对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用的制作方法

专利名称：：对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用的制作方法对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用本申请是申请日为2003年2月5日、发明名称为"对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用"、申请号为"03805162.1"的分案申请。
背景技术：
：发明领域本发明通常涉及病毒变体，该病毒变体对特定的药物表现下降的敏感性和/或与免疫剂具有降低的相互作用。更具体地，本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)变体，该乙型肝炎病毒变体对核苷性类似物表现全部或部分抗性和/或与病毒表面组分的抗体具有降低的相互作用，包括对这些抗体的下降的敏感性。本发明进一步包含用于检测这种病毒变体的测定，这种测定在监控抗病毒治疗方案上以及在开发针对病毒尤其是HBV变体的新的或改进的疫苗是有价值的。本发明也包含利用病毒变体筛选能够抑制病毒感染、复制和/或释放的药物。现有技术详述术在任何国家构成了常识的组成部分的承认或任何形式的暗示。在氨基酸序列中的特异突变此处表示为'XaainXaa2，，Xaa!是突变前的原始的氨基酸残基，n是残基号以及Xaa2是突变的氨基酸。缩写'Xaa，可以是三字母或单字母(即，'X，)编码。乙型肝炎病毒DNA聚合酶的氨基酸残基这样编号，在TyrMetAspAsp(YMDD)基序中的甲硫氨酸残基是204号残基(Stuyver等，H印tf^/o^;":751-757，2001)。乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸残基根据Norder等(/Gefi.K/o/.74:341-1348,1993)编号。术语核苦类似物已经被用于既指核苷酸又指核苷类似物。乙型肝炎病毒(HBV)会引起衰弱性疾病症状并且导致急性肝衰竭。HBV是DNA病毒，通过RNA中间产物复制并且在复制策略中采用逆转录(Summers和Mason,W29:403-415,1982)。含有部分双链DNA结构的HBV基因组性质复杂，部分双链DNA结构中含有编码表面、核心、聚合酶和X基因的重叠的开放阅读框。HBV基因组的复杂性质在图1中表现。聚合酶由四个功能区组成，末端蛋白(TP)、间隔区、逆转录酶(rt)和核酶(RNAse)。HBV聚合酶基因和包膜基因重叠，在聚合酶催化结构域的突变会影响包膜蛋白的氨基酸序列，并且反之亦然。尤其是，在HBsAg内发现的并且位于氨基酸99和169之间的称为'a，决定簇的HBV中和结构域的基因序列，实际上和病毒聚合酶蛋白的主要催化区尤其是A和B结构域重叠。HBVDNA聚合酶的存在导致了核苷类似物能够作为有效的抗病毒药物的前题。目前正在试验的核苷类似物的实例是喷昔洛韦(penciclovir)和它的口月艮形式(FAM)[VereHodge,爿w"v/m/C^e/wC7re挑tf^^r4:67-84,1993;Boyd等,JriviV*fl/C^e附C^e附o^Aer.32:358-363,1987;Kruger等，i^/m^/ogv22:219A,1994;Main等,丄Wra;fT印fl"船3:211-215，1996]拉米夫定(Lamivudine)[(画)國/3-2，-脱氧-3，誦硫代胞脊；(3TC或LMV)Severini等，^wri附/cro6i"/4gewteCTie/wW/i"M:1430-1435，1995;Dienstag等，iVew/B3:1657-1661，1995。已经进入临床试验的新的核苷类似物包括pyriamidines恩曲他滨(Emtricitabine)，(-)-/5丄-2，-3，-双脱氧-5-氟-3，國硫代胞苷(FTC)，3TC的5-氟衍生物，和克力夫定(Clevudine)(1-(2-氟-5-甲基-i(J-L-阿拉伯呋喃糖基)尿苷；L-FMAU)，胸腺嘧啶类似物。正如3TC，这些是具有非天然"L"构型的嘧啶衍生物。一些嘌呤衍生物也进入了临床试验；他们包括恩替卡韦(Entecavir)(BMS-200，475;ETV)，环脱氧鸟苷类似物、二氨基噤呤二氧戊环(DAPD)、二氧戊环鸟嘌呤((-)-j3-D-2-二氨基嘌呤二氧戊环；DXG)的口服前药，以及阿德福韦酯(Adefovirdipivoxil)，无环脱氧腺苷一磷酸核苷类似物阿德福韦(Adifovir)(9-磷酸-甲氧基乙基I腺噪呤;PMEA)的口服前药。这些药物对抑制HBVDNA合成非常有效，但在长期抗病毒的化12学治疗中有了HBV抗性突变体出现的趋势。在长期的LMV治疗的患者的聚合酶内的rt结构域中筛选关键的抗性突变rtM204I/V+/-rtL180M。用于聚合酶突变的命名是依据Stuyver等，2001，swp所提出的。只有LMV被批准用于抗慢性HBV感染。拉米夫定(Lamivudine)是HBV复制的特别有效的抑制剂，并且通过抑制病毒DNA合成降低原位肝移植(OLT)后的慢性感染患者血清的HBVDNA滴度。LMV单一治疗似乎不可能在较长期控制HBV复制。这是因为HBV的抗LMV林的出现在单一治疗期间几乎是不可避免的，并且就其本身而论单一治疗通常不足以导致病毒清除。ETV也是HBV复制的有效的抑制剂。ETV是可口服的具有抗嗜肝DNA病毒和疱療病毒活力的环戊基脱氧鸟苷类似物。在基于酶和细胞测定的临床前研究表明ETV是非常有效的HBV抑制剂(Innaimo等，爿w"挑/cn^^//^eWC7^附"1441-1448，1997;Siefer等，颠/附/m嵐々ewfCA柳2;3200-3208,1998;Yamanaka等，爿rtri附/c^Wo/v4ge/^C7^附43:1卯画193，1999)。ETV也证明了在慢性感染土拨鼠肝炎中抗WHV的功效(Colonno等，JID184:1236-452001;Genovesi等，爿wrt附ic6,W^ge",C7iew":3209-3217，1998)。一个四个星期的剂量逐步上升的试验表明ETV是高度耐受的，并且在试验的最高剂量(1mg/天)导致病毒血症平均降低2.5log10。据报道LMV抗性突变在体外具有ETV交叉抗性，尽管恩替卡韦仍然能够在更高剂量时抑制病毒复制；鉴于ETV不是L型核苷，这些数据有些令人吃惊的。ETV已经被成功用于治疗抗LMV的HBV突变的患者。没有特异的ETV抗性突变体被描述。核苷类似物治疗可以作为单一治疗或联合治疗实施，联合治疗是指给予两种或更多种类似物。核苷类似物也可以和其它抗病毒试剂(如干扰素或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG))联合给予。这里有鉴定抗核苷和/或抗体的HBV变体的必要。快速鉴定可以导致正在使用的治疗方案的改变。发明概述表l定义的缩写被用于本说明书。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>整个说明书中，除非上下文另外要求，单词"包含"，或其变化形式应被理解为意味着所述元素或其整体或元素组或其整体的包括，而不是排除任何其它元素或其整体或元素组或其整体。核苷酸和氨基酸序列是通过序列标识符号(SEQIDNO:)表示。SEQIDNO:在数字上相当于序列标识符<400>1，<400>2等。序列列表将在权利要求书后提供。核苷酸和氨基酸突变的位置使用来自B、C或F基因型的命名法确定，此处在DNA聚合酶的YMDD基序中甲硫氨酸位置指定为550(参见澳大利亚专利第734831号)。本说明书中给出的核苷酸和氨基酸位置基于新的的命名法，此处YMDD中的甲硫氨酸的位置是204并且称为rtM204，此处rt是逆转录酶的缩写。根据本发明，HBV抗性变体在下面的患者中鉴定，一个既用LMV又用ETV治疗的慢性乙型肝炎的患者(患者A)和一个用ETV治疗的肝脏移植患者(患者B)，该患者以前用过包括LMV在内的许多核苷药物治疗。在联合治疗中，根据本发明，在LMV和ETV治疗后鉴定了具有在HBVDNA聚合酶基因内突变的HBV抗性变体，突变降低了HBV对这些核苷类似物的敏感性。在表面抗原内也发生相应的突变。这些HBV变体的鉴定对于开发用来监控LMV和/或ETV抗性和/或其它核苷类似物治疗方案抗性的检验方法和筛选作为替代治疗药物的有价值的药物是重要的。从患者A分离的HBV的关键功能结构域中检测到的突变，即rtl69T+rtV173L+rtL180M+rtM204V，在功能分析中证明对ETV具有下降的敏感性。这种HBV变体的检测在治疗方案的管理上尤其重要，包括治疗HBV感染的合适的药物的选择。本发明这个方面的方法部分地依据监控在核苷类似物存在下具有升高的HBV载量的受试者的发展。临床医生于是能够对现行的治疗方案进行修改或相应地选择合适的治疗方案。因而本发明的一个方面是涉及分离的HBV变体，该变体在编码DNA聚合酶的基因中包含核苷酸突变，导致DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失，并且对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。优选地，DNA聚合酶对ETV或和ETV表现下降的敏感性。变异的HBV在基因组内重叠的开放阅读框中在由HBVDNA聚合酶的一个或多个F和A-E结构域定义的区域内包含突变。本发明进一步涉及用于确定HBV对ETV和/或LMV或可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性的潜力的方法，通过从HBV分离DNA或相应的mRNA并且在编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个F和A-E的结构域中或最接近那里的区域中至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并且该突变和对ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相关。这种突变的存在是对所述的恩替卡韦和/或LMV可能存在抗性的指示。优选地，HBV变体对ETV、或ETV和LMV二者表现下降的敏感性。本发明也提供一种组合物，该组合物包括抗ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物的变异的HBV或来自变异的HBV的HBV表面抗原或它的重组或衍生形式或它的化学等价物和一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。本发明的另外一个方面提供前述组合物或在编码DNA聚合酶的基因中包含核苷酸突变的变异的HBV在生产用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的药物中的应用，该突变导致DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失，并且对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物的下降的敏感性。本发明也涉及用于确定HBV林是否对核苷类似物表现下降的敏感性的方法，通过从HBV中分离DNA或相应的mRNA，并且在编码DNA聚合酶的拔蕃隨到.电筛选交复，其中在间隔区和r寬E下齊的突变间隔区L971、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。本方法也可以通过在编码DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变而实施，其中下面的在rt区的B或C结构域中的突变rtll69T，rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、r総04V或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。应该注意突变体rtV173L、rtL180M和rtM204V分别相应于澳大利亚专利第734831号(釆用初期的命名体系)的突变体V519L、L526M和M550V。深入的方法包括在编码包膜基因的核苷酸序列中筛选突变，其中在PreSl、PreS2和S基因中的下面的突变(括号内表明在重叠的逆转录酶区的变化)PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL89V、sT118A、sF161L(=rtI169T)、sE164D(=rtV173L)、sI195M(=rtM204V)、sI208T、PreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。优选地，变体是以分离的形式存在，以致它们从天然存在的体液分离后经过了至少一个纯化步骤。或者，变体可以在分离的体液中或以DNA形式维持。本发明也涉及包含来自变异的HBV的基因组或其部分基因组的有感染力的分子克隆。在细胞、细胞裂解物、培养上清液和体液中的HBV或它的组分的检测可以通过任何〗更利的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如，通过核酸杂交技术或通过一个或多个聚合酶链式反应(PCRs)。术语"体液"包括得自血液、淋巴、组织或器官系统的任何流体，包括血清，全血、活检组织和活检组织液、器官移植体和器官悬液，如肝悬液。本发明进一步包括基于核酸的检测方法的不同检测形式的使用，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单链构像多态性(SSCP)、扩增和错配检测(AMD)、散布重复序列聚合酶链式反应(IRS-PCR)、反向聚合酶链式反应(iPCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。在鉴定特异的核苷酸或核苷酸序列上反向杂交是尤其有用的技术。其它检测形式包括Northern印迹、Southern印迹、PCR测序、抗体方法，如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、Western印迹和免疫组织化学。一个尤其有用的分析包括固定化寡核苷酸或寡肽介导的检测系统所要求的试剂和组分。本发明的另外一个方面涉及包含具有下列特征的表面抗原的HBV变体，该表面抗原和来自参照或野生型HBV的表面抗原相比具有含单一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中相对于所述的HBV变体，参照或野生型表面抗原产生的抗体表现了改变的免疫学性质。一个改变的免疫学性质包括降低的中和HBV的能力。更具体地，和治疗前的HBV相比，变异的HBV的表面抗原表现改变的免疫学性质，此处变异的HBV通过HBVDNA聚合酶的核苷类似物选择。本发明的这个方面的变异的HBV也可以包含这样的核苷酸序列，和治疗前的HBV相比，该核苷酸序列包括一个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失。本发明扩展到相应于变异的HBV的分离的HBsAg或它的重组形式或它的衍生物或化学的等价物。通常，HBsAg或它的重组或衍生形式或它的化学等价物包括这样的氨基酸序列，和来自参照HBV的HBsAg相比，含有单一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中相对于带有所述的变异的HBsAg的HBV，针对参照HBV的抗体表现改变的免疫学性质。在一个实施方案中，改变的免疫学性质包括降低的中和变异的HBV的能力。本发明部分地依据HBV变体的鉴定和分离，该HBV变体具有多个突变并且表现选自下面的两个或多个性质相对于野生型HBV，对一种或多种核苷类似物减少的或下降的敏感性；乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力；或下降的、取消的或受损的免疫相互作用。因此，具有这些突变模式的HBV变体的鉴定是重要的，尤其对于开发用于检测HBV变体的检验和用于筛选对治疗和/或预防由那些变体或/和其它HBV分离林引起的感染的有用药物的检验，以及开发控制HBV感染的替代治疗方案。相应地，本发明的一个方面涉及包含和至少两个选自下面的性质相关的多种核苷酸突变的分离的HBV变体(a)对一种或多种核苷类似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受损的免疫相互作用。本发明的另外一个方面涉及包含多个核苷酸突变的分离的HBV18变体，这些核苷酸的突变和下面的性质相关(a)对一种或多种核苷类似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受损的免疫相互作用相关。本发明的另外一个方面提供了包含多种选自下面的两个或多个核苷酸突变的分离的HBV变体(a)在编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，导致对所述的DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失，其中所述的变体对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性，(b)编码乙型肝炎e抗原的基因或所述基因的转录控制元件中的核苷酸突变，其中所述的突变导致所述的乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力，或(c)编码乙型肝炎多肽的基因中的核普酸突变，导致对所述的多肽的至少一个氨基酸的添加、置换和/或缺失，降低、取消或损害了它的免疫相互作用。本发明的另外一个涉及设想用于检测对HBV表现抑制活性的药物的方法，通过产生一个基因构建体，该构建体包括来自包含于质粒载体中的HBV的复制有效量的基因组，然后用所述的构建体转染所述的细胞，在转染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞，在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性，则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。在优选的实施方案中，质粒载体是杆状病毒栽体并且方法包括产生基因构建体，该构建体包括来自HBV的复制有效量的基因组，其包含在或融合于对感染细胞有效量的杆状病毒基因组，并且用所述的构建体感染所述的细胞，在感染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞，在一定条件下培养细胞一段时间，所迷条件为如果对所述的药物有抗性，则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒然后对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。在可供选择的实施方案中，该方法包括产生连续细胞系，包含复制有效量的HBV基因組的有感染力的拷贝，以致所述的有感染力的HBV基因组稳定整合到所述的连续细胞系中，比如但不局限于2.2.15或AD,用待检测的药物接触细胞，在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性，则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒然后对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。在可供选择的实施方案中，本发明也涉及在体外聚合酶检验中用于检测对HBV聚合酶表现抑制活性的药物的方法。使用已被确认的检验方法可以测定HBV聚合酶活性(Gaillard等，^rari附,cw6爿^wtoC&歸紐.W六1005-1013，2002;Xiong等，i/一o一.2W":1669-73，1998)。HBV聚合酶可以是野生型或参照HBV聚合酶或突变的HBV聚合酶。和这些方法相结合，质粒栽体可以包括编码部分或全部的其它病毒载体的基因，例如杆状病毒载体或腺病毒载体(参见Ren和Nassal，/.75〔":1104-1116，2001)。病毒变体的鉴定使得能够产生包括特定的重组病毒组分(例如聚合酶或编码L、M、S蛋白的包膜基因PreSl、PreS2、S)的疫苗以及包括缺陷的HBV变体的治疗疫苗。可以采用合理的药物设计来鉴定或产生治疗分子，该治疗分子能够和聚合酶或编码L、M、S蛋白的包膜基因PreSl、PreS2、S或HBV的其它组分相互作用。这样的药物也可能具有诊断潜力。贯穿本说明书使用的序列标识符的总结在表2中提供。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>附图简介图1是显示部分双链DNA的HBV基因组的图示，表明编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的重叠的开放阅读框。图2患者A的临床病历的图示，包括治疗方案、HBVDNA病毒载量和丙氨酸转氨酶(ALT)水平。图3是恩替卡韦的化学结构的图示。图4是在LMV单一治疗或LMV/恩替卡韦联合治疗期间来自患者A序贯样本中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列比较示意图。图5是在LMV单一治疗或LMV/恩替卡韦联合治疗期间来自患者A序贯样本中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列比较示意图。图6是在LMV单一治疗或LMV/恩替卡韦联合治疗期间来自患者A序贯样本中包膜基因的推导的氨基酸序列比较示意图。图7是确定HBV变体潜能值(PA)的计算机系统的图示。图8是在LMV单一治疗(ETV前)期间和ETV治疗时来自患者B序贯样本中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列比较示意图。图9是在LMV单一治疗(ETV前)期间和ETV治疗时来自患者B序贯样本中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列比较示意图。图10是在LMV单一治疗(ETV前)期间和ETV治疗时来自患者B序贯样本中包膜基因的推导的氨基酸序列比较示意图。图11与没有药物对照的野生型和编码rtll69T+rtV173L+rtL180M+rtM204M突变的HBV相应的由定量PCR检测的HBVDNA复制中间产物图示。优选实施方案详述本发明部分地依据在用ETV或LMV或ETV和LMV和可选的其它核苷类似物对患者治疗后对核苷类似物具有抗性的HBV变体的鉴定和分离。尤其是，ETV、ETV和LMV治疗的患者产生对ETV和/或LMV表现减少的或下降的敏感性的HBV变体。此处关于ETV和/或LMV的敏感性相关的"减少"或"下降"包括对核苷类似物的完全的或相当大的抗性以及部分抗性，并且包括在核苷类似物存在下比野生型更高的复制速率或复制效率(产生表型)。在一方面，这可以通过22病毒栽量升高到和治疗前相似或更高的水平便捷地测定。相应地，本发明的一个方面是针对分离的HBV变体，其中所述的变体在编码DNA聚合酶的基因中包括核苷酸突变，导致所述的DNA聚合酶的至少一个氨基酸的添加、置换和/或缺失，并且其中所述的变体对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。优选地，降低的敏感性关于ETV、或ETV和LMV。除了编码DNA聚合酶的基因中的突变，由于HBV基因组的重叠性质(图1)，相应的突变也会发生在编码表面抗原(HBsAg)的基因中，导致和免疫试剂(例如针对HBsAg的抗体和免疫细胞)降低的相互作用。病毒表面组分的免疫试剂相互作用的降低通常包括识别或基本上识别病毒表面组分的免疫记忆的缺失。本发明因此扩展到对ETV和/或LMV表现下降的敏感性和针对HBsAg的免疫试剂表现降低的相互作用的HBV变体，其中变体在ETV和/或LMV联合或序贯治疗后净皮筛选。在这方面术语"序贯"意思是ETV后是LMV或LMV后是ETV或每次的ETV和LMV或LMV和ETV的多次序贯给予。病毒变体因而可以只在DNA聚合酶或DNA聚合酶和HBsAg二者中带有突变。术语"突变"应该在最广背景下理解并且包括多个突变。本发明扩展到HBVDNA聚合酶的任一结构域并且尤其是F和A-E区域的突变，只要所述的突变导致对LMV和/或ETV下降的敏感性。HBVDNA聚合酶的F区由下式I[SEQIDNO:lj中所示的氨基酸序列确定。式IL，BhB2，D,W，G，P,C,B3，B4,H，G,B5，H，B6，I,R，B7,P,R,T，P,B8,KV，B9,G,G,V，F,L,V，D，&N,P，H,N,T，B10，E，S，B"，L，B12，V，D，F，S，Q，F，S，R,G,B13,B14，B15，V,S,W，P，KF，V,P,N,L,B16，S，L，T，N,L,L,S*其中是L或R或IB2是E或DB3是T或D或A或N或YB4是E或DB5是E或K或QB6是H或R或NB7是I或TB8是A或SB9是T或RBio是A或T或SBu是R或TB12是V或GB13是S或I或T或N或VBl4是T或S或H或YB15是R或H或K或QBi6是Q或P并且其中S4皮指定为氨基酸74。在本说明书中，由A-E结构域确定的DNA聚合酶的保守区是尤其相关的。区域A到E由下式II[SEQIDNO:2j所示的氨基酸序列确定(并且在澳大利亚专利第734831号中式IISZ,LSWLSLDVSAAFYHZ2PLHPAAMPHLLZ3GSSGLZ4RYVARLSSZ5SZ6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZuLHZ12Z13CSRZ14LYVSLZl5LLYZi6TZnGZ18KLHLZi9Z20HPIZ2iLGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z3iFZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37HZ38EZ39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z461:LZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLNFMGYZ50IG其中X是任意氨基酸；Zi是N或D;Zz是I或P;Zs是I或V;Z4是S或D;Zs是T或N;Z6是R或N;Z7是N或I;Zs是N或Y或H;Z9是H或Y;Zk)是G或R;Zu是D或N;Zu是D或N;Zu是S或Y;Z"是N或Q;Z^是L或M;Zw是K或Q;Zn是Y或F;Z^是R或W;Zw是Y或L;Z2。是S或A;Z21是I或V;Zn是I或L;Z23是V或G;Z24是C或L.，乙25是A或S;Zm是V或M;Z27是V或T;Z28是R或C;Zm是L或V;Zm是A或V;Z32是S或A;Z33是V或L或M;Zw是K或R;Zm是S或T;Z36是V或G;Zw是Q或E;Z38是L或S或R;Z39是S或F;Zm是F或Y;Z"是T或A;Zm是A或S;Z"是V或I;Z44是T或C;Z45是N或S;Z"是F或V;Z"是L或V;Z"是N或Q;Zso是V或I;和]VP是氨基酸204;并且其中第一个S指定为氨基酸75。优选地，突变导致HBVDNA聚合酶的《壬何一个或多个F和A-E结构域或最接近那里的区域内氨基酸序列改变。本发明的另外一个方面提供在基因组的重叠开放阅读框内包含突变的HBV变体，其中所述的突变在由HBVDNA聚合酶的一个或多个F和A-E结构域确定的区域内，并且所述的变体对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。在相关的实施方案中，提供了在编码DNA聚合酶的核苷酸序列内包含突变的HBV变体，该突变导致了在所述的DNA聚合酶中式I[SEQIDNO:l和/或HSEQIDNO:2所示的一个或多个氨基酸的氨基酸的添加、置换和/或缺失式IL,BhB2，D,W,G,P，C'B3,B4，H,G,B5,H,B6,I，B7,P,R,T,P,B8,R，V,B9,G,G,V，F，L，V，D,K,N，P,H，N，T,B0，E，S，Bn，L,B12,V，D，F，S,Q，F，S，G,B13,B14,B15，V，S，W，P，K,F，A,V，P,N，L，B16,S'L,T，N,L,L，S*其中Bi是L或R或IB2是E或DB3是T或D或A或N或YB4是E或DB5是E或K或QB6是H或R或NB7是I或TB8是A或SB9是T或RBio是A或T或SBu是R或TB12是V或GB13是S或I或T或N或V是T或S或H或YB15是R或H或K或QBi6是Q或P以及式IISZtLSWLSLDVSAAFYHZ2PLHPAAMPHLLZ3GSSGLZ4RYVARLSSZ5SZ6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZULHZ12Z13CSRZ14LYVSLZ15LLYZ16TZ17GZ18KLHLZ19Z20HPIZ21LGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z31FZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37HZ38EZ39LZ4oZ4iZ42Z43Z44Z45Z46LLZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLNFMGYZ50IG其中X是任意氨基酸；Z！是N或D;Z2是I或P;Z3是I或V;Z4是S或D;Zs是T或N;Z6是R或N;Z7是N或I;Zs是N或Y或H;Z9是H或Y;Z^是G或R;Zn是D或N;Z^是D或N;Zu是S或Y;Z"是N或Q;Z^是L或M;Zw是K或Q;Zn是Y或F;Zw是R或W;乙19是Y或L;Z2。是S或A;Z21是I或V;Z23是V或G;Zm是C或L;Zm是A或S;Z26是V或M;Zn是V或T;Z^是R或C;Zm是F或P;Z3。是L或V;Z31是A或V;Zh是S或A;Z33是V或L或M;Z34是K或R;Z^是S或T;Z^是V或G;Z;7是Q或E;Z^是L或S或R;Z39是S或F;Zm是F或Y;Z41是T或A;Z"是A或S;Z43是V或I;Z"是T或C;Z"是N或S;Zm是F或V;Z化是L或V;Z"是N或Q;Zso是V或I;和1VP是氨基酸204;并且其中在式I中的S4皮指定为氨基酸74，在式II中的第一个S被指定为氨基酸75;并且其中所述的变体对ETV和/或LTV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。优选地，下降的敏感性是针对ETV或LMV和/或ETV二者。本发明的另外优选方面涉及在编码HBsAg的核苷酸序列内包含突变的HBV变体，该突变导致在所述的HBsAg中相应于式I和II所示的氨基酸序列的区域内氨基酸的添加、置换和/或缺失，其中所述的变体对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。更具体地，本发明提供包含这样表面抗原的HBV变体，该表面抗原和来自参照或野生型HBV的表面抗原相比具有含单一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中针对参照或野生型表面抗原的抗体表现了下降的中和所述HBV变体的能力，所述的变体是在联合或序贯治疗中通过使受试者接触ETV和/或LMV而筛选。术语"联合治疗"是指ETV和LMV二者在同一组合物中共同给予或在不同组合物中同时给予。术语"序贯治疗，，意思是指两种药物在几秒、几分钟、几小时、几天或几周内以任一顺序或交替给予。序贯治疗也包括用或者ETV或者LMV完成治疗过程，然后用另外的ETV或LMV完成另一治疗过禾呈。相应地，本发明的另外一方面涉及包含这样的表面抗原的HBV变体，该表面抗原和治疗前的HBV相比具有含单一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中和治疗前的HBV相比，变异的HBV的表面抗原表现了改变的免疫学性质，此处所述的变异的HBV通过HBVDNA聚合酶的核苷类似物选择，所述的变体是在联合或序贯治疗中通过使受试者接触ETV和/或LMV而筛选。在相关的实施方案中，本发明提供包含这样的核苷酸序列的HBV变体，该核苷酸序列和治疗前的HBV相比，包含一个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失，并且和治疗前HBV相比，HBV变体含有表现改变的免疫学性质的表面抗原，所述的变体是在联合或序贯治疗中通过使受试者接触ETV和/或LMV而筛选。优选地，变体是以分离的形式存在，以致它们从天然存在的体液分离后经过了至少一个纯化步骤。或者，变体可以在分离的体液中或以DNA形式维持。本发明也涉及了包含来自变异的HBV的基因组或其部分基因组的有感染力的分子克隆。而且，本发明提供了来自变异的HBV的分离组分，比如但不局限于分离的HBsAg。相应地，本发明提供分离的HBsAg或它的重组形式或它的衍生物或化学的等价物，来自变异的HBV的所述的HBsAg是在联合或序贯治疗中通过使受试者接触ETV和/或LMV而筛选。更具体地，本发明的另外一个方面涉及分离的变异的HBsAg或它的重组的或衍生的形式或它的化学等价物，其中和来自参照HBV的HBsAg相比，所述的HBsAg或它的重组的或^f生的形式或它的化学等价物表现改变的免疫学性质，来自变异的HBV的所述的HBsAg是在联合或序贯治疗中通过使受试者接触ETV和/或LMV而筛选。甚至更具体地，本发明提供了分离的变体HBsAg或它的重組的或衍生的形式或它的化学等价物，和来自参照HBV的HBsAg相比，其中所述的HBsAg或它的重组的或衍生的形式或它的化学等价物包括具有单一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中针对参照HBV的中和抗体对带有所述的变异的HBsAg的HBV具有降低的或不具有中和活力，来自变异的HBV的所述的HBsAg是在联合或序贯治疗中通过使受试者接触ETV和/或LMV而筛选。在HBVDNA聚合酶中的优选的突变包括选自在ETV和/或LMV治疗后HBV复发的患者的变体。优选地，治疗包括在联合或序贯治疗中ETV或ETV和/或LMV二者。核苷类似物的治疗是针对移植过程(例如骨髓移植(BMT)或OLT)或在诊断为肝炎的患者的治疗后进行。在变体筛选后，高于治疗前的水平的病毒载量是可以获得的。在HBVDNA聚合酶中的优选的突变包括一个或多个的间隔区L97I、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的一个或多个其它突变，这是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有降低的敏感性的变体的指示。应该注意氨基酸位置的命名系统基于在YMDD基序中甲硫氨酸残基被指定为编码rtM204。这个编号体系和澳大利亚专利第734831号中的不同，在澳大利亚专利第734831号中聚合酶基因内的YMDD基序中的甲硫氨酸残基被指定为编码550。在这点上，rtV173L、rtL180M和rtM204V分别相应于澳大利亚专利第734831号的V519L、L526M和M550V。术语"间隔区"的意思是被指定在末端蛋白和逆转录酶这两个功能区之间的区域。它为功能区提供了正确折叠并且没有其它特定功能赋予这个区域。相应的突变也可能发生在包膜基因中，例如在一个或多个的PreSl，PreS2和HBsAg中。具体的突变如下PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL89V、sT118A、sl61L、sE164D、sI195M、sI208TPreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其组合或等同的一个或多个突变，这是对ETV和/或LMV和可选的其它核普类似物具有降低的敏感性的变体的指示。在编码HBsAg的基因中sF161L、sE164D或sI195M突变也分别导致在聚合酶基因rtll69T、rtV173L或rtM204V的突变。其它相应的突变可能在rt内发生，如间隔区L971、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、r鏡04V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的一个或多个其它突变，这是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。本发明的变体的鉴定允许产生一系列的检验来检测这样的变体。这种变体的检测在鉴定抗性变体是重要的，以确定合适的化学治疗形式和/或监控疫苗方案或开发新的或改良的疫苗制剂。的其它核苷类似物表现降低的敏感性的潜力的方法，;述的方il括从所述的HBV分离DNA或相应的mRNA，并且在编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个F和A-E的结构域中或最接近那里的区域中至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并且该突变和对ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相关。这种突变的存在是对所述的ETV和/或LMV可能存在抗性的指示。优选地，该检验在间隔区和/或rt区可以检测到一个或多个下面的突变间隔区L97I、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的一个或多个其它突变，这是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。相应地，本发明的另外一个方面产生用以确定HBV林是否对核苷类似物表现下降的敏感性的方法，所述的方法包括从所述的HBV分离DNA或相应的mRNA，并且在编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，其中在间隔区和rt区下面的突变间隔区L971、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在，是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有降低的敏感性的变体的指示。逆转录酶中优选的突变是rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或其组合或等同的一个或多个其它突变，这是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有降低的敏感性的变体的指示。相应地，本发明的另外一个方面涉及用以确定HBV抹是否对核苷类似物表现降低的敏感性的方法，所述的方法包括从所述HBV分离DNA或相应的mRNA,并且在编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，其中在rt区的B或C结构域中下面的突变rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在，是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有降低的敏感性的变体的指示。在细胞、细胞裂解物、培养上清液或体液中的HBV或它的组分的检测可以通过任何便利的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如，通过核酸杂交技术或通过一个或多个聚合酶链式反应(PCRs)。术语"体液，，包括任何得自血液、淋巴、组织或器官系统的液体，包括血清，全血、活检组织和活检组织液、器官移植体和器官悬液，如肝悬液。本发明进一步包括所述基于核酸检测方法的不同检验形式的使用，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段多态性(AFLP)、单链构像多态性(SSCP)、扩增和错配检测(AMD)、interspersedrepetitivesequence聚合酶链式反应(IRS-PCR)、反向聚合酶链式反应(iPCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。其它检测形式包括Northern印迹、Southern印迹、PCR测序、抗体方法，如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、Western印迹和免疫组织化学。一个尤其有用的分析包括固定化寡核苷酸或寡肽介导的检测系统所要求的试剂和组分。一个尤其有用的核酸检测系统是反向杂交技术。在这个技术中，使用生物素或其它配基标记引物来扩增来自HBV样品的DNA以产生标记的扩增子。然后通过杂交用固定在固相支持物(例如硝酸纤维素薄膜)上的寡核苷酸捕获扩增的DNA。通过生物素或配基来鉴定特异的核酸片段。通常，标记引物对待检测的特定的核苷酸变异是特异的。扩增只在待检测的变异存在下发生。有许多种形式的反向杂交分析形式并且所有都包括在本发明中。在细胞培养液中检测HBV复制是尤其有用的。本发明的另外一个方面涉及用于检测对HBV表现抑制活性的药物的方法，通过产生一个基因构建体，该构建体包括包含于质粒载体中的来自HBV的复制有效量的基因組，然后用所述的构建体转染所述的细胞；在转染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。在优选的实施方案中，质粒载体可以包括编码部分或全部其它病毒载体的基因，例如杆状病毒或腺病毒(Ren和Nassal，2001并且方法包括产生一个基因构建体，该构建体包括来自所述HBV的复制有效量的基因组，其包含于或融合于感染细胞有效量的杆状病毒基因组或腺病毒基因组中，然后用所述的构建体感染所述的细胞；在感染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。在可供选择的实施方案中，该方法包括产生连续细胞系，该连续细胞系包含复制有效量的HBV基因组的有感染力的拷贝，以致所述的有感染力的HBV基因组稳定整合到所述的连续细胞系中，比如但不局限于2.2.15或AD;用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制j表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。正如上面所示，变体也可以针对HBsAg(s基因)和PreSl、PreS2包膜基因检测。在这点上优选的突变包括一个或多个PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL拼、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208TPreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F。相应地，本发明的另外一个方面涉及用以确定HBV抹是否对核苷类似物表现下降的敏感性的方法，所述的方法包括从所述的HBV分离DNA或相应的mRNA，并且在编码包膜基因的核苦酸序列中篩选突变，其中在PreSl、PreS2和HBsAg中下面的突变PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL89V、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208TPreSlE86Q、PreSl顧K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在，是对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物具有降低的敏感性的变体的指示。本发明部分地根据HBV变异体的鉴定和分离，HBV变异体具有多个突变并且表现选自下面的两个或多个性质和野生型HBV相比，对一种或多种核苷类似物减少的或降低的敏感性；乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力；或降低的、废除的或受损的免疫相互作用。因此，具有这些突变模式的HBV变体的鉴定是重要的，尤其对于开发用于检测HBV变体的检验法和用于筛选对治疗和/或预防由那些变体或/和其它HBV分离株引起的感染的有用药物的检验法，以及开发控制HBV感染的替代治疗方案。相应地，本发明的一个方面是针对包含和至少两个选自下面的性质相关的多种核苷酸突变的分离的HBV变体(a)对一种或多种核苷类似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受损的免疫相互作用。本发明的另外一个方面涉及包含多个核苷酸突变的分离的HBV变体，这些核苷酸的突变和下面的性质相关(a)对一种或多种核苷类似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受损的免疫相互作用。本发明的另外一个方面提供了包含多种选自下面的两个或多个核苷酸突变的分离的HBV变体(a)在编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，导致对所述的DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失，其中所述的变体对ETV和/或LMV和可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性，(b)编码乙型肝炎e抗原的基因或所述基因的转录控制元件中的核苷酸突变，其中所述的突变导致所述的乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力，或(c)编码乙型肝炎多肽的基因中的核苷酸突变，导致对所述的多肽的至少一个氨基酸的添加、置换和/或缺失，降低、取消或损害了它的免疫相互作用。DNA聚合酶的氨基酸变体的检测可以通过参照式I和II所示的氨基酸序列完成。所示的多态性代表在用于活性病原的HBV林的多种数据库中所示的变异。当HBV变体包含不同于所表示的氨基酸时，这种分离抹被认为是具有改变的DNA聚合酶活性的推定的HBV变体。本发明进一步包括抑制ETV和/或LMV抗性的HBV变体的药物。如果临床医生采用ETV和/或LMV和/或可选的其它核苷类似物长期治疗，这种药物是尤其有用的。药物可以是DNA或RNA或蛋白质的或非蛋白质的化学分子。从自然产物(例如植物、珊瑚和微生物)中篩选也被预期作为一种遮蔽剂的有价值的潜在来源。药物可以是分离的形式或药物组合物的形式并且可以和核苷类似物序贯或同时给予。相应地，本发明的另外一个方面涉及用于检测对于HBV表现抑制活性的药物的方法，所述HBV对于ETV和/或LMV表现抗性或下降的敏感性，所述的方法包括产生一个基因构建体，该构建体包括包含于质粒载体中的来自HBV的复制有效量的基因组，然后用所述的构建体转染所述的细胞；在转染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。本发明的另外一个方面提供用于检测对于HBV表现抑制活性的药物的方法，所述HBV对于ETV和/或LMV表现抗性或下降的敏感性，所述的方法包括产生一个基因构建体，该构建体包括来自所述HBV的复制有效量的基因组，其包含于或融合于感染细胞有效量的杆状病毒基因组中，然后用所述的构建体感染所迷的细胞；在感染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。本发明的另外一个方面提供用于检测对于HBV表现抑制活性的药物的方法，所述HBV对于ETV和/或LMV表现抗性或降低的敏感性，所述的方法包括产生一个基因构建体，该构建体包括来自所述HBV的复制有效量的基因组，其包含于或融合于感染细胞有效量的杆状病毒基因组中，然后用所述的构建体感染所述的细胞；在感染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或装配和/或释放。优选地，HBV基因组稳定整合入细胞基因組中。虽然杆状病毒载体在实施本发明中尤其有用，本发明扩展到一系列的其它载体，例如但不局限于腺病毒。本发明进一步扩展到带有基因构建体的细胞系，该构建体包括全部或部分的HBV基因组或基因或基因的一部分。本发明也提供本发明的HBV变体来筛选抗病毒药物的用途。这些抗病毒药物抑制病毒。术语"抑制，，包括拮抗或防止感染、复制、装配和/或释放或任何中间步骤。优选的抗病毒药物包括核苷类似物，然而，本发明扩展到非核苷分子。另外，合理的药物设计也可被用来鉴定或产生化学分子，这些化学分子或者模拟核苷或者和特定的核苷酸序列或特定的核苷酸相互作用。组合化学和双杂交筛选是用来鉴定潜在的治疗或诊断药物的若干技术之一。在一个实例中，聚合酶或表面抗原的晶体结构用来合理地设计小的化学分子，这些化学分子可能和功能和/或抗原性所要求的分子的关键区相互作用。这种药物作为聚合酶的活性抑制剂是有用的和/或改变表面抗原的表位。由于和来自HIV逆转录酶的相似性，HBV聚合酶的几个模型已经制备(Das等，丄Wo/.75(7^:4771-4779,2001;Bartholomeusz等，^簡油W437-3421997;Allen等，i^/m油gj;27广":1670-1677，1998)。HBV聚合酶的模型可以用来进行针对编码抗性突变的HBV以及野生型病毒有效的新药物的合理药物设计。被设计的合理的药物可以基于对现存的抗病毒药物的改良，例如用于筛选编码和抗性相关的突变的HBV的药物。表达编码突变的HBV基因组物质的病毒或克隆也可以用来筛选新的抗病毒药物。上面的方法在鉴定抗ETV和/或LMV的HBV的抑制剂中尤其有用。本发明因而扩展到抑制剂的组合物。抑制剂也可以是抗体或遗传分子的形式，例如核酶、用于RNAi共抑制或诱导的反义分子和/或有义分子。提到RNAi包括涉及siRNA。术语"组合物"包括"药物组合物"。抑制剂在下面被称为"活性成份，，或"活性化合物"，并且可以选自上面给出的抑制剂名单。组合物可以包括HBV的抗原性组分、缺陷型的HBV变体或通过自然产物筛选或合理药物设计(包括组合化学)鉴定的药物。药物可接受的载体和/或稀释剂包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种针对药物活性物质的介质或试剂的使用为本领域众所周知。除了任何和活性成份不相容的常规的介质或试剂，也包括其在治疗组合物中的应用。补充的活性成份也可以被引用到组合物中。药物组合物也可以包含遗传分子，例如能够转染目的细胞的载体，该栽体带有能够编码天冬氨酰蛋白酶抑制剂的核酸分子。例如载体可以是病毒载体。适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液(此处是水可溶的)和用于临用前制备无菌可注射溶液的无菌粉末。它在生产和贮藏条件下必须稳定并且必须在抗微生物(例如细菌和真菌)污染作用下保存。载体可以是溶剂或稀释介质，例如包括，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)、它们合适的混合物和植物油。适当的流动性可以被保持，比如，通过使用superfactant。微生物作用的抑制可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂实现，例如，羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等。在许多例子中，优选地是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。注射组合物的延长吸收可以通过在药物的组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶。无菌可注射溶液通过使所需量的在合适溶剂中的活性化合物和所要求的活性组分和可选的其它活性组分混合，然后通过过滤灭菌或其它合适的灭菌方法而制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，可以产生具有活性组分加上任何补充的所需组分的粉末。当活性组分被适当地保护，它可以口服给药，例如，使用惰性稀释剂或使用可吸收的适食载体，或装入硬的或软的壳的明胶胶嚢，或可以压缩成药片。用于口服治疗给药，活性成份可以和赋形剂混合，并且以可消化的药片、颊片、锭剂、胶嚢、酏剂、悬浮剂、糖浆、干糊片等形式使用。这种组合物和制剂应该包含至少重量为1%的活性化合物。组合物和制剂的百分含量当然是可以是不同的并且可以方便地在大约单位重量的5%-80%。在这种治疗有效的组合物中的活性化合物的量是使得可以获得合适的剂量。根据本发明的优选的组合物或制剂是这样制备，以致口服剂量单位形式包含大约0.1/ig-200mg的活性化合物。可以选择的剂量包括大约l/tg-约1000mg和约lOjng-约500mg。这些剂量是根据每个个体或每千克体重。给药可以是每小时、天、周、月或年。药片、颊片、药丸或胶嚢等也可以包含此后列出的组分。黏合剂，如树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钾；崩解剂，如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂，如薄荷油、冬青油或櫻桃香料。当药剂单位形式是胶嚢，除了上面类型的原料外，它可以包含液体载体。多种其它原料可以作为包衣或来改变药剂单位的物理形式而出现。例如，药片、药丸或胶嚢可以用虫胶、糖或二者包被。糖浆或酏剂可以包含活性化合物、蔗糖作为甜味剂、甲基和丙基苯甲酸酯作为防腐剂、染料和调味剂。当然，在制备任何药剂单位形式时所用的任何原料应该是药物纯的并且基本上在所用量内无毒性。另外，活性化合物可以掺入到持续释放的制品和制剂中正如上面所述，本发明进一步扩展到来自此处描述的HBV变体的分离的HBsAg。更具体地，本发明提供了HBsAg或它的重组形式或它的衍生的或化学的等价物。分离的表面组分和，更具体地，分离的表面抗原或它的重组的、衍生的或化学的等价物在生物组合物(例如疫苗制剂)的开发中有用。本发明的另外一个方面提供了组合物，该组合物包含抗ETV和/或LMV和可选的其它苷类似物的变异的HBV或来自所述的变异的HBV的HBV表面抗原或它的重组的或衍生的形式或它的化学等价物以及一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。正如上面所示，针对突变的HBV可以产生抗体，并且用来针对由这些病毒引起的感染的被动或直接的免疫。抗体可以产生于人类或非人类的动物。在后者的情况下，非人类抗体需要在使用前去免疫或更特异地人源化。去免疫可以包括，例如，移植来自鼠或非人类动物的抗HBV抗体的可变区的互补决定区(CDRs)到人的共有抗体片段结合(Fab)多肽上。或者，在抗体可变区内定义表位的氨基酸可以被突变以使表位不再被人的MHCII复合物识别。在核酶的范围内，考虑到反义或共抑制(RNAi)，这很便利地针对转录后的基因沉默。可以施加DNA或RNA或使用包含对HBVmRNA特异的RNAi的复合物或其化学类似物。所有这种分子可以包括进药物组合物中。在另外的实施方案中，本发明提供生物组合物，该組合物包括HBV变体或来自所述的变异HBV的HBsAg或L、M或S蛋白或它的重组的或衍生的形式或它的化学等价物。通常，如果HBV被使用，它首先要被减毒。根据本发明的这方面的生物组合物通常进一步包括一种或多种药物可接受的载体和/或稀释剂。生物组合物可以包括来自一种HBV变体的HBsAg或相似的分子或者组合物可以是来自一系列的抗ETV和/或LMVHBV变体的HBsAg或L、M或S蛋白或相似的分子的混合物。相似的内含同样适用于包含HBV的组合物。本发明进一步针对缺陷型的HBV变体在治疗疫苗的生产中的使用，用来给个体接种疫苗以防止具有特定核苷酸序列或编码特定的聚合酶或表面抗原或L、M或S蛋白的HBV变体的感染。在一个实施方案中，例如，HBV变体被鉴定为在它的聚合酶中具有特定的突变，该突变赋予对核苷类似物的抗性或下降的敏感性。然后这种变体可以被突变以使它成为缺陷型的，即，减毒或不能引起感染。这样的缺陷型的抗核苷类似物的病毒然后可以用做针对在聚合酶中具有相同突变的剧毒的病毒的治疗疫苗。本发明扩展到用于抗ETV和/或LMV的变异的HBV的检验试剂盒。这种试剂盒可以，例如，包含来自PCR或其它的核酸杂交技术的试剂或基于免疫学检测技术的试剂。一个尤其有用的检验包括用于固定的寡核苷酸或寡肽介导的检测系统所需的试剂和组分。本发明的另外一个方面涉及用以确定HBV对ETV和/或LMV或可选的其它核苷类似物表现下降的敏感性的潜力的方法，通过从HBV分离DNA或相应的mRNA并且在编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个F和A-E的结构域中或最接近那里的区域中至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并且该突变和对ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相关，其中这种突变的存在是对所述的ETV和/或LMV可能存在抗性的指示。潜在的病毒变体的评估对筛选合适的治疗方案是重要的。这种评估在用软件编程的计算机的帮助下得到了适当的促进，其计算用于至少两个和病毒变体相关的特性的指标(Ivs)以提供相应于病毒变体对特定化学化合物或免疫试剂的抗性或敏感性的潜能值(Pj。Ivs可以选自(a)对特定化合物或免疫试剂表现抗性或下降的敏感性的能力；(b)与野生型不同的HBV聚合酶；(c)与野生型HBV不同的表面抗原；(d)患者的发病和复原的潜力。因而，根据本发明，这种特性的IvS保存在机器可读的存储介质中，其能够处理数据以给特定的病毒变体或包含该病毒变体的生物样本提供PA。因此，在另外一方面，本发明涉及计算机程序产品，用于评估病毒变体或包含病毒变体的生物样本的可能的有效性以确定在一个受试者中合适的治疗方案，所述的产品包括(1)编码，作为输入Ivs接受至少两种和所述的病毒试剂或包含病毒试剂的生物样本相关的特性，其中所述的特性选自(a)对特定的化合物或免疫试剂表现抗性或下降的敏感性的能力；(b)与野生型HBV不同的DNA聚合酶(c)与野生型HBV不同的表面抗原；或(d)患者的发病和复原的潜力；(e)改变的复制能力(升高的或下降的)；(2)计算所述Ivs的和以提供相应于所述的病毒变体或生物样本的Pv的总和的编码；和(3)储存编码的计算机可读介质。在相关方面，本发明扩展到用于评估病毒变体或包含病毒变体的生物样本的可能的有效性的计算机，其中所述的计算机包括(1)机器可读数据存储介质，包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述的机器可读数据包括用于和所述病毒变体或生物样本的至少两种特性相关的Ivs，其中所述的特性选自(a)对特定的化合物或免疫试剂表现抗性或降低的敏感性的能力；(b)与野生型HBV不同的DNA聚合酶；(c)与野生型HBV不同的表面抗原；或(d)患者的发病和复原的潜力；(e)改变的复制能力(升高的或下降的)；(2)用于存储指令的工作存储器，该指令用于处理所述的机器可读的数据；(3)结合到所述的工作存储器和所述的机器可读数据存储介质的中心处理单元，用于处理所述的机器可读数据以提供相应于所述化合物Pv的所述IvS的总和；并且(4)结合到所述的中心处理单元的输出硬件，用于接收所述的Pv。本发明采用任何一般或特殊用途的计算机系统并且包括和内存以及至少一个输入/输出设备(例如终端)电子通讯的处理器。这种系统可以包括但不局限于个人电脑、工作站或大型机。处理器可以是一般用途处理器或微处理器或执行位于RAM内存的程序的专门化处理器。程序可以从存储设备(例如，磁盘或预编程ROM内存)放置于RAM。在一个实施方案中RAM内存既用于数据储存也用于程序执行。计算机系统也包括位于不同物理实体中但是通过网络电子通讯的处理器和内存的系统。例如，具有图7阐述的全部特点的计算机系统在实施本发明中是有用的。更特异地，图7是典型的计算机工作站的示意图，该工作站通过，例如，内部总线或外部网络使处理器(101)、RAM(102)、ROM(103)、终端(104)以及可选的外部存储器(例如磁盘、CDROM或磁带(105)具有互相的电子通讯(100)。本发明进一步通过下面的非限制性实施例描述。实施例1HBV的重叠的基因组在图1中表示。编码DNA聚合酶(P)的基因，和病毒包膜基因，Pre-Sl和Pre-S2重叠，并且和X和核心(C)基因部分重叠。HBV包膜包括小的、中等的和大的HBV表面抗原。大的蛋白质组分被称为HBV表面抗原(HBsAg)并且被S基因序列围绕。Pre-Sl和Pre-S2基因序列编码另外一个包膜组分。实施例2,悉者和浴^患者A是一位患有慢性乙型肝炎的44岁的男性，在0天(1999年7月9日)表现升高的HBVDNA水平(〉2000pg/ml),并且被建议立即进行LMV治疗(图2)。患者A的HBsAg阳性以及抗-HBe阳性。在LMV治疗开始后54天的疗程中HBVDNA水平下降到8pg/ml。HBVDNA保持低水平直到199天时，出现了复制复发以致HBVDNA水平达到1826pg/ml。到第241天时，血清ALT达到最高点为741IU/1。对HBVDNA测序，检测到抗LMV病毒。患者然后在第382天(2000年7月24日)加入了双盲ETV加上LMV临床试验。到第784天，HBVDNA水平只下降到33pg/m并且ALT降低到167IU/L。对患者开始开放标记ETV加上LMV。然而，HBVDNA水平以及ALT继续升高并且在第894天对HBVDNA测序(图2)。患者B是一位肝移植患者。该患者已经使用了许多种核苷类似物治疗，包括更昔洛韦(ganciclovir),泛昔洛韦(famciclovir)LMV和ETV。对患者在ETV前使用LMV治疗。患者目前在用ETV治疗中。在ETV治疗期间，HBVDNA水平减少到低于5pg/ml。在ETV治疗的第532天，相当于移植后的第3857天，出现HBVDNA水平的升高到993pg/ml。来自这个样本的HBVDNA进一步通过测序进行性质测定。实施例3使用市售的免疫分析测定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、抗-HBe和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特异的IgG和IgM(Abbott实验室，NorthChicago,IL，美国)。根据生产商的指南(DigeneHybridCaptureII，DigeneDiagnosticsInc.,Beltsville，MD)使用捕获杂交分析测定乙型肝炎病毒DNA水平。生产商声明用于检测临床样本中HBV病毒血症的临界值是0.7xl(^拷贝/ml或2.5pg/ml,[HendricksDA等，爿//C7/wPa^o/JM:537-46，19951。实施例4朋KZ)AC4时辦如以前在Aye等，JHe/m"U6:1148-53,1997中所描述的，在6个不同的时间点收集的100jd血清中提取HBVDNA(图2)。寡核苷酸由Geneworks，Adelaide,澳大利亚合成。HBV聚合酶基因的扩增已经由Aye等，1997，训/mz描述。使用购自MOBIOLaboratoriesInc(LaJolla,CA)的PCR纯化层析柱纯化特异的扩增产物，并且使用BigDyeterminatorCyclesequencingReadyReactionKit(PerkinElmer，CetusNorwalk,CT)直接测序。PCR引物用来作为测序引物，OS15，-GCCTCATTTTGTGGGTCACCATA-3，(nt1408-1430)[SEQIDNO:3J，TTA35'画AAATTCGCAGTCCCCAAA-3，(nt2128-2145)SEQIDNO:4，JM5，-TTGGGGTGGAGCCCTCAGGCT-3，(ntl676画1696)SEQIDNO:5，TTA45，-GAAAATTGGTAACAGCGG誦3，(nt2615-2632)[SEQIDNO:6，OS25，-TCTCTGACATACTTTCCAAT3'(nt2798-2817)SEQIDNO:7，测定PCR产物的内部区域的序列。实施例5朋F"A^4、#患者A:到第199天通过测序检测到抗LMV的rtL180M和rtM204V突变(表3)。在恩替卡韦和LMV治疗的双盲阶段，rtV173L突变也被检测到。在B结构域一个独特突变rtll69T与其它两个在B结构域的rtL180M和rtM173L突变以及C结构域的rtM204突变一起被检测到。许多其它独特的变化也在聚合酶中和重叠的包膜基因中被检测到(表4，图4，5和6)。这些独特的改变和来自七个基因型A-G的每一个参照序列以及来自治疗前样本的共有序列比较以确定独特的改变。患者B:在ETV治疗的第532天样本被测序并且和ETV治疗前的样本比较(图8，9和10)。在该样本中检测到几个聚合酶突变，包括rtA21S、rtA38E、rtY54H、rtN76D、rtL911、rtF122L、rtY124H、rtT128N、rtQ130P、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtH248N、rtY252L。在ETV治疗的开始，患者已经在使用LMV治疗并且已经检测到rtL80M和M204V突变(图8，9和10)。LMV突变(rtL180M和rtM204V)甚至在没有LMV选择压力下在ETV治疗期间被检测到，并且这些突变也可以起到抗ETV的作用。在ETV的病毒爆发时期，LMV选择A-G的突变以及上面列出的突变仍然存在。所有列出的突变和来自七个基因型的每一个参照序列以及来自治疗前的样本的共有序列比较以确定独特的改变。患者B是HBeAg阴性并且从这个患者分离的HBV在前核心基因编码G1896A突变，导致在前核心蛋白precoreW28Stop中的终止密码子。包括前核心的G1896A突变在内的基因组中其它区域的突变和聚合酶基因内的突变一起影响HBV复制适合性和对抗病毒药物的敏感性。实施例6,感參古一戎^^滲,/^^f使用重组HBV/杆状病毒对HBV突变体的恩替卡韦的敏感性/抗性性质进行检测。分析抗性性质的方法在下面实施例7-14中概述。实施例7Sf21昆虫细胞在进一步添加10%v/v热失活胎牛血清(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)的补充Grace，s昆虫培养基中在28。C的湿润的C02培养箱中培养。HepG2细胞在补充10%热失活胎牛血清的最低必需培养基(MEM-FBS)中培养。HepG2细胞在湿润的37。C的5%V/VC02的培养箱中生长。实施例8^才挣7f爽义#兄8F/并W病辜脊移我琳^斧/务用于抗病毒检验的重组HBV/杆状病毒系统以前已经被描述(Delaney等，/4w"OTto6C^附C/t"^5W:1705-1013,2001)。简要地，通过切下包含1.3xHBV基因组构建体的片段并且克隆到杆状病毒载体pBlueBac4.5(Invitrogen，Carlsbad，CA)的多克隆区以产生重组转移载体。根据生产商的说明书(QuikChange,Stratagene)使用商品试剂盒通过定点突变法产生点突变。编码逆转录酶突变rtll69T+rtV173L+rtL180M+rtM204V的HBV重组体。根据生产商的说明书(PerkinElmer,CetusNorwalk，CT)使用ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit通过效，J序对质净立的核苷酸序列和由定点突变法产生的点突变进行确证。实施例9逸含7.ja丑F种建#炎病毒^y4^使用购自Invitrogen(Cadsbad，CA)的BacNBlue转染试剂盒将纯化的重组转移载体和线性的AcMNPV杆状病毒DNA共转染到Sf21细胞中；根据生产商的指南通过噬斑试验分离重组病毒。通过感染100-mm培养亚中的Sf21细胞，一系列的重组病毒从分离的噬菌斑中得到扩增。使用标准方法，从扩增的病毒中提取病毒DNA。用限制性酶消化纯化的病毒DNA，然后通过1%v/v琼脂糖凝胶电泳分离。进行Souhtern印迹以确定含有完整的1.3HBV构建体的病毒分离林。用BoehringerMannheinRandomPrimeDNALabeling试剂盒(Indianapolis,IN)来产生[P"I放射性同位素标记的探针。全长的双链HBV基因组被用来作为所有的放射性同位素标记探针的模板。使用有义引物5，-GCCTCATTTTGTGGGTCACCATA-3，SEQIDNO:3，(核苷酸1408-1430，根据HBVGenebank检索号M38454)和反义引物5，誦TCTCTGACATACTTTCCAAT隱3，SEQIDNO:6(核苷酸2817-2798,根据HBVGenebank检索号M38454)对聚合酶的催化区进行PCR扩增以确证病毒DNA序列。下面的引物用来测定内部区的序列5，-TGCACGATTCCTGCTCAA-3，[SEQIDNO:8](核苷酸2345-2362，根据HBVGenebank检索号M38454)和5，-TTTCTCAAAGGTGGAGACAG-3，SEQIDNO:9j(核苷酸1790-1810，根据HBVGenebank检索号M38454)。实施例10辨务型^f炎^善W^，和趟必以0.5pfu/细胞感染强度(moi)感染对数期的Sf21细胞悬浮培养物来扩增杆状病毒。使感染进行到培养瓶中大多数细胞细胞表现可见的感染特征(4-5天)。通过在80，000xg离心使病毒颗粒从感染的Sf21培养基中沉淀下来，并且通过20-60%w/v蔗糖梯度纯化。纯化的病毒通过终点稀释在Sf21细胞中以四重形式滴定。每个高滴度储液的一份用于DNA提取。聚合酶基因被扩增和测序来确证实施例9中的定点突变的存在。实施例11^^t这许次病毒的,iff好B「感染好印02勿應HepG2细胞在大约20-40%的汇合度时接种，并且在感染前生长16-24小时。在感染的当天，三个平板中细胞被胰酶消化，使用台盼蓝排除用血球计确定活细胞数。计算平均细胞计数并且用来确定在所示的moi下感染细胞所必须的高滴度病毒储液的体积。使用无血清MEM洗涤HepG2细胞一次以除去孩t量血清。4吏用体积为1.0，0.5，和0.25ml分别感染100-mm，60-mm和35-mm培养皿，杆状病毒被稀释到无血清MEM中以获得适当的moi。杆状病毒在37。C被吸附到HepG2细胞1小时，每15分钟温和摇动以保证接种物均匀地分布。然后吸出接种物并且用磷酸盐緩沖液洗涤HepG2细胞两次，重新给予具有或不具有不同浓度药物的MEM-FBS。实施例12为V义的if5F拔j辨为、浙使用购自Abbott实验室(AbbottPark,IL，USA)的试剂盒通过放射免疫分析和微粒酶免疫分析进行乙型肝炎e抗原(HbeAg)的检测。收集H印G2细胞培养液，在6,000g下离心以除去细胞碎片，转移到干净的试管中，并且储存在20。C直到分析。HBeAg值表示为阳性对照的倍数。培养基样品适当稀释使得放射免疫分析结果低于HBeAg阳性对照值。实施例13勿^^复浙*辨Z參种發辦从在0.5%w/vNP-40中裂解的HepG2细胞的细胞质组分中分离HBV核心颗粒。细胞质提取物调整到10mmo1/1McC12，通过和500g/ml蛋白酶K37。C孵育1.5小时除去未保护DNA。然后使用商品DNA提取试剂盒(例如Qiagen(DNAextraction))或依次4吏用苯酚和氯仿抽提的自制方法提取样品中的HBVDNA,并且通过乙醇沉淀回收核酸。核酸重悬于50TE(10mmo1/1Tris，1mmo1/1乙二胺四乙酸)，通过OD260标准化，用100g/mlRNA酶(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)37。C消化1小时，然后使用实时PCR或电泳和Southern印迹分析。在Southern印迹分析后，使用BioRadGS-670光密度计和分子分析专家软件(BioRad,HeculesCalifornia)来分析Southern印迹合适的膝光。使用来自JandelScientific的TableCurve2D软件包使光密度测定数据拟合对数剂量反应曲线。对数剂量反应方程式用来计算变异的ICs。和IC9。值和变异的相关系数。实施例14对于基于实时PCR的HBV检验，根据生产商的指南(QIAGENGmbH，Hildens，德国)使用QIAampDNA微量试剂盒从200/il血清中提取HBVDNA。引物和分子标志i殳计在HBV基因组的前核心区内的保守核酸序列以扩增和检测216核苷酸产物(图1)。扩增在50-^1的反应混合物中进行，反应混合物包含1.0Taqman緩冲液A(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)，3.0mM氯化镁，0.4pmol/pl的每种引物，正向引物，PC1(5，GGGAGGAGATTAGGTTAA3，SEQIDNO:10和反向引物，PC2(5，GGCAAAAACGAGAGTAACTC3，SEQIDNO:11I，0.4pmol//tl的HBV特异的分子标志，C5,FAM誦CGCGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGACGCG-DABCYL-3，[SEQIDNO:12;此处FAM代表荧光团6-羧基荧光素和DABCYL，4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸，一种淬灭荧光团)和1.25U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶(Perkin-Elmer)。应用ABIPRISM7700荧光分光光度热循环仪(AppliedBiosysterms)进行PCR。PCR程序由起始循环(95t:，10分钟)和随后的45个扩增循环(94。C，15秒，50°C，30秒，72°C，30秒)组成的。机器检测并且记录下在退火阶段每个反应管中的荧光光镨。通过连接1.3kB的野生型HBV质粒(基因型D)到pBlueBac质粒栽体(HersheyMedicalCenter,Hershey，PA)建立外部标准。质粒的DNA浓度的定量通过分光光度测定法确定。从108拷贝/1111-100拷贝/ml的连续10倍稀释两份相同的质粒包括在每一轮中以建立标准曲线。每个实验反应的拷贝数通过获得的阈循环数(CT)内推确定。实施例15五7T浴#ETV重悬在无菌水中，分装并且在-20。C冷冻以避免药物的反复冻溶。包含ETV的培养基每天使用新鲜的3TC分装按照需要制备。在病毒感染后ETV治疗起始的实验中，用HBV杆状病毒感染后立即使HepG2细胞接触所示浓度的ETV。在使用ETV预治疗的实验中，在HBV杆状病毒感染前，给予细胞包含有ETV的培养基16小时，HBV杆状病毒感染也在包含ETV的培养基中进行，并且在感染和洗涤过程完成后立即重新给予细胞包含ETV的培养基。实施例16炎y^野^型^弄薦4W/L6Pr+Wv/ZZ+WZ7(^M+WMWF#好5K/并炎^毒迷存^抗应用相对于生长在无ETV(OETV)的野生型病毒定量实时PCR结果，ETV对野生型和四重突变的HBV的剂量效应的图形分析在图1中表示。正如在所有的ETV检测浓度的定量.PCR检测的HBV复制的中间产物的降低所证明的，ETV对野生型HBV复制具有最明显的效应。相反地，编码四重突变(rtlL69T+rtV173L+rtL180M+rtM204V)重组HBV尤其在ETV浓度达到0.5pM时对ETV具有降低的灵敏度。实施例17ETV(以前是BMS-200475或SQ-34676)是HBV复制的有力的抑制剂。ETV是具有生物可口服特性的具有抗嗜肝DNA病毒和疱渗病毒活性的环戊基脱盐鸟苷类似物。ETV的结构在图3中所示并且它的合成由Bisacchi等(所^/^.CAe附.丄&.7:127画132，1997)描述。临床前研究表明在基于酶和细胞的检验中(Innaimo等，1997,s"/;m;Siefer等，1998，Yamanaka等,1999，)恩替卡韦是非常有力的HBV的抑制剂。ETV以前描述为BMS-200475和SQ-34676,对于本领域技术人员可以理解此处描述的发明适于除了对特异描述的那些以外的变异或改变。应该理解本发明包括所有这种变异或改变。本发明也包括所有在本说明书中提及的或所示的步骤、特性、组合物和化合物，单独地或共同地，以及任何两个或多个所述的步骤或特性的任何或所有的组合。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>1.ND-未检测到2.研究的双盲阶段3.研究的开放标记阶段4.根据Stuyver等，2001，s"/wa命名表4使用ETV和LMV治疗的患者A的HBV突变的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>参考文献:Alleni/印ato/ogy27「<5人1670-1677，1998;Ayee/a/.，/〃，to/.11148-53，1997;BartholomeuszeM/.,/wterv/油gy僻5母337-3421997;Bisacchie"/.(2/oo^.Ma/.Oem.7,127-132,1997;BoydWa/"颠/Wra/C7ie;nCAemo紐.32.358-363，1987;Colo皿oeM/"JZD1236-452001;Das&a/.,乂75(76>人4771-4779，2001;DelaneyWa/"Aft'"!/cTO6CAe"滅e"柳；1705-1013，2001;Dienstage"/"AW五"gWJ編m'1657-1661,1995;Gaillarde《《CAewofAer.1005-1013,2002;GenovesiJn">n/cra6/o/々e,"C/!em3209-3217，1998;HendricksDA，"a/.,爿m/C"n尸w/w/537-46,1995;InnaimoWa/.,v4M">m'cro6/o/々e71rCAe/H1441-1448，1997;Kruger&219A,1994;Maina/.,乂F!>a/i7e;w"r!;y3:211-215,1996;Nordera/.,J!G饥PW.7*341-1348，1993;RenandNassal，Fliro/.75(3,'1104-1116,2001;Severini"a/"4Mri,m'cra6!'a/々e&C/iemofW39.'1430-1435，1995;Siefer"a/.,乂rari附!cro&'o/爿gen/C/zem2<5:3200-3208,1998;Stuyver"a/.,//"epa油gyJJ:751-757，2001;SummersandMason,Ce//403-415,1982;VereHodge，颠/v/ra/C/聽C7zewo紐《.67-84,1993;Xiong"aZ"2卿1669-73，1998;Yamanakaa/.,j,"z>m'CTO&'o/CAem43:190-193，1999.<120><130><140><141><150><151><150><151><160><170><210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>序列表MelbourneHealth(allstatesexceptUS)AustinandRepatriationMedicalCentre(allstatesexceptUS)SouthernHealth(allstatesexceptUS)Bartholomeusz,Angeline(USonly)rjocarnini,Stephen(USonly)Ayres,Anna(USonly)Angus,Peter(USonly)Sievert,William(USonly)对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用2609536/EJHNotyetavailable2003-02-07AUPS03702002-02-07AUPS12692002-03-2136Patentlnversion3.176PRTMISC一特征(2).:(2)X=Ij或R或IMISC—特征(3).:(3)X=E或DMISC一特征(9).:(9)X=T或D或A或N或YMISC一特征(10):(10)X=E或D<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><:222><223>MISC一特征(13):.(13)X=E或K或QMISC—特征(15)..(15)X=H或R或NMISC—特征(18):(18)X=I或TMISC—特征(23):.(23)X=A或SMISC—特征(26):.(26)X=T或RMISC一特征(40):.(40)X=A或T或SMISC一特征(43):.(43)X=R或TMISC一特征(45)..(45)X=V或GMISC—特征(55):(55)X=S或I或T或N或V:220::221::222::223:MISC—特征<56):.(56)X=T或S或H或Y<220:<221:<222:<223:MISC—特征(57):.(57)X=R或H或K或Q<220:<221:<222:<223:MISC—特征(69):.(69)X=Q或P<220:<221:<222:<223:变体(76)..(76)S指定为氨基酸74<400>1LeuXaaXaaAspTrpGlyProCysXaaXaaHisGlyXaaHisXaalie151015ArgXaaProArgThrProXaaArgValXaaGlyGlyValPheLeuVal202530AspLysAsnProHisAsnThrXaaGluSerXaaLeuXaaValAspPhe354045SerGinPheSerArgGlyXaaXaaXaaValSerTrpProLysPheAla505560ValProAsnLeuXaaSerLeuThrAsnLeuLeuSer657075<210:<211:<212:<213:2181PRT合成<220><221>变体<222>(1).-(1)<223>S=氨基酸75<220><221>MISC—特征<222>(2)..(2)<223>X=N或D<220><221>misc—特征<222>(17)..(17)<223>x=i或p<220><221>MISC—特征<222>(29):.(29)<223>x=i或v<220><221>misc—特征<222><35)二(35)<223>X=s或d<220><221>misc一特征<222>(44):.(44)<223>X=T或N<220><221>misc—特征<222>(46):.(46)<223>x=R或N<220><221>misc—特征<222>(47):.(47)<223>X=N或I<220><221>MISC一特征<222>(48):.(48)<223>x=任何氨基酸<220><221>misc一特征<222>(50)..(50〉<223>x=N或Y或H60<220<221<222<223<220<221<222<223<220<221<222<223<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>MISC一特征(52):.(52)X=H或YMISC—特征(53):.(53)X=G或RMISC—特征(54):.(56)Xs任何氨基酸MISC—特征(57):(57)X=D或NMISC—特征(60)7.(60)X=D或NMISC—特征(61):.(61)X=S或YMISC—特征(65):.(65)X=N或QMISC一特征(71):.(71)X=Ii或MMISC—特征(75):.(75)X=K或Q<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><:222><223>MISC—特征(77):.(77)X=Y或FMISC一特征(79)..(79)X=R或WM工SC—特征(84厂.(84)X=Y或LMISC—特征(85厂.(85)X=S或AMI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eLieuLieuValLeu202530LeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeu工leProGlySer354045SerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThrThrAlaGin505560GlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAspGly65707580AsnCysThrCyslieProlieProSerSerTrpAlaPheGlyLysPhe859095LeuTrpXaaTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeuVal100105110ProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeuSer115120125ValMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerThrLeu130135140SerProPheI^euProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpValTyr84145lie<210:<211:<212:<213:<220:<221:<222:<223-15015516030305PRTTR6的HBsAgTransmisc—特征(168)-.(168)X=任何氨基酸<400>30SerThrAsnArgGinSerGlyArgGinProThrProLeuSerProPro1510ISLeuArgAspSerHisProGinAlaMetGinTrpAsnSerThrThrPhe202530HisGinThrIjeuGinAspProArgValArgGlylieuTyrLeuProAla354045GlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrAlaSer505560Pro工leSerSerliePheSerArglieGlyAspLeuAlaLeuAsnMet65707580GluAsn工leThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLieuValLeuGinAla859095GlyPhePheLeuLeuThrArglieLeuThrlieProGinSerLeuAsp100105110SerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThxThrValCysLeu11512012SGlyGinAsnSerGinSerProThrSerAsngisSerProThrSerCys130135140ProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLieuArgArgPhelie145150155160liePheIjeuPhelieIjeuLeuXaaCysLeu工lePheLeuIjeuValLeu165170175LeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGlySer180185190SerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThrThrAlaGin195200205GlyThrSerMetTyrProSerCyscysCysThrLysProSerAspGly210215220AsncysThrCys工lePro工leProSerSerTrpAlaPheGlyL.ysL'eu225230235240LeuTrpAspTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerI*euLeuVal245250255ProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeuSer260265270ValMetTrpMetMetTrpTy:rTrpGlyProSerLeuTyrSerThrLeu275280285SerProPheLeuProLeuLeuPro工lePhePheCysLeuTrpValTyr290295300lie305<210><211><212><213>31945DNApreETV<400>31gccataaccttccaccaaactctgcaagmtccccctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgcctctcacatatcgtcaatcttctcgaggattggggac60120cctgcgctgaatatggagaacatcacatcaggattcctaggaccccttctcgtgttacag180gcggggtttttcttgttgacaagaatcctcagagtctagactcgtggtgg2403CttCtctC3attttctagggggaaccaccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccca3003CCtCC33tCctcctgtcctacgacttgacctggttatcgctggatgtgt360ctgcggcgttttatcatattcctcttcstcctgctgctatgcctcatcttcttgttggtt420cttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcCtC33CC3CC480agcacgggaacatgccgaacttgcacgactcctgctcaaggaacctctatgtatccctcc540tgttgctgtaccsaaccttcggacggaaattgcacctgtattcccatcccatcatcctgg600gctttcggaaaattcctatgggagtgggcctcagcccgtttctcatggctcagtttasta"0gtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagttatgtgg720atgatgtggtattgggggccaagtctgtacagcatcttgagtccctttttaccgctgtta780ccaattttcttttgtctctgggtatacatttgaaccctaaagatggggtt8403ctcccta3attttatgggctatgtcattggatgttatgggtccttgcca900tcgtacataaaatcaaagaatgttttagaaaacttcctgt945<210>32<211>1245<212>DNA<213>onETV<400>32tgcctcattttgtgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatggggcagaatc60tttccaccagcaatcctctgggattctttcccgaccaccsgttggatccagccttcagag120aaatccagattgggacttcaggacacctggccagacgcca180acaaggtaggagctggagcattcgggctgggtttcaccccaccgcacggaggccttttgg240ggtggagccctcaggctcsgggcatactacaaactttgccagcaaagccgcctcctgcct300ccaccastcgccagtcaggacggcagcctaccccgctgtctccacctttgagagacactc360atcctcaggcgcagtggaaaCCC3C33CCttccaccasactgtgcaagctccacctgctg420gtggctccagttccggaa^cagtaaaccctgttccgactactgcctctcacatatcgtcaa480tcttctcgaggattggggaccctgcgctgaatatggagaacatcacatcaggattcctag540gaccccttctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccga600agagtctagactggttatcggcctcatcttttccaggatcgaacctctatttcccatccctctcatggcttttggctttcgtccctttttctcgtggtgggcagtccccactggatgtgtcttgttggttCtC33CC3CCgtatccctccatcatcctggcagtttggtaatttatgtggaccgctgttaagatggggttacttctctcascctccaatcctgcggcgttcttctggactagcacgggaatgttgctgtagctttcggaagtgccatttgatgatgtggtccaattttctactccctaaa<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>33290preETVmisc—特征(9).:(9)X=任何氨基酸misc—特征(73):.(73)X=任何氨基酸misc—特征-(219)X=任何氨基酸attttctaggttatcatattatcaaggtatcatgccgaacCCa33CCttCaattcctatgttcagtggttattgggggcctttgtctctgttttatgggggggaaccaccgtgtgtcttg660ctcctgtcctccgacttgtc720cctcttcatcctgctgctat780gttgcccgtttgtcctctaa840ttgcacgactcctgctcaag900ggacggaaattgcacctgta960ggagtgggcctcagcccgtt1020cgtagggctttcccccactg1080aagtctgtacagcatcttga1140ggtatacatttgaaccctaa1200ctatg1245<400>33HisAsnLeuProProAsnSerAlaXaaSerPro1510CysTipTrpIjeuGin15PheArgAsnSerLysProCysSerAspTyrCysLeuSerHis工leVal202530AsnLeuLeuGluAspTrpGlyProCysAlaGluTyrGlyGluHisHis354045lieArglieProArgThrProSerArgValThrGlyGlyValPheLeu505560ValAspLysAsnProHisAsnThrXaaGluSerArgLeuValValAsp65707580PheSerGinPheSerArgGlyAsnHisArgValSerTrpProLysPhe859095AlaValProAsnLeuGinSerLeuThrAsnLeuLeuSerSerAspLeu100105110ThrTrpLeuSerLeuAspValSerAlaAlaPheTyrHislieProLeu115120125H土sProMaAlaMetProHisLeuLeuValGlySerSerGlyLeuSer130135140ArgTyrValAlaArgLeuSerSerAs.nSerArglieLeuAsnHisGin145150155160HisGlyAsnMetProAsnLeuHisAspSerCysSerArgAsnLeuTyr.165170175ValSerLeuLeuLeuLeuTyxGinThrPheGlyArgLysLeuHisLeu180185190TyrSerHisProlielieLeuGlyPheArgLyslieProMetGlyVal195200205GlyLeuSerProPheLeuMetAlaGinPheXaaSerAlalieCysSer210215220ValValArgArgAlaPheProHisCysLeuAlaPheSerTyrValAsp225230235240AspValValLeuGlyAlaLysSerValGinHisLeuGluSerLeuPhe245250255ThrAlaValThrAsnPheLeuLeuSerLeuGlylieHisLeuAsnPro260265270AsnLysThrLysArgTrpGlyTyrSerLeuAsnPheMetGlyTyrVal275280285lieGly290<210>34<211>251<212>PRT<213>onETV<400>34GluAspTrpGlyProCysAlaGluTyrGlyGluHisHis工leArg工le151015ProArgThrProSerArgValThrGlyGlyValPheLeuValAspLys202530AsnProHisAsnThrGluGluSerArgLeuValValAspPheSerGin354045PheSerArgGlyAsnHisArgValSerTrpProLysPheAlaValPro505560AsnLeuGinSerLeuThrAsnLeuLeuSerSerAspLeuSerTrpLeu65707580SerLeuAspValSerAlaAlaPheTyrHis工leProLeuHisProAla859095AlaMetProHisLeuLeuValGlySerSerGlyLeuSerArgTyrVal100105110AlaArgLeuSerSerAsnSerArglieLeuAsnHisGinHisGlyAsn115120125MetProAsnLeuHisAspSerCysSerArgAsnLeuTyrValSerLeu13013514090LeuLeuLeuTyrGinThrPheGlyArgLysLeuHisLeuTyrSerHis145150155160ProlielieLeuGlyPheArgLyslieProMetGlyValGlyL>euSer165170175ProPheLeuMetAlaGinPheGlySerAlalieCysSerValValArg180185190ArgAlaPheProHisCysLeuAlaPhe工leTyrValAspAspValVal135200205LeuGlyAlaLysSerValGinHisLeuGluSerLeuPheThrAlaVal210215220ThrAsnPheLeuLeuSerLeuGlylieHisLeuAsnProAsnLysThr225230235240LysArgTrpGlyTyrSerLeuAsnPheMetGly245250<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223>35110PRTpreETVmisc—特征(8).:(8)X=任何氨基酸misc—特征(72):.(72)X=任何氨基酸<400>35ThrPheHisGinThrLeuGinXaaProProAlaGlyGlySerSerSer151015GlyThrValAsnProValProThrThrAlaSerHislieSerSerlie202530PheSerArglieGlyAspProAlaLeuAsnMetGluAsn工leThrSer354045GlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuG、lnAlaGlyPhePheLeuLeu505560ThrArglieLeuThrlieProXaaSerLeuAspSerTrpTrpThrSer65707580LeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGinAsnSerGin859095SerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProThr100105110<210>36<211>226<212>PRT<213>postETV<400>36MetGluAsnlieThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGin151015AlaGlyPhePheLeuLeuThrArglieLeuThr工leProLysSerLeu202530AspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCys354045LeuGlyGinAsnSerGinSerProThrSerAsnHisSerProThrSer505560CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe65707580lie工lePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeu工lePheLeuLeuVal8S9095LeuLeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGly10010.511092Sei:SerThrThrSerThrGlyThrCysArgThrCysThrThrProAla115120125GinGlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAsp130135140GlyAsnCysThrCysliePro工leProSerSerTrpAlaPheGlyLys145150155160PheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuVal165170175ValProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeu180185190SerPheMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerlie195200205LeuSerProPheLeuProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpVal210215220Tyrlie22权利要求1.一种分离的HBV变体，其中所述的变体在编码DNA聚合酶的基因内包含核苷突变，导致对所述的DNA聚合酶至少一个氨基酸的添加、置换和/或缺失，并且其中所述的变体对ETV和/或LMV和任选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。2.权利要求1的分离的HBV变体，其中所述的变体对ETV表现下降的敏感性。3.权利要求1的分离的HBV变体，其中所述的变体对ETV和LMV均表现下降的敏感性。4.权利要求1-3的任一项的分离的HBV变体，其中所述的变体对特异于HBsAg的免疫试剂表现降低的相互作用。5.权利要求1的分离的HBV变体，其中所述的变体在HBVDNA聚合酶的F结构域中包含突变，因而使式I(SEQIDNO:l)所示的序列具有改变的氨基酸序列。式IL，B，B2，D，W,G,P，C，B3，B4,H,G,B5,H，B6,1,R,B7,P,R，T,P，B8,R，V，B9,G,G，V,F，L,V,D,K,N，P,H4N,T，B10,E，S，Bu，L，B12，V,D，F，S,Q,F,S,R,G，B13，B14,B15，V，S,W，P,K,F，A,V，P，N，L，B16,S，L,T，N，L,L,S*其中是L或R或I;B2是E或D;B3是T或D或A或N或Y;B4是E或D;B5是E或K或Q;B6是H或R或N;B7是I或T;B8是A或S;B9是T或R;B1()是A或T或S;Bu是R或T;B12是V或G;B13是S或I或T或N或V;B14是T或S或H或Y;B15是R或H或K或Q;B16是Q或P;并且其中S^旨定为氨基酸74。6.权利要求l的分离的HBV变体，其中所述的变体在A-E的任何一个结构域中包含突变，因而使式II(SEQIDNO:2)中所示的序列具有改变的氨基酸序列。式IISZiLSWLSLDVSAAFYHZzPLHPAAMPHLLZsGSSGLZ-RYVARLSSZ5^Z6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZuLHZl2Z13CSRZ14LYVSLZl5LLYZwTZt7GZ18KLHLZ19Z20HPIZ2!LGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z31FZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37H&8EZ39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46LLZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLN,GYZ50IG其中X是任意氨基酸；Zt是N或D;Z2是I或P;Z3是I或V;Z4是S或D;Zs是T或N;Ze是R或N;Z7是N或I;Zs是N或Y或H;Z9是H或Y;Zh)是G或R;Zu是D或N;Z^是D或N;Zu是S或Y;Z"是N或Q;Z^是L或M;Z"是K或Q;Zn是Y或F;Zw是R或W;Zw是Y或L;Zm是S或A;Z21是I或V;Zu是I或L;Zm是V或G;Zm是C或L;乙25是A或S;Zm是V或M;Zn是V或T;Z28是R或C;Z29是F或P;Zm是L或V;Z^是A或V;Zm是S或A;^33是Y或L或M;Zw是K或R;Zm是S或T;Z36是V或G;Z"是Q或E;Z38是L或S或R;Zm是S或F;Z4o是F或Y;Z41是T或A;Z42是A或S;Z"是V或I;Z44是T或Zk是N或S;Z"是F或V;Zp是S或D;Z"是L或V;Z49是N或Q;Zso是V或I;和M免是氨基酸204;并且其中第一个S指定为氨基酸75。7.权利要求5或6的分离的HBV变体，其中所述的变体进一步包含改变的HBsAg。8.权利要求5或6或7中的分离的HBV变体，其中所述的变体对特异于HBsAg的免疫试剂表现降低的相互作用。9.在编码HBsAg的核苷酸序列中包含突变的分离的HBV变体，该突变导致在所述的HBsAg中相应于SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的区域内氨基酸的添加、置换和/或缺失，并且其中所述的变体对ETV和/或LMV和任选的其它核苷类似物表现下降的敏感性。10.权利要求9中的分离的HBV变体，其中所述的变体对ETV表现下降的敏感性。11.权利要求9中的分离的HBV变体，其中所述的变体对ETV和LMV均表现下降的敏感性。12.权利要求9中的分离的HBV变体，其中特异于野生型HBsAg的抗体表现降低的中和所述HBV变体的能力，并且所述的HBV变体通过在联合或序贯治疗中使受试者暴露于ETV和LMV而筛选。13.权利要求1或9中的分离的HBV变体，在HBVDNA聚合酶中包含突变，所述突变选自间隔区L97I、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、r頻04V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的突变。14.权利要求1或9或13中分离的HBV变异体，包含的突变选自PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL群、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208T、PreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其组合或等同的突变。15.权利要求1或9或13中的分离的HBV变体，包含的突变选自sF161L、sE164D和sI195M或其组合或等同的突变。16.权利要求1或9或13中的分离的HBV变体，包含的突变选自rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021和rtM204V或其组合或等同的突变。17.用以确定HBV对ETV和/或LMV或4壬选的其它核普类似物表现下降的敏感性的潜力的方法，所述的方法包括从所述的HBV分离DNA或相应的mRNA，并且在编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个F和A-E的结构域中或最接近那里的区域中至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并且该突变和对ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相关，其中这种突变的存在是对所述的ETV和/或LMV可能存在抗性的指示。18.权利要求17的方法，其中筛选的突变选自间隔区L97I、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的突变。19.用以确定HBV林是否对核苷类似物表现下降的敏感性的方法，所述的方法包括从所述的HBV分离DNA或相应的itiRNA，并且在编码DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，其中在间隔区和rt区下面的突变间隔区L971、间隔区K115R、间隔区H116L、间隔区L128F、间隔区S137G、间隔区R139G、间隔区F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在对ETV和/或LMV和任选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。20.权利要求19的方法，其中筛选的突变选自rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021和rtM204V或其组合或等同的突变。21.用以确定HBV、株是否对核苷类似物表现下降的敏感性的方法，所述的方法包括从所述HBV分离DNA或相应的mRNA，并且在编码DNA聚合酶的核普酸序列中筛选突变，其中在rt区的B或C结构域中下面的突变rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或其组合或等同的一个或多个其它突变的存在对ETV和/或LMV和任选的其它核苷类似物具有下降的敏感性的变体的指示。22.用于检测对HBV表现抑制活性的药物的方法，所述HBV对ETV和/或LMV表现抗性或下降的敏感性，所述的方法包括产生一个基因构建体，该构建体包含包含于质粒栽体中的来自HBV的复制有效量的基因组，然后用所述的构建体转染所述的细胞；在转染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养所述细胞一段时间，所述条件为如果对所述的物质有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在所述药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或释放。23.用于检测对HBV表现抑制活性的药物的方法，所述HBV对ETV和/或LMV表现抗性或下降的敏感性，所述的方法包括产生一个基因构建体，该构建体包含来自所述HBV的复制有效量的基因组，其包含或融合于感染细胞有效量的杆状病毒基因组中，然后用所述的构建体感染所述的细胞；在感染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或释放。24.用于检测对HBV表现抑制活性的药物的方法，所述HBV对ETV和/或LMV表现抗性或下降的敏感性，所述的方法包括产生一个基因构建体，该构建体包含来自所述HBV的复制有效量的基因组，其包含于或融合于感染细胞有效量的杆状病毒基因组中，然后用所述的构建体感染所述的细胞；在感染前、期间和/或之后，用待检测的药物接触细胞；在一定条件下培养细胞一段时间，所述条件为如果对所述的药物有抗性则足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；并且对细胞、细胞裂解物或培养上清液应用病毒或病毒组分检测方法来确定在药物的存在下，病毒是否已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或释放。25.权利要求22或23或24的方法，其中HBV基因组稳定整合入细胞的基因组中。26.疫苗，包含权利要求l-16任一项中的HBV变体的抗原组分或其抗体。27.权利要求26的疫苗，其中抗原组分是HBsAg或PreSl或PreS2。28.权利要求26中的疫苗，其中抗原组分是缺陷型的HBV变体。29.权利要求26中的疫苗，包含针对HBsAg或PreSl或PreS2的抗体。30.用于评估病毒变体或包含病毒变体的生物样本的可能的有效性的计算机产品，以确定在受试者中合适的治疗方案，所述的产品包括(1)编码，作为输入Ivs接受用于至少两种和所述的病毒或包含该病毒的生物样本相关的特性，其中所述的特性选自(f)对特定的化合物或免疫试剂表现抗性或下降的敏感性的能力；(a)改变的来自野生型HBV的DNA聚合酶；(b)改变的来自野生型HBV的表面抗原；或(c)患者的发病和复原的潜力；(d)改变的复制能力(升高的或下降的)；(2)计算所述Ivs的和以提供相应于所述的病毒变异体或生物样本的Pv的总和的编码；和(3)储存编码的计算机可读介质。31.用于评估病毒变体或包含该病毒变体的生物样本在受试者中的可能的有效性的计算机，其中所述的计算机包括(1)机器可读数据存储介质，包括机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述的机器可读数据包括用于至少两种和所述病毒变体或生物样本相关的特性的Ivs，其中所述的特性选自(a)对特定的化合物或免疫试剂表现抗性或下降的敏感性的能力；(b)改变的来自野生型HBV的DNA聚合酶(c)改变的来自野生型HBV的表面抗原；或(d)患者的发病和复原的潜力；(e)改变的复制能力(升高的或下降的)；(2)用于存储指令的工作存储器，该指令用于处理所述的机器可读的数据；(3)结合到所述的工作存储器和所述的机器可读数据存储介质的中心处理单元，用于处理所述的机器可读数据以提供相应于所述化合物Pv的所述Ivs的总和；并且(4)结合到所述的中心处理单元的输出硬件，用于接收所述的Pv。32.药物的组合物，包括能够直接或间接抑制在权利要求1-16的任何一个中定义的HBV变体的药物，所述的组合物进一步包括一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。33.权利要求32的组合物，其中的药物是来自所述的HBV变体的重组蛋白。34.权利要求33的组合物，其中的重组蛋白是HBsAg或PreSl或PreS2。35.权利要求32的组合物，其中的药物能够抑制HBV变体聚合酵。36.权利要求35的组合物，其中的药物是通过自然产物筛选或合理的药物设计鉴定的。37.权利要求32的组合物，其中的药物是缺陷型的HBV变体。38.权利要求32的组合物，其中药物是针对HBV复合物的抗体。39.权利要求32的組合物，其中药物是相对于HBV基因的核酶、反义分子或有义分子。全文摘要本发明涉及对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用。更具体地，本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)变体，该变体对核苷类似物表现完全或部分的抗性和/或与针对病毒表面组分的抗体降低的相互作用，包括对这些抗体的下降的敏感性。本发明进一步涉及用于检测这种病毒变体的测定，该测定在监控抗病毒治疗方案和开发新的或改进的针对病毒尤其是HBV变体的疫苗上是有用的。本发明也涉及应用病毒变体来筛选能够抑制病毒感染、复制和/或释放的药物。文档编号C12Q1/02GK101555468SQ20091013683公开日2009年10月14日申请日期2003年2月5日优先权日2002年2月7日发明者A·I·巴尔托罗姆斯,A·艾利斯,P·W·安格斯,S·A·落卡里尼,W·西维尔特申请人:墨尔本保健公司;奥斯丁保健公司;南方保健公司