利用全细胞用糖制作低聚糖的方法

专利名称：：利用全细胞用糖制作低聚糖的方法
技术领域：
：本发明涉及一种利用全细胞的用糖制作低聚糖的方法，具体地说，就是关于利用全细胞用糖制作低聚糖的方法，实际上就是关于包括新启动子及耐热性β-半乳糖苷酶在内的重组载体、经过转化成为上述重组载体的重组微生物及利用上述重组微生物的耐热性β-半乳糖苷酶的制造方法。
背景技术：
：低聚糖(Oligosaccharide)是对从由2个单糖构成的双糖类到由10个单糖构成的十糖类的糖类的总称，它是一种带有甜味的水溶性的结晶性物质。与大部分的糖质都是通过身体内的消化酶而分解为单糖之后就被吸收的情况相反，低聚糖在消化酶的作用下几乎不会分解，当其达到大肠之后，就会被肠内的有用细菌所利用或者是发挥对人体健康有利的作用。低聚糖与白糖相比，具有低甜度、非挥发性、保湿性、抗吸湿性、渗透性、凉爽感、防止变色、增强口感、降低水分活性等特性，因此，可以根据产品的目的选择利用。它与具有相似功能的膳食纤维相比，其物性大不相同。由于它不是高分子物质，因此，即使将其添加到食品中，其物性和组织性也不会发生大的变化。作为利用低聚糖的食为饮料、糕点、饴糖(caramel)、巧克力、小甜饼、面包、冰淇淋、果酱、果冻、酸乳酪、蛋糕、保健食品等。现在，在生产一线主要生产的低聚糖有低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖等。这些低聚糖是采用生物科学的方法通过使基质与分解相应基质的酶发生反应而生产出来的。这些酶是在对微生物进行培养之后，经过多道后续处理工序，将其制成液态或者是粉末状再向生产线上供给。为了实现低聚糖的高效批量生产，以降低设备运行成本，就需要有高浓度的基质溶液。同时，还必须防止在生产运行过程中由于反应基质及副产物从而使微生物受到污染。特别是，低聚半乳糖是以乳糖为基质，通过β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)酶反应而生产出来的。乳糖越是成为高浓度的水溶液状态，其溶解度就越低。如果要想将其溶解成高浓度，就必须要达到高温条件。另外，在生产线上，可将50%(wt/vol)乳糖溶液用作生产低聚半乳糖的基质。另外，谷氨酸棒状杆菌自古就是用于生产含有谷氨酸的氨基酸及核酸的有用微生物，到目前为止，还没有采用同样的方法将其用于生产低聚糖的实例。因此，依据本发明，使插入有耐热性β-半乳糖苷酶的载体通过转化成为谷氨酸棒状杆菌，将其培养成高浓度的溶液之后，无需经过其它后续工序，就直接使谷氨酸棒状杆菌全细胞与乳糖溶液发生反应，从而就可以达到能够用于商业化生产的低聚半乳糖转换收率。
发明内容发明所解决的技术课题本发明的目的在于，提供一种利用全细胞用糖制作低聚糖的方法。本发明的另外一个目的在于，提供含有对具有序列号1的碱基序列的启动子和耐热性β“半乳糖苷酶进行编码的基因的重组载体和通过转化成为上述重组载体的重组微生物。本发明的另外一个目的在于，提供一种利用上述重组微生物的耐热性β-半乳糖苷酶制造方法。发明的效果依据本发明的低聚糖制造方法使用了耐热性酶，这样就可以获得与现有技术使用精制酶的生产方法相同的低聚糖转换率，同时，对于酶的生产来说，除了进行细胞培养之夕卜，就再不需要经过其它的工序，从而就可以大大节约生产成本。图1是表示依据本发明插入有耐热性酶的重组载体(pSG201-Slac)结构模式图；图2是显示重组载体pSG201-Slac进行转化后形成谷氨酸棒状杆菌进行高浓度培养的结果及其活性曲线图；图3是重组载体pSG201-Slac进行转化后形成谷氨酸棒状杆菌进行高浓度培养细胞破碎后蛋白质电泳示意图，其中1.谷氨酸棒状杆菌/无2.谷氨酸棒状杆菌/β-半乳糖苷酶3.谷氨酸棒状杆菌/β-半乳糖苷酶(热处理8(TC，10min)；图4是表示依据本发明的低聚糖制造方法合成低聚半乳糖后用HPLC分析的层析图。具体实施例方式为了实现上述目的，本发明提供了一种利用全细胞用糖制作低聚糖的方法。另外，本发明还提供了含有具有序列号1的碱基序列的启动子和耐热性半乳糖苷酶进行编码的基因及使上述启动子和上述基因可操纵链接的重组载体。另外，本发明还提供了通过转化上述重组载体形成重组微生物。另外，本发明还提供了一种耐热性β-半乳糖苷酶的制造方法，它包括如下两个步骤；对上述重组微生物进行培养后对耐热性β“半乳糖苷酶进行表达的步骤和对上述表达的半乳糖苷酶进行回收的步骤。依据本发明的低聚糖制造方法，从一个角度来说，它具有如下特征即对于利用全细胞用糖制作低聚糖的方法而言，上述全细胞就是对耐热性糖基转移酶进行编码的基因和通过转化形成含有上述基因的重组载体即重组微生物。在本发明中，上述糖可以从由乳糖、麦芽糖及白糖所组成的组中进行选择，上述低聚糖可以从由低聚半乳糖、低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide)、低聚果糖及低聚乳果糖(Lactosucrose)所组成的组中进行选择。在这里，低聚半乳糖具有由14个半乳糖(galactose)结合形成的化学结构，以3糖类为主要成份。它是将乳糖通过β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的作用而制造出来的。在这里，低聚异麦芽糖由葡萄糖构成，它作为带有1个以上α_1，6结构的低聚糖类(oligosaccharide)，其主要成份包括异麦芽糖(isomaltose)、异麦芽三糖(isomaltotriose)、潘糖(panose)等，它是将麦芽糖通过转葡糖苷酶(transglucosidase)的作用而制造出来的。在这里，低聚果糖作为一种具有与在白糖的果糖残基上结合有13个果糖的白糖类似结构的糖类混合物，其主要成份包括果糖(fructose)、蔗果四糖(nystose)、果呋喃基耐斯糖(fructofuranosylnystose)等，它是将白糖通过β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase)的作用而制造出来的。在这里，低聚乳果糖作为由半乳糖(galactose)、萄萄糖(glucose)、果糖结合形成的3炭糖，是一种低热量甜味剂，它是以乳糖(lactose)和白糖为基质通过呋喃果糖苷酶(fructofuranosidase)作用而制造出来的。对于本发明来说，耐热性酶是指即使是在高温条件下也非常稳定的酶，作为适用于发明低聚糖生产的耐热性糖基转移酶可以从由乳糖酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、转葡糖苷酶(Transglucosidase)、α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)、果糖基转移酶(fructosyltransferase)、葡聚糖蔗糖酶及蔗糖6_果糖基转移酶(Ievansucrase)所组成的组中进行选择。作为一个实例，上述β_半乳糖苷酶源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus98/2)，最佳的活性温度为7080°C，ρΗ值为6.O。在这里，乳糖酶也被称作β_半乳糖苷酶(β-galactosidase)、乳糖酶(lactase)，在使具有β_D_半乳糖基(1，4)-D-葡萄糖(β-D-galactosil(1，4)-D-glucose)的结构的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖时，它是一种可以用作催化剂的酶。在这里，β-葡萄糖苷酶是，在利用多种基质进行碳水化合物的生产领域中，可以用于低聚糖类(oligosaccharide)的生产、葡糖苷(glycoside)诱导剂的合成等多种碳水化合物分解的酶。在这里，转葡糖苷酶是一种包含α-葡萄糖苷酶的酶，对末端的非还原性α1，4结构的α-D-葡萄糖(glucose)单位进行水解，并以麦芽糖(Maltose)为基质生产出低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide)ο在这里，果糖基转移酶通过转糖基(transfructosylation)反应就可以将白糖转换为低聚果糖(fructo-oligosaccharide)，一般情况下，它是从微生物提取的酶。在本发明中，作为对上述耐热性糖基转移酶进行编码基因的基源，包括微生物、植物、昆虫及动物。作为一个实例，对耐热性半乳糖苷酶进行编码的基因源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus98/2)。上述重组微生物可以从由大肠杆菌、杆状菌、棒状杆菌、曲霉菌及酵母菌构成所组成的组中进行选择。在本实施例中，虽然列举了重组谷氨酸棒状杆菌，但并不意味着仅限于此。具体来说，依据本发明的低聚糖制造方法包括如下两个步骤在存在上述重组微生物的条件下使基质即糖发生反应，从而制造低聚糖的步骤；将上述制造出来的低聚糖进行回收的步骤。上述低聚糖以白糖、淀粉、乳糖为原料，通过酶使其糖化或者是经压缩制成糖液，然后再进行加工而获得的，它是由28个单糖类结合形成的低聚糖类(oligosaccharide)的一种，在肠内消化酶的作用下不会充分分解，而始终保持低热量，是适合于患有肥胖症、糖尿病等对糖的摄取受限人员的低热量甜品，也是一种用于茶(Tea)、面包、果冻、饼干(biscuit)、饴糖等食品生产的功能性甜料。作为天然低聚糖，有包括于棉籽及大豆中含有的3糖类的蜜三糖(raffinose)和4糖类的水苏糖(stachyose)等。具体地说，上述低聚糖的种类包括使白糖分子与13个果糖分子结合后通过酶的作用获得糖液，然后再进行过滤、提取、浓缩而制成的液态低聚果糖；使淀粉分子与葡萄糖分子结合后通过酶的作用使其糖化或经压缩获得糖液，然后再进行加工而制成的低聚异麦芽糖；将乳糖分子通过酶的作用获得糖液后再经过酶的作用使其糖化或经压缩制成糖液然后再对其进行加工，或者是将从大豆中提取的蜜三糖、水苏糖的糖液进行过滤、提取、浓缩而制成的液态或粉末状的低聚半乳糖；使淀粉分子与310个葡萄糖分子直链结合后通过酶的作用获得糖液，然后再进行过滤、提取、浓缩而制成的液态或粉末状低聚麦芽糖等。一般情况下，低聚糖是采用生物工程学的方法将基质和使相应基质分解的酶发生反应而生产出来的，这种酶是在对微生物进行培养后，经过多道后处理工序制成液态或粉末状再进行使用。另外，为了实现低聚糖的高效批量生产，以降低设备的运行成本，就需要有高浓度的基质溶液。同时，还必须防止在生产运行过程中微生物受到反应基质及副产物的污染，而这样的条件只有在高温条件下才能够实现。因此，可以认为，低聚糖的生产中非常适合使用在高温条件下能够始终保持其最佳活性状态的耐热性酶。特别是，对于低聚糖中的低聚半乳糖来说，它是以乳糖为基质通过β“半乳糖苷酶(β-galactosidase)酶发生反应而生产出来的，其基质即乳糖越是成高浓度的水溶液其溶解度就越低，因此，如果要想将其以高浓度溶解，就必须要达到高温条件。例如在一般生产线上使用的乳糖溶液都是在60至70°C的条件下溶解达到大约50%左右的浓度。在下面的实施例中，虽然仅对低聚半乳糖的制造情况进行了举例说明，但是如果选择合适的作为基质的糖和基因并采用本发明的方法，也能够很容易地制造出低聚异麦芽糖、低聚果糖或低聚乳果糖。另外，全细胞的利用就是在进行高浓度细胞培养后，将包括培养液在内的全细胞作为酶使用，它具有无需经过细胞分离，添加缓冲溶液，以及浓缩等后处理工序的优点。在一部分利用全细胞的生产方法中，为了提高反应基质的细胞内渗透性，虽然也可以用甲苯或乙醇等渗透诱导物质(permeableagent)对细胞进行处理，不过这种方法多数情况下都会存在因使用有机溶剂而残留有毒物质的危险性。但是，如果在高温条件下使其发生反应，就可以提高溶解度或细胞内物质的渗透性，这样，就能够有效地排除上述渗透诱导物质的残留成份。在本发明中，上述全细胞就是对耐热性糖基转移酶进行编码的基因和经转化形成含有上述基因的重组载体的重组微生物，上述重组载体含有具有序列号1的碱基序列的启动子。具体地说，依据本发明，使插入有上述耐热性半乳糖苷酶的重组载体转化的重组微生物，作为一个实例，将重组谷氨酸棒状杆菌进行高浓度培养后，无需经过后续处理工序，直接使谷氨酸棒状杆菌全细胞与含有乳糖的基质发生反应，从而就可以生产出低聚糖。关于上述经转化后形成的重组微生物的培养，可以采用现在大家广为熟知的方法进行培养，培养温度及时间，培养基的PH值等条件可以适当地进行调节。上述耐热性酶可以通过普通的生化分离技术，例如利用蛋白质沉淀剂(盐析法)、离心分离、超声波粉碎、超滤法、透析法、分子筛层析法(凝胶过滤)、吸附层析法、离子交换层析法、亲和层析法等各种层析法进行处理，通常情况下，为了分离出纯度较高的蛋白质都需要将上述方法进行组合运用。在本发明中，由于在低聚糖的生产过程中使用了全细胞，因此，上述耐热性酶的分离仅仅是为了对耐热性酶的细胞内活性和蛋白质电泳进行确以。在本发明中，能够用于与低聚糖基质发生反应的具有酶功能的全细胞就是指上述重组菌株的培养物，也就是说，通过对上述转化宿主细胞(hostcell)进行高浓度培养(Highdensitycellculture)，使细胞的OD(Opticaldensity)6(1(1值达到100以上的状态。在培养基中培养的细胞的0D600值如果达到了100以上，则在进行细胞内表达及细胞外分泌表达的情况下，细胞与培养基的分离都会显得比较困难。因此，在本发明中，在完成高浓度培养之后，将包含细胞与培养基成份在内的全细胞按照其与基质体积之比为2至6%(ν/ν)的比例加入，比较理想的情况就是再在5080°C的高温条件下使其发生反应，从而就可以制造出低聚糖。另外，当白糖、乳糖、麦芽糖作为基质使用时，由于高浓度的基质可以促进生产量的提高，从而减少生产次数，因此这一点是非常重要的。这些基质的浓度越高，其在室温状态下的溶解度就越低，因此，为了使其能够充分溶解，就必须具备高温条件。对于利用全细胞的低聚糖反应来说，上述基质的浓度保持在3060%(w/v)的范围内是比较理想的。因此，耐热性酶的生产除了要培养进行转化的宿主细胞之外，就再不需要经过细胞破碎、细胞分离、浓缩等过程，或者如在使用全细胞时为了增加物质的细胞内进出而添加渗透性诱导因子(Permeableagent)的附加处理过程。从另一个角度来说，本发明就是关于含有对具有序列号1的碱基序列的启动子和对耐热性β“半乳糖苷酶进行编码的基因，以及使上述启动子和上述基因可操纵链接的重组载体。在本发明中，“启动子”就是指包含聚合酶结合部位、具有启动子下位基因(hypostasisgene)的mRNA转录起始(Transcriptioninitiation)活性、加密化区域上位(upstream)的非解码核酸序列，具体地说，所谓的“启动子”从转录起始点(+1)相对于2030碱基位于上游，它虽然包含从准确的位置起到能够开始转录到RNA聚合酶上的TATA盒和类似TATA盒的区域，但是，也并不意味着就必须限定在这些区域的前后，除了这些区域之夕卜，为了进行表达调节，也还包含一些必要的区域，以便能够与除了RNA聚合酶之外的蛋白质汇合。上述重组载体就是指重组表达载体，所谓的表达载体，是指包含适当的宿主细胞中能够对目标蛋白进行表达的可转录启动子、对半乳糖苷酶进行编码的基因、在微生物内能够自我复制的基因，以及能够对目标载体进行识别的抗生物质基因等的基因制作物。另外，它能够使上述启动子和对半乳糖苷酶进行编码的基因可操纵链接，具体地说，它可以带有图1所示的分解图。除了目标基因之外的上述基因可以随着载体的主链(backbone)及所选择的宿主的不同而发生变化。对于载体的制作来说，上述必须具备的基因是相关工作人员已广泛了解，因此能够很容易地根据基因的表达条件及目的进行选择。当然，这并不意味着上述载体仅限于此，除了上述载体之外，还可以利用质粒载体、噬菌体载体(phagevector)和病毒载体等。作为一个实施例，可以利用pUC19作为上述载体的主链。补充说明一下，上述重组载体可以包含对上述β-半乳糖苷酶的表达进行调节的调节序列。所谓的“调节序列(expressioncontrolsequence)”，就是指特定的宿主细胞中能够对可操纵链接的碱基序列的表达进行调节的DNA序列，这种表达调节序列包括进行转录的启动子、对转录进行调节的任意操纵子序列、对适合的mRNA核糖体结合部位进行编码的序列以及对转录和解读的终止进行调节的序列。同时，上述启动子可以使目标基因可操纵链接以激活其表达，载体也可以结合到宿主细胞的基因组内。在这里，“可操纵链接(operablylinked)”是指为了执行一般的功能而将碱基表达调节序列和对目标蛋白进行编码的碱基序列进行功能性连接。重组载体和可操纵链接可以利用相关
技术领域：
的基因重组技术进行制造和实施，部位_特异性DNA切断及连接可以利用相关
技术领域：
通常使用的酶。另外，载体如果为可以复制的表达载体，则可以包括开始复制的特定核酸序列即复制起点(replicationorigin)。另外，载体可以包含筛选标记(selectionmarker)。筛选标记用于对经转化成载体的细胞进行选别，可用于对耐药性、营养性、细胞耐毒性和表面蛋白质的表达等可选择表达形式进行标记。选择剂(selectiveagent)在经过处理的环境中只能够生存于对筛选标记进行表达的细胞中，因此，它可以对经过转化后的细胞进行选别。在这里，β-半乳糖苷酶也被称作乳糖酶，除了烯丙基及芳基-D-半乳糖苷之夕卜，它也可以作用于乳糖，从而作为生成半乳糖的酶。半乳糖苷酶可以使乳糖之类的β-D-吡喃半乳糖苷中非还原末端β-D-半乳糖水解，也可以促进半乳糖发生转移反应，它以多种微生物为主，在植物和动物体内都能够发现。这种酶的水解活性和糖转移活性都具有产业方面的应用性。水解活性可以使牛奶和乳制品类乳糖水解，也可以抵抗乳糖不耐症，从而提高甜度。糖转移活性可用于制造促进人体肠内有用微生物即双歧杆菌(bifidobacteria)生长的低聚半乳糖。对这种耐热性β-半乳糖苷酶进行编码的基因源自由从硫化叶菌(Sulfolobus)属、栖热菌属、杆状菌属及葡萄状球菌(staphylococcus)属所组成的组中选择的一种，但这并不意味着它仅限于此。从另一个角度来说，本发明就是关于经转化形成上述重组载体的重组微生物的。上述经转化形成的重组微生物是，作为为了对目标蛋白进行表达而对上述启动子和对耐热性半乳糖苷酶进行编码的基因可操纵链接地制作的载体的宿主细胞，通常使用DNA导入效率高且导入的DNA表达效率高的宿主细胞，作为包括原核细胞及真核细胞在内的所有微生物，可以利用细菌、酵母菌、霉(filamentousfungi])等。比较理想的情况是，利用棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物，更加理想的情况是，利用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumghutamicum)ATCC13032和产氨短杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC6872。作为本发明的一个具体形态，如果想要进行过表达的目标基因都能够充分表达，则就不仅仅局限于上述微生物。上述经转化后形成的重组微生物可以根据任意一种转化方法进行制造。依据本发明的“转化(transformation)，，是指将DNA作为宿主进行导入，使DNA作为染色体的基因，或者使DNA通过染色体的结合而成为可复制的，从而将外部的DNA导入细胞内之后，人为地使其产生遗传性变化的现象。一般情况下，转化方法包括电穿孔法(electroporaton)、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀法、显微注射法(microinjection)、醋酸锂-DMSO法等，在本发明的具体形态中可以使用电穿孔法。从另外一个角度来说，本发明就是关于耐热性β”半乳糖苷酶的制造方法的，它包括如下两个步骤培养上述重组微生物，并对耐热性β”半乳糖苷酶进行表达的步骤；对上述表达的半乳糖苷酶进行回收的步骤。上述β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)通常可以使乳糖水解为单糖类的D-葡萄糖和D-半乳糖。在半乳糖苷酶的正常酶反应过程中，上述酶使乳糖水解，然后使半乳糖单糖类在半乳糖-酶复合体中暂时结合，然后，再将上述半乳糖转移到水中的羟基上，这样就可以分离出D-半乳糖和D-葡萄糖。但是，如果乳糖的浓度较高，一部分半乳糖苷酶在经过被称作酶法糖基化(Transgalactosylation)处理的过程之后将半乳糖转移到D-半乳糖或者是D-葡萄糖的羟基上，从而就可以生产出半乳低聚糖。一直以来，能够进行酶法糖基化处理的酶都可以从以细菌及酵母菌等为主的广泛的微生物中获得，其中，依据本发明的β-半乳糖苷酶是在高温条件下能够实现酶法糖基化处理的酶中的一种，因此，除了β-半乳糖苷酶之外，均可用于其它的耐热性糖转移酶的制造和利用本发明的重组微生物进行表达。实施例下面，将通过实施例对本发明进行更加详细的说明。下面所列举的实施例仅是为了对本发明进行更加详细的说明，并不意味着本发明的范围仅局限于所列举的实施例，这一点对于具有相关行业知识的人来说是不言自明的。实施例1插入有耐热性半乳糖苷酶基因的重组载体及重组微生物的制造(1)重组载体pSG201-Slac的制造将硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus98/2)在80°C的条件下在下述培养基中培养24小时，该培养基是由0.酵母菌提取物、0.酪蛋白氨基酸(casaminoacid)、0·3%磷酸氢二钾、0·25%硫酸铵(ammoniumsulfate)、0·02%MgSO4·7Η20、0·02%CaCl2·2Η20组成的混合物中部分加入微量元素(1.8mgMnCl2·4Η20，4·5mgNa2B4O7·IOH2O,0.22mgZnSO4·7Η20，0·05mgCuCl2‘2H20,0.03mgNa2MoO4‘2H20,0.03mgVOSO4·2H20，0.OlmgCoSO4·7Η20/并将最终pH值调节为4。从上述细胞中分离(GenomicDNAextractionkit；RBC公司生产)出50(^8基因组0嫩，然后，以上述分离出的基因组DNA为主型，然后，再利用序列号2和序列号3的引物(primer)执行PCR，然后，再将PCR产物利用限制酶NdeI和Aval进行处理，然后，再将其接合(Ligation)在利用相同限制酶处理过的pET24a(Novagen公司生产)载体上，从而就可以获得pET24a_Slac。正向弓丨物(序歹[J号2):atgtactcatttccaaatag反向引物(序列号3):ttagtgccttaatggcttta由序列号1的碱基序列构成的启动子可以通过将KpnI和ClaI接合在两末端拉伸后合成(BioNeer公司生产)进行制作，以谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)基因组DNA为主型作为序列号4和序列号5的引物执行PCR，从而将载体开始复制的碱基序列部位applicationorigin)增幅。另外，分别将利用序列号6和序列号7的引物从PKK223-3(Pharmacia公司生产)载体中获得的rrnBTl终止子(terminator)和利用序列号8和序列号9的引物从pUB110(Sigma公司生产)中获得的卡那霉素(kanamycin)抵抗基因增幅，复制开始序列部位对限制酶BglII和DraI进行处理，同时，将载体终止子利用限制酶Xbal和SalI进行处理，将卡那霉素抵抗基因利用限制酶AatII和SpeI进行处理，在利用限制酶对载体的相同部位进行处理后，再利用T4连接酶依次插入到PUC19载体(Invitrogen)中，将通过上述过程构建的新的表达载体命名为pSG201。序列号4:AAAAACGGTGATCGGATTTT序列号5GATCTTTGGGAGCAGTCCTT序列号6GCTTAAATAAAACGAAAGGC序列号7:AAAGAGTTTGTAGAAACGCA序列号8GTGAATGGACCAATAATAAT序列号9TCAAAATGGTATGCGTTTTG为了将β-半乳糖苷酶基因插入到上述构建的棒状杆菌用高活性pSG201载体中，就需要按照下述方法制造引物。正向引物(序列号10):ATGTACTCATTTCCAAATAG反向引物(序列号11)TTAGTGCCTTAATGGCTTTA以上述制作的pET24a-SlaC为主型，利用上述制作的引物通过聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)将β-半乳糖苷酶基因增幅。然后，将增幅的基因利用分离提取工具(RBC公司生产)进行提纯，然后，将事先接合在引物两末端的XmaI和XbaI碱基序列分别利用限制酶切断，并将其接合(ligation)在利用相同的限制酶处理过的pSG201载体上，然后，采用42°C热冲击法使大肠杆菌JM109进行转化，然后，从进行转化后的大肠杆菌中就可以分离出质粒(Plasmid)，将插入有通过上述过程分离出的β-半乳糖苷酶的PSG201载体构建物命名为pSG201-Slac，其构成如图1所示。(2)通过pSG201-Slac进行转化的重组谷氨酸棒状杆菌的制造为了使上述制作的pSG201-Slac的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032进行转化，就需要按照如下的方法进行操作。将谷氨酸棒状杆菌接种到LBG(1%胰蛋白胨，1%NaCl，0.5酵母菌提取物，2%葡萄糖)培养基5ml中，在30°C的条件下培养一天一夜之后，再向100ml的Epo(1%胰蛋白胨，l%NaCl，0.5%酵母菌提取物，2.5%氨基乙酸，0.1%Tween80，0.4%异烟酸)培养基中接种2ml的种菌，在18°C的条件下对菌进行培养，直到0D600的值达到0.8时为止。同时，在4°C的条件下按照4，OOOXg的标准实施10分钟的离心分离，然后，再利用50ml冷却10%丙三醇使其悬浮，然后，再按照相同的条件进行离心分离，并再次利用50ml的10%丙三醇重复执行上述操作过程，最终就可以制造出体积为200μ1的感受态细胞(competentcell)。将这种感受态细胞200μ1和重组载体10μg进行混合，并将其放入0.2cm电穿孔用玻璃管(electroporationcuvette)中用冰冷冻5分钟后，在2500volt，600Ω，25μF的条件下实施电穿孔(electroporation)，从而使其进行转化。然后，立即浇注ImL的LBHIS(0.5%胰蛋白胨，0.5%NaCl,0.5%酵母菌提取物，1.85%BHI(BrainHeartInfusion),9.山梨糖醇)，并将其移入经过灭菌处理后的微量离心管(microcentrifugetube)中，然后在46°C的条件下实施热冲击6分钟，然后，在30V的条件下培养1小时，然后，取适量放入含有卡那霉素(kanamycin)30μg/ml、X_gal50μg/ml浓度标准的LBHIS琼脂培养基中。棚列2傭■麵謹制_碰■养为了培养出由实施例1中耐热性半乳糖苷酶基因进行转化形成的高浓度谷氨酸棒状杆菌，就必须按照下述方法进行操作。选择一个涂抹在含有卡那霉素(Kanamycin)20mg/L浓度的LB琼脂(1%胰蛋白胨，0.5%酵母菌提取物，氯化钠，1.5%琼脂)培养基上的转化谷氨酸棒状杆菌菌落(colony)，然后，将菌落接种到加入有经过灭菌处理的50mlLB培养基的500ml三角瓶中，并在30°C的条件下按照200rpm的搅拌速度搅拌24小时，从而培养出种(seed)培养基。这种培养可以利用发酵罐(Jar-fermentor；KoBioTech公司生产)，培养基的组成如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>将50ml种培养基培养物通过无菌接种方式接种到加入有经过灭菌处理的IL上述菌种培养培养基的2.5L发酵罐中，在30°C、pH值7.0的条件下，以250rpm的搅拌速度进行搅拌，然后，按照IVVM(airvolume/workingvolume/min)的标准注入空气，培养24小时。为了能够将PH值保持在7.0，就自动向其中添加氨水，为了使溶解氧的浓度稳定地保持在30%，搅拌速度和空气注入量可以根据情况进行随机调整。在培养上述重组谷氨酸棒状杆菌的过程中，不添加诱导半乳糖苷酶表达的诱导物质。培养24小时之后，其结果如图2所示。从图中可以看出，培养9小时之后，在葡萄糖减少的同时，细胞的OD值急剧增加，β-半乳糖苷酶的活性也随着细胞的生长一起增加。实施例3β_半乳糖苷酶的活件确认为了对实施例2中培养的重组谷氨酸棒状杆菌中β-半乳糖苷酶的表达程度进行确认，就将上述完成高浓度培养的培养细胞利用0.IM磷酸缓冲液(pH6.0)进行稀释，使其浓度调节为OD6tltlIO,然后，再利用超声波粉碎机(VibraCell公司生产)将浓度调节为OD6tltlIO的细胞粉碎，以作为对其活性进行测定的试料。将上述粉碎细胞的一部分试料在80°C的条件下加热处理10分钟，以通过蛋白质电泳间接地对其耐热性进行确认。为了确定β_半乳糖苷酶的活性，就将4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷溶解到0.IM磷酸缓冲液(pH6.0)中，以将其作为基质使用，并在80°C的条件下使其进行反应，然后，利用10%(w/v)硼砂(Disodiumtetraborate)使酶反应中止，以使其着色。酶的活性可以通过420nm的吸光度中对游离的0-硝基酚的浓度进行确认，即对β-半乳糖苷酶limit在上述条件下每1分钟游离出1μmol的0-硝基酚的酶的量进行确认。另夕卜，SDS_PAGE(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis)是，禾丨J用分离凝胶(separatinggel)使丙烯酉先胺(acrylamide)的浓度调节到10%之后，再利用积层凝胶(stackinggel)使丙烯酰胺的浓度调节到8%。SDS-PAGE缓冲液可以使用由25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris_base)、192mM氨基乙酸、0.1%SDS所组成的pH值为8.3的混合溶液。将细胞破碎物的上清液与5Xsamplebuffer(60mMTris-HClpH6.8，25%丙三醇，2%SDS，14.4mM2-巯基乙醇，0.1%溴酚蓝)混合，将在100°C的条件下加热处理5分钟再进行使用。电泳装置可以利用Bio-RacbMini-ProteanII设备。如图3所示，在利用完成高浓度培养的试料的蛋白质表达形式中，与对照群的谷氨酸棒状杆菌相比，经转化形成半乳糖苷酶的重组谷氨酸棒状杆菌的半乳糖苷酶表达程度比较出众，特别是，在80°C的条件下加热处理10分钟的情况下，与未进行加热处理的情况相比，几乎可以看到相同的蛋白带。这说明在高温条件下重组谷氨酸棒状杆菌的β-半乳糖苷酶表达比较稳定。实施例4低聚半乳糖的制造对于低聚半乳糖的合成来说，为了达到与最大的生产线上相同的生产条件，可以用浓度为500g/L的乳糖作为基质，无需添加缓冲液，将其利用蒸馏水通过高温加热使其溶解，向IL容量的反应器中加入500ml的浓度为500g/L的乳糖溶液，将反应温度控制在70°C，搅拌速度保持在IOOrpm的标准。β-半乳糖苷酶可以使用上述实施例2中培养的高浓度重组棒状杆菌全细胞(wholecell)。在这种情况下，全细胞(wholecell)的投入量为，以进行高浓度培养后的培养物稀释到最终乳糖溶液中的稀释浓度达到0D_值5为至。例如，当高浓度培养物的最终细胞浓度为0D_达到100时，就可以向500ml乳糖溶液中加入25ml的细胞培养物，合成时间需要24小时。低聚半乳糖的分析可以使用聚胺lKPolyamineII;YMC公司生产)柱，并利用带有RI检测器的HPLC(Agilent公司生产)进行测定。在这种情况下，流动相乙腈(Acetonitrile)和提炼水的比例保持在65%/35%(ν/ν)标准，流动相的流速保持在1.Oml/min。上述完成全细胞反应后的低聚半乳糖分析结果如表2所示，HPLC层析图如图4所示。低聚半乳糖的转换率按照下述方法进行计算。下面所列的量表示通过HPLC所测定的峰(peak)面积，在通过乳糖基质所获得的生成物中，单糖的葡萄糖、半乳糖和除了双糖的乳糖之外的双糖以上的糖类可以以低聚半乳糖进行评估。低聚半乳糖转换率(％)=[整体糖的量]-[葡萄糖量]_[半乳糖量]_[乳糖量]表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>总GOS整体低聚半乳糖G0S4:4糖类低聚半乳糖G0S3:3糖类低聚半乳糖G0S2:2糖类低聚半乳糖如上述结果所示，从500g/L的乳糖基质获取的低聚半乳糖按照55.3%的转换率可以生成275g/L的量，这与目前从商业角度上市的低聚半乳糖转换收率相接近，因此，依据本发明，利用使通过硫磺矿硫化叶菌获得源自耐热性β“半乳糖苷酶的进行转化的谷氨酸棒状杆菌的利用全细胞的制造低聚半乳糖的方法，就可以达到与使用精制酶时同等标准的批量生产水平。FP09KR812SEQUENCELISTING<110>格诺福库斯株式会社<120>利用全细胞用糖制作低聚糖的方法<130>FP09KR812<150>10-2009-0015490<151>2009-02-24<160>11<170>PatentInversion3.2<210>1<211>68<212>DNA<213>DNAsequenceof201promoter<400>1agaaaattattttaaatttcctcttgaaaaaaacagaatcatcgctataatgggtaaaaa60aggaaaga68<210>2<211>20<212>DNA<213>forwardprimer<400>2atgtactcatttccaaatag20<210>3<211>20<212>DNA<213>reverseprimer<400>3ttagtgccttaatggcttta20<210>4<211>20<212>DNA<213>primer<400>4aaaaacggtgatcggatttt20<210>5<211>20<212>DNA<213>primer<400>5gatctttgggagcagtcctt20<210>6<211>20<212>DNA<213>primer<400>6gcttaaataaaacgaaaggc20<210>7<211>20<212>DNA<213>primer<400>7aaagagtttgtagaaacgca20<210>8<211>20<212>DNA<213>primer<400>8gtgaatggaccaataataat20<210>9<211>20<212>DNA<213>primer<400>9tcaaaatggtatgcgttttg20<210>10<211>20<212>DNA<213>forwardprimer<400>10atgtactcatttccaaatag20<210>11<211>20<212>DNA<213>reverseprimer<400>11ttagtgccttaatggcttta20.权利要求一种利用全细胞用糖制作低聚糖的方法，其特征在于上述全细胞是对耐热性糖基转移酶进行编码的基因或者是经转化后形成含有上述基因的重组载体的重组微生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述重组载体含有具有序列号1的碱基序列的启动子。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述糖可以从由萄萄糖、半乳糖、麦芽糖及白糖所组成的组中选择。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述低聚糖可以从由低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖及低聚乳果糖所组成的组中选择。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述耐热性糖基转移酶可以从由乳糖酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、转葡糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、葡聚糖蔗糖酶及蔗糖6-果糖基转移酶所组成的组中选择。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述微生物可以从由大肠杆菌、杆状菌、棒状杆菌、曲霉菌及酵母菌所组成的组中选择。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于上述微生物就是为谷氨酸棒状杆菌的重组微生物。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于需要在50至80°C的条件下进行操作。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用全细胞从浓度为30至60(w/v)%的糖中提取低聚糖。10.一种重组载体，其特征在于其含有对具有序列号1的碱基序列的启动子和对耐热性β-半乳糖苷酶进行编码的基因，并使上述启动子和上述基因进行可操纵链接。11.根据权利要求10所述的重组载体，其特征在于对上述耐热性β-半乳糖苷酶进行编码的基因源自由硫化叶菌属、栖热菌属、杆状菌属及葡萄状球菌属所组成的组中选择的一种。12.—种重组微生物，其特征在于重组微生物经转化形成权利要求项10所述的重组载体。13.根据权利要求12所述的重组微生物，其特征在于上述微生物是谷氨酸棒状杆菌。14.一种耐热性半乳糖苷酶的制造方法，其特征在于，它包括如下两个步骤培养根据权利要求12或者是权利要求13所述的重组微生物，并对耐热性β-半乳糖苷酶进行表达的步骤；对上述表达的β-半乳糖苷酶进行回收的步骤。全文摘要本发明涉及一种利用全细胞的糖转移方法，具体地说，就是关于利用全细胞用糖制作低聚糖的方法，实际上就是关于包括新启动子及耐热性β-半乳糖苷酶的重组载体、经过转化成为上述重组载体的重组微生物及利用上述重组微生物的耐热性β-半乳糖苷酶的制造方法。依据本发明的低聚糖制造方法，通过利用耐热性酶，不仅可以获得与现有技术利用精制酶的制造方法相同的低聚糖转换率，而且对于酶的生产来说，除了需要进行细胞培养之外再不需要经过其它的流程，因此就可以大大节省生产费用。文档编号C12N9/38GK101812493SQ20091013753公开日2010年8月25日申请日期2009年4月30日优先权日2009年2月24日发明者吴德根,周宿子,崔载烈,朴承焕,梁熙洙,潘在鬼,郑兴采,金义中,金星姬申请人:杰诺福克斯公司;江门量子高科生物股份有限公司