 μ L 0. 25 μ L 的试剂盒，进行实施例-和例三的应用，具体分别按下列步骤进
实施例二 草鱼肝脾肾组织中GCRV的检测 (1)样品核酸的提取
发病鱼的组织IOOmg加入500 μ L DEPC水捣碎勻浆，10，OOOrpm离心lOmin，取上 清，加40 μ L蛋白酶K和40 μ Ll % SDS，37°C孵育30min ；再加入600 μ L酚/氯仿/异戊醇， 充分混勻30S，12，000rpm离心5min，取上层水相；再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，充 分混勻30S，12，OOOrpm离心5min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，混勻后_20°C Ih以 上沉淀核酸，12，OOOrpm离心lOmin，弃上清，70%乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备 用。(2) RT-PCR 扩增RT反应反应体系共25 μ LRNA 模板13.5yLRnasin(RI) 0. 5 μ L所述反向引物Rl IuL置于72°C水浴中作用lOmin，冰浴5min。
70088]然后依次加入0089]5XAMV Buffer5. Ομ L0090]dNTP4μ L0091]AMV反转录酶1 μ L0092]置于42°C水浴中作用lh，再95°C作用5min灭活AMV。0093]PCR反应反应体系为50 μ L0094]反转录模板l.OyL0095]IOXPCR Buffer5. Ομ L0096]dNTP4μ L0097]Taq E0. 25 μ L0098]所述正向引物Fl1 μ L0099]所述反向引物Rl1 μ L0100]DEPC-H2037. 75 μ L0101]同时设立GCRV阳性和阴性对照，PCR反应体系所加量同上，只是将模板换做试剂
盒所提供的已反转录的cDNA阳性和阴性模板。PCR扩增程序(1)95°C 3min(2) 94 °C 50s(3) 52°C 50s(4) 72°C 50s(5)回到第2步，重复30次(6) 72 °C 7min(7) 4 °C 5min(3)电泳、PCR产物结果判定取PCR产物5 μ L，制备1 %琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成 像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，GCRV的PCR阳性结果应在436bp处有一条 带。电泳结果如图1所示。实施例三草鱼肾细胞分离GCRV的检测(I)CIK细胞感染病毒的RNA的提取染毒的CIK细胞液反复冻融三次，取250 μ L病毒悬液，加750 μ L Trizol高速 混勻，室温5min，再加200 μ L氯仿剧烈摇晃，室温5min ；12, OOOrpm离心15min，吸上清 500 μ L，再加入500 μ L异丙醇，室温沉淀15-20min, 12，OOOrpm离心15min, 70%乙醇洗涤， 吹干。再加入适量DEPC水溶解，备用。(2) RT-PCR 扩增RT反应反应体系共25 μ LRNA 模板13. 5μ LRnasin(RI)0. 5 μ L所述反向引物Rl IuL置于72°C水浴中作用lOmin，冰浴5min。
8
然后依次加入
5×AMV Buffer5．0 u L
dNTP4 u L
AMV反转录酶l u L
置于42~C水浴中作用lh，再95~C作用5min灭活AMV。
PCR反应反应体系为50 u L
反转录模板1．0 u L
10×PCR Buffer5．0 IX L
dNTP4 u L[o130] Taq E0．25 u L
所述正向引物Fll u L
所述反向引物Rll u L
DEPC—H2037．75 IX L
同时设立GCRV阳性和阴性对照，PCR反应体系所加量同上，只是将模板换做试剂盒所提供的已反转录的cDNA阳性和阴性模板。[o135] PCR扩增程序
(1)95℃3min
(2)94℃50s
(3)52℃50s
(4)72℃50s
(5)回到第2步，重复30次
] (6)72℃7min[o142] (7)4V5min
(3)电泳、PCR产物结果判定
取PCR产物5ul，制备1％琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，GCRV的PCR阳性结果应在436bp处有一条带。电泳结果如图2所示。
权利要求
一种草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于它包括1)内脏组织中病毒RNA提取试剂DEPC水；蛋白酶K(1mg/mL，pH8.0)；SDS(1％)；酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70％乙醇；2)细胞感染病毒的RNA提取试剂Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；3)RT反应试剂成分5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNAsin(RI)，反转录酶AMV；4)PCR反应试剂成分10×PCR buffer(含mg2+)，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和Taq E(5U/uL)，所述正向引物F15’ ATCCCGTATATCTATGGCTT 3’；所述反向引物R15’ TTGGAGACGAACATAGACGC 3
2.权利要求1所述试剂盒的应用，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行1)肝脾肾组织中病毒RNA的提取发病鱼的组织60-100mg加入500 μ L DEPC水捣碎勻浆，8，000-10, 000r/m离心 5-10min，取上清，加40 μ L蛋白酶K和40 μ Ll % SDS，37°C孵育30min ；再加入600 μ L酚 /氯仿/异戊醇((25/24/1))，充分混勻30S, 10，000-12，000r/m离心5-lOmin，取上层 水相；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1))混合液，充分混勻30S，10，000-12，OOOr/m 离心5-lOmin取上层水相；加入等体积的异丙醇，混勻后室温沉淀15-20min，沉淀核酸， 12，OOOrpm离心lOmin，弃上清，70%乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。(2)草鱼肾细胞(CIK)感染病毒的RNA的提取染毒的CIK细胞液反复冻融三次，取250 μ L病毒悬液，加750 μ L Trizol高速混勻， 室温3-5min,再加200 μ L氯仿剧烈摇晃，室温3_5min ；12, 000r/m离心10_15min，吸上清 450-500 μ L，再加入等体积异丙醇，室温沉淀15-20min, 12，000r/m离心10_15min，70 %乙 醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。(3)RT-PCR 扩增RT反应反应体系共25 μ L RNA 模板13. 5μ LRnasin(RI) 0. 5μ L(20U) 所述反向引物Rl lyL(120nmol/L) 置于72°C水浴中作用lOmin，冰浴5min。 然后依次加入 5 X AMV Buffer 5. O μ LdNTP4 μ L (每种dNTP溶液浓度均为2. 5mmol/L)AMV反转录酶 lyL(5U)置于42°C水浴中作用lh，再95°C作用5min灭活AMV。PCR反应反应体系为50 μ L反转录模板l.OyL10 X PCR Buffer 5· O μ L (含 Mg2+)dNTP4 μ L (浓度同上)TaqE0· 25μ L(l. 25U)所述正向引物Fl IuL 所述反向引物Rl IuL DEPC-H2037.75 μ LPCR扩增程序(1)95°C3min(2)94 °C 50s(3)52°C 50s(4)72°C 50s(5)回到第2步，重复30次(6)72 °C 7min(7)4 °C 5min(4)电泳、PCR产物结果判定取PCR产物5 μ L，制备1 %琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成像系 统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，若在与阳性对照同一位置的436bp处出现明亮 的反应条带，则为GCRV阳性，说明待测样品携带GCRV，否则为阴性。
全文摘要
一种草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，包括1.内脏组织中病毒RNA提取试剂DEPC水；蛋白酶K(1mg/mL，pH8.0)；SDS(1％)；酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70％乙醇；2.细胞感染病毒的RNA提取试剂Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；3.RT反应试剂成分5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNAsin(RI)，反转录酶AMV；4.PCR反应试剂成分10×PCRbuffer(含Mg2+)，dNTPMixture(各2.5mmol/L)；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和Taq E(5U/uL)，所述正向引物F15’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’；所述反向引物R15’TTGGAGACGAACATAGACGC-3。本发明用于草鱼呼肠孤病毒基因诊断。
文档编号C12R1/93GK101906482SQ20091009903
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 沈锦玉, 潘晓艺, 郝贵杰 申请人:浙江省淡水水产研究所