专利名称：核苷类似物胆固醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学和生物医药领域，特别涉及一种核苷类似物胆固醇衍生物，由该化合物可以制备高度分散的传递系统，包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、微乳和自组装传递系统。
背景技术：
核苷(Nucleosides)是生物体内的重要化学成分，由它衍生得到的核苷酸以及核酸是遗传信息的携带者。最重要的遗传物质DNA和RNA就是由核苷酸组装而成。核苷和核苷酸也参与生物体内许多重要的反应。自然界中的核苷由一个嘌呤或嘧啶碱基与一个五碳糖结合而成。碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，五碳糖为核糖和脱氧核糖，并由它们分别组成腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷，以及脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷。
核苷类似物(Nucleoside analogues，Nu)是一类重要的化学物质。它的结构特征与核苷类似。人们已经合成了多种核苷类似物，发现其中有许多具有药理活性，例如抗病毒作用、细胞毒作用、免疫抑制作用等。目前对核苷类似物活性的考查主要集中在抗病毒和抗癌方面。抗病毒的核苷类似物在体内经过病毒和人体细胞的激酶磷酸化作用后形成磷酸化核苷类似物，后者可通过各种途径抑制病毒。根据不同作用功能部位，它们可以分为DNA聚合酶抑制剂、DNA还原酶抑制剂、胸苷激酶抑制剂、RNA酶抑制剂、逆转录酶抑制剂等，临床上用于治疗疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘病毒、流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、艾滋病毒(HIV)、脑炎病毒等感染。因为病毒的复制在细胞内完成，所以大多数抑制病毒复制增值过程的抗病毒药物需要进入细胞内才能发挥抗病毒作用。核苷类似物的水溶性一般较强，使得细胞内的核苷类物质不易渗出，这是由细胞维持生命本能决定的。同时外界的核苷类似物也较难进入细胞内部，即许多核苷类似物的细胞膜渗透性不好。因此许多核苷类似物药物口服生物利用度差，细胞内浓度小，影响了抗病毒作用的发挥，并且药物长期在细胞内保持低浓度还有可能使病毒产生耐药性(杨道锋，等.抗病毒核苷类似物简介.医药导报，2001，20(2)122；李子成，等.核苷类抗病毒药物的研究进展.化学研究与应用，2002，14(1)15)。艾滋病毒(HIV)在感染人体的初期，就往往已经进入淋巴系统和脑中，并进一步感染其它部位。而核苷类似物通常为水溶性，进入淋巴和脑都较困难，这也是艾滋病难治的原因之一(Yazdanlan M，et al.Blood-brain barrier properties of humanimmunodeficiency virus antiretrovirals.J Pharm Sci，1999，88950)。抗癌的核苷类似物一般是一种抗代谢物，通过抑制核酸的合成发挥细胞毒作用(Galmarini，et al.Nucleoside analogues and nucleobase in cancer treatment.Lancet，2002，3415)。同样它们也需要进入细胞内才能发挥作用。因此抗癌核苷类似物也存在生物利用度较低、穿越细胞膜和血脑屏障较难等问题。
人们设计了很多方法来解决核苷类似物的生物利用度和细胞摄取问题，例如合成前药和设计特殊的药物传递系统，其中脂溶性前药和脂质体给药系统比较引人注目。
药物的生物膜渗透性除了和生物膜本身性质及药物分子量有关外，药物的物理化学性质是主要影响因素。一般认为，适当增加药物的脂溶性可以增强生物膜渗透性。人们已经尝试合成核苷类似物脂溶性前药的方法来增加其生物利用度和细胞摄取。因为核苷类似物通常在非芳香环的脂肪链或环上连有羟基或氨基，人们往往利用这些羟基或氨基与脂肪链基团相连而获得脂溶性前药。许多研究证明脂溶性增强的核苷类似物的生物利用度和细胞摄取增加，在淋巴系统和脑中的浓度一般也会提高。这些前药可以在细胞内经过水解酶或磷脂酶的作用释放出原药而发挥抗病毒或抗癌作用(Yatvin MB，et al.Improved uptake and retention of lipophilic prodrug to improve treatment of HIV.Adv Drug Del Rev，1999，39165；Tan X，et al.Development and optimization ofanti-HIV nucleoside analogs and prodrugsa review of their cellular pharmacology，structure-activity relationships and pharmacokinetics.Adv Drug Del Rev，1999，39117；Wiebe LI，et al.Concepts for the design of anti-HIV nucleoside prodrugsfor treating cephalic HIV infection.Adv Drug Del Rev，1999，3963；Hostetler KY，et al. Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs ofazidothymidine and other antiviral nucleosides.J Biol Chem，1990，2656112)。
这些研究较多采用磷脂类似物的磷脂酰基(WO9413324)与核苷类似物的羟基相连。虽然增加了核苷类似物的脂溶性，前药水解后可以得到单磷酸化物，但磷脂类似物(主要是磷脂酸)不易得，反应较复杂。另外脂溶性较强的药物给药有一定困难。因为脂溶性药物不溶或难溶于水，使其一般制剂，如片剂和注射剂无法解决其在水溶液中的分散和溶解问题。药物一般需要以分子或高度分散状态的分子聚集体形式才能吸收和进入细胞。人体内的环境是水溶液形式，生物膜呈脂溶性，药物或药物传递系统需要在体内可以传输，并且多次穿越生物膜，才能达到细胞等作用靶部位。如果不溶性的脂溶性药物无法溶解或高度分散，那就无法有效地传递药物。
脂质体(Liposomes)是一种由磷脂双分子层构成的泡囊(Vesicles)，是一种可以在水溶液中高度分散的传递系统，可以作为很多种药物的载体。它的高度分散性使其在体内具有靶向、缓释等效果，口服具有淋巴趋向性，较易携带药物穿越血脑屏障，容易通过融合、内吞等途径进入细胞内(Lasic DDand Papahadjopoulos D.Liposomes revisited.Science，1995，2671275)。修饰后的磷脂组成的脂质体还可以有体内长循环、温度靶向、pH靶向、磁靶向、主动靶向等功能。脂质体的局部(眼、鼻、皮肤)给药有生物相容性好、促进药物渗透的作用。脂质体还是生物化学和分子生物学研究领域中经常使用的一种转染试剂，现在还是基因治疗的一种重要载体(Kikuchi H，et al.Genedelivery using liposome technology.J Control Release，1999，62269)。
脂质体泡囊的磷脂双分子层膜将内部包裹的水相和外部水相隔开，双分子层内呈疏水性。药物根据其物理化学性质的不同分别包裹在内水相或膜中。一般地，水溶性药物在内水相中；脂溶性药物在膜层中。脂质体的制备是磷脂分子在水中自组装的过程，内外水相的体积比例不能很大。这些因素决定了大部分水溶性药物的包裹率较低(＜50％)，有时还会很低(5％)，并且包裹的药物有渗漏到外水相的可能。如果有合适的脂溶性基团(如脂肪链)，脂溶性药物分子就可插入到磷脂双分子层中，结合比较牢固，药物分子不容易脱掉，所以药物的包裹率较高。因此为了增加某些水溶性药物在脂质体中的包裹率，人们往往采用了制备成带有长脂肪链的脂溶性前体药物的方式(Gulati M，et al.Lipophilic drug derivatives in liposomes.Int J Pharm，1998，165129)。
目前合成的核苷类似物水溶性普遍较强，脂溶性较差，有的药物甚至水溶性和脂溶性都不好。因此它们的脂质体包裹率较低，往往无法达到给药浓度。如果在制备得到核苷类似物脂溶性前药的基础上，再制备成脂质体，可以增加包裹率，也同时具有了脂质体水溶液中高度分散性和脂溶性前药易渗透进入细胞的特点(Tong P，et al.Preparation and in viro antiviral activity ofliposomes of lipophilic esters of acyclovir.药学学报，1991，2715)。
非离子表面活性剂泡囊(Niosomes)是指某些非离子表面活性剂(如司盘60)在一定条件下在水中自组装成泡囊结构，类似脂质体。它同样可以作为药物载体，具有类似脂质体的一些体内外特征。纳米粒(Nanoparticles)一般指是纳米级分散的固体粒子，由于其高度分散性，它作为药物载体有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。固体脂质纳米粒(SLN)采用人体相容的脂质材料作为主要辅料形成纳米粒，具有普通纳米粒的特点和生物相容性好的特点，近年来研究较多。微乳(Microemulsions)是指粒径在100纳米以下的乳滴组成的体系，可以将脂溶性药物包裹在乳滴中。由于其高度分散性，它作为药物载体同样有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。
综上所述，将核苷类似物制备成脂溶性前药，并进一步制备成脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、微乳等水溶液中高度分散的制剂，有利于发挥药效。
发明内容
本发明人发明了一种核苷类似物胆固醇衍生物，其特征在于核苷类似物和胆固醇分子通过连接基连接，并且本发明人出乎意料地发现由上述核苷类似物胆固醇衍生物可以方便地制备得到高度分散的传递系统。根据前面所述，具有高度分散状态并且脂溶性较强的药物容易在体内进行传递，并且生物膜渗透性好，具有靶向性。本发明因此首次设计并制备了具备上述功能的核苷类似物胆固醇衍生物，并制备了其高度分散的传递系统。
本发明涉及的胆固醇(Cholesterol，Ch)分子可以来源于提取和合成途径。
胆固醇分子中含有一个游离的羟基，需要一个连接基(Linker，L)才能与核苷类似物中的活泼基团如羟基结合，一般采用适当的某种反应将胆固醇、连接基分子、核苷类似物三者结合，得到核苷类似物胆固醇衍生物。一般情况下，可以先将连接基与核苷类似物结合，再与胆固醇结合，当然也可以将顺序颠倒。本发明中的连接基是一种脂肪链连接基，其碳数在2～7之间，它的原型分子优选自2～7个碳数的双羧基脂肪酸，如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、2-甲基-2-丁烯二酸、甲基丁二酸、羟基丁二酸、草乙酸(氧化琥珀酸)、酒石酸、天冬氨酸、谷氨酸、戊二酸、己二酸、2，2-二甲基戊二酸、庚二酸，更优选的是碳数为4的双羧基脂肪酸，如琥珀酸、马来酸、富马酸。
本发明中所述的用于制备核苷类似物胆固醇衍生物的核苷类似物原型分子，在分子结构特征方面一般含有活泼基团，如游离的羟基或氨基，优选的是核苷类似物分子中的非芳香环的脂肪链(或环)上有一个以上的羟基，更优选的是非芳香环的脂肪链(或环)上有一个羟基。本发明所述的核苷类似物没有要求其具有特殊作用，但优选的是在作用方面具有药理活性的药物，更优选的是具有抗病毒或抗癌作用的药物。抗病毒的药物可以选自阿昔洛韦(ACV)、更昔洛韦(GCV)、泛昔洛韦(FCV)、喷昔洛韦(PCV)、万乃洛韦、病毒唑、索利夫定、利巴韦林、阿糖腺苷、齐多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)、去羟肌苷(ddI)、扎西他宾(ddC)、司他夫定(d4T)、阿糖腺苷、西多福韦，优选的是阿昔洛韦、更昔洛韦、泛昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷、扎西他宾、司他夫定，更优选的是阿昔洛韦、齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷、扎西他宾、司他夫定。抗癌的药物可以选自去氧氟尿苷、阿糖胞苷、阿扎胞苷。
本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物的合成步骤一般分为两个阶段。首先双羧基脂肪酸与胆固醇或与核苷类似物发生酰化反应得到脂肪酸单酯或单酰胺，然后再与另一个反应物反应，得到最终产物。在上述酰化反应中，可以采用酸酐与羟基或氨基酰化；或酰氯与羟基或氨基酰化的方式；或羧酸先形成活化的中间体，然后与羟基或氨基酰化；或由羧酸直接与羟基或氨基酰化。通过参考相关文献方法和利用一般专业技术就可以得到高纯度的核苷类似物胆固醇衍生物。
得到本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物后，还可以根据使用要求将其制备成碱盐或酸盐。成盐部位一般是在核苷基团上。碱盐可以选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐。酸盐中的酸可以选自马来酸、富马酸、琥珀酸、苯甲酸、苯磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、氨基酸、柠檬酸、酒石酸、硝酸、磷酸、盐酸、硫酸，优选的是乙酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苯甲酸。制备核苷类似物胆固醇衍生物的盐的方法一般可以先将核苷类似物胆固醇衍生物和相应的酸或碱分别溶于相同或不同的有机溶剂，再将它们的有机溶剂溶液按照它们分子摩尔相等或几乎相等的比例混合，经过适当处理，最后将混合溶液挥干，进行适当的纯化和分离，得到核苷类似物胆固醇衍生物的盐。
本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物或其盐带有脂溶性较强的胆固醇基团，可以将它们制备成脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、微乳等高度分散的制剂，后者可以以水性混悬液的形式存在并给药。这些含有核苷类似物胆固醇衍生物的高度分散传递系统的粒子直径一般小于1微米，优选的是小于0.5微米，更优选的是小于0.2微米。制备方法可以参考相关文献方法和专业技术(New RRC ed.Liposomea practical approach.OxfordOxfordUniversity Press，1990；Uchegbu IF and Vyas SP.Non-ionic surfactant basedvesicles(niosomes)in drug delivery.Int J Pharm，1998，17233，Cavalli R，et al.Sterilization and freeze-drying of drug-free and drug-loaded solid lipidnanoparticles.Int J Pharm，1997，14847；陆彬，张正全.用三角相图法研究药用微乳的形成条件.药学学报，2001，3658)。
一般地，如果采用薄膜分散法制备脂质体，可以将核苷类似物胆固醇衍生物与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，盛入烧瓶中，减压旋转蒸发，得到一层薄膜，然后加入水或适当缓冲液，进行振荡和超声，直至形成均匀的混悬液。如果超声时间延长，还可能得到纳米级分散系统。如果采用反相蒸发法制备脂质体，可以将核苷类似物胆固醇衍生物与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，加入水或缓冲液，高速搅拌或超声制备成乳剂，然后减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，然后加入水或适当缓冲液或不加，继续减压旋转蒸发，直至形成均匀的脂质体混悬液。脂质体混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到脂质体混悬液。运用同样的技术可以获得核苷类似物胆固醇衍生物的非离子表面活性剂泡囊。
纳米粒制剂中的固体脂质纳米粒较适合于本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物。一般地，将核苷类似物胆固醇衍生物与常温下为固态的脂质，如磷脂、脂肪酸、甘油酯，共同加热熔融，然后加入水或适当缓冲液，在加热情况下在高压乳匀机上循环乳化多次，形成纳米分散的乳滴，迅速冷却，使之固化，即得到核苷类似物胆固醇衍生物固体脂质纳米粒。用微乳法也可制得核苷类似物胆固醇衍生物固体脂质纳米粒。核苷类似物胆固醇衍生物纳米粒混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到纳米粒混悬液。
核苷类似物胆固醇衍生物微乳的制备可以参考常见的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相、水相。一般在选择合适的处方后，即可容易地形成微乳。如果选择合适的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相，还可以组成自微乳化系统，在加入适量水溶液后，系统可以自行分散成微乳。
除了上述可以方便地得到的核苷类似物胆固醇衍生物的高度分散的传递系统外，本发明人还出乎意料地发现由于本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物具有特殊的物理化学性质，特别是两亲性，由它自身或加入适量添加剂后在水溶液中可以自组装，形成高度分散的传递系统。核苷类似物胆固醇衍生物分子中含有脂溶性强的胆固醇基团和极性较大的核苷基团，因此具有两亲性，这种物理化学性质类似于磷脂和某些表面活性剂。如果两亲性分子的分子结构满足一定条件，由它本身可以在水中自组装成高度分散的有序聚集体，例如双分子层、双分子层弯曲得到的泡囊和双分子层叠加得到的长形纳米粒(Schreier S，et al.Surface active drugsself-association and interaction withmembranes and surfactants.Physicochemical and biological aspects.BiochimBiophys Acta，2000，1508210)。本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物具有较长的并且脂溶性较强的胆固醇基团和亲水性核苷基团，较容易形成双分子层，并进一步得到泡囊或长形纳米粒，不过某些条件下需加入一定量的添加剂。因此本发明首次设计并制备了由本发明中的核苷类似物胆固醇衍生物组成或加入适量添加剂的高度分散的自组装传递系统。
本发明中的由核苷类似物胆固醇衍生物组成的高度分散的自组装传递系统的制备方法和脂质体等高度分散系统的制备方法类似。通常是将核苷类似物胆固醇衍生物溶于某种有机溶剂，根据需要可以加入适当添加剂，然后进行分散。方法包括薄膜分散法、反相蒸发法、注入法、复乳法等。在某些情况下，添加剂不是必需的，此时传递系统全部由核苷类似物胆固醇衍生物组成。在某些情况下，单独用核苷类似物胆固醇衍生物不能形成很好的高度分散粒子，此时需要加入适当添加剂，帮助其形成有序结构。是否需要加入添加剂根据核苷类似物胆固醇衍生物的物理化学性质决定，一般可以通过预实验来推断。
本发明中的高度分散自组装传递系统中添加剂的量占全部组成成分的分子摩尔比例在0～50％之间，优选的是0～30％，更优选的是0～15％，其余成分即为核苷类似物胆固醇衍生物。添加剂可以选自磷脂、多元醇酯类表面活性剂、聚氧乙烯类表面活性剂、双十六烷基磷脂酸、胆固醇及其衍生物、硬脂胺。磷脂包括合成磷脂、半合成磷脂、天然磷脂。其中合成磷脂又包括修饰的磷脂如聚乙二醇衍生化的磷脂、连接单克隆抗体的磷脂。多元醇酯类表面活性剂优选的是失水山梨醇脂肪酸酯，具体如司盘60、司盘40、司盘20。聚氧乙烯类表面活性剂优选的是聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(也称泊洛沙姆)，聚山梨酯和聚氧乙烯脂肪醇醚，具体如泊洛沙姆P188、吐温80、吐温60、吐温40、吐温20、苄泽35。胆固醇及其衍生物包括胆固醇、胆固醇的脂肪酸酯、聚乙二醇衍生化的胆固醇。
高度分散的传递系统包括自组装传递系统，如果其组成或表面吸附有高度亲水的分子或分子片断，由于在体外环境或体内环境可以形成亲水性保护层，可以阻滞粒子间的聚合或在体内阻滞调理化作用而获得长循环效果(Barenholz Y.Liposome applicationproblems and prospects.Curr Opin ColloidInterface Sci，2001，666)。常用的亲水性分子或分子片断是聚乙二醇(PEG)。在本发明中，可以采用添加聚乙二醇衍生化的磷脂或聚乙二醇衍生化的胆固醇的方法制备得到表面亲水的核苷类似物胆固醇衍生物的高度分散的传递系统包括其自组装传递系统。
上述制备核苷类似物胆固醇衍生物的高度分散的传递系统的方法不经改变或经过稍微调整后，都可适用于核苷类似物胆固醇衍生物的盐。
具体实施例方式
实施例1.阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯的制备本品是琥珀酸分子两端分别与阿昔洛韦脂肪链羟基和胆固醇羟基酰化的产物，英文化学名Succinic acid 2-(2-amino-6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-ylmethoxy)-ethyl ester 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester，分子式C39H59N5O6，分子量693.93。首先合成琥珀酰阿昔洛韦(C12H15N5O6)，具体步骤如下。取阿昔洛韦(4.5g，0.02mol)、琥珀酸酐(10g，0.1mol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.244g，2mmol)，加入100ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，充入氮气，密闭，室温反应2天，反应物减压蒸发除去大部分溶剂，剩余液体倒入冰水中，得白色混悬液，再用1mol/L盐酸调节pH至2，抽滤，水洗涤，干燥，得到琥珀酰阿昔洛韦白色粉末6g。产物薄层层析显示一个斑点。熔点195-196℃。1H NMR显示，化学位移2.61(4H，OCCH2CH2CO)，3.75(2H，CH2OCO)，4.22(2H，OCH2)，5.40(2H，NCH2O)，6.86(3H，NH2，COOH)，7.76(1H，NCHN)，10.59(1H，OCNHC)。元素分析值C(44.22％)H(4.68％)N(21.69％)，与理论值C(44.31％)H(4.65％)N(21.53％)相近。
其它双羧基脂肪酰阿昔洛韦如马来酰阿昔洛韦、富马酰阿昔洛韦、戊二酰阿昔洛韦的合成步骤与琥珀酰阿昔洛韦相近。
取琥珀酰阿昔洛韦(16.25g，0.05mol)、二环己基碳二亚胺(DCC，11.33g，0.055mol)、胆固醇(58g，0.15mol)，加入500ml DMF和四氢呋喃(THF)混合溶剂(1∶1)，密闭，室温搅拌3天，过滤除去杂质，滤液减压蒸干，加入500ml氯仿溶解，顺序用NaCO3溶液、水洗涤，氯仿液用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸干溶剂，用异丙醇重结晶，晾干，得到阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯白色粉末25g。薄层层析显示一个斑点。熔点180-183℃。1H NMR(CDCl3)显示，化学位移0.85-1.90(40H，Cholesterol)，2.20(2H，CH2，Cholesterol-α-cycle)，2.63(4H，OCCH2CH2CO)，2.65(H，OCCH(CH2)2-Cholesterol)，5.35(H，CCHCH2，Cholesterol-β-cycle)，7.75(1H，NCHN)，10.65(1H，OCNHC)。元素分析值C(67.56％)H(8.52％)N(10.28％)，与理论值C(67.50％)H(8.57％)N(10.09％)相近。
其它不同连接基的阿昔洛韦胆固醇衍生物分子如阿昔洛韦胆固醇马来酸酯、阿昔洛韦胆固醇富马酸酯、阿昔洛韦胆固醇戊二酸酯的合成步骤与上面描述的阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯合成步骤相近。
实施例2.去羟肌苷胆固醇草酸酯的制备本品是草酸分子两端分别与去羟肌苷脂肪环侧链羟基和胆固醇羟基酰化的产物，化学名Oxalic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester 5-(6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-yl)-tetrahydro-furan-2-ylmethyl ester，分子式C39H56N4O6，分子量676.89。具体合成步骤如下取胆固醇(3.86g，10mmol)、草酰氯(5ml)加100ml二氯甲烷，室温搅拌5h，减压挥发大部分溶剂，加入去羟肌苷(1.18g，5mmol)和50ml DMF∶THF(1∶1，v/v)，密闭，室温搅拌10h，减压蒸发浓缩，剩余溶液搅拌下倒入饱和NaHCO3冰水溶液中，过滤，水洗至中性，滤渣经硅胶柱以氯仿∶甲醇(97∶3，v/v)洗脱得到粗产品，以甲醇重结晶得去羟肌苷胆固醇草酸酯白色粉末2.3g。薄层层析显示一个斑点。熔点157-160℃。1H NMR(CDCl3)显示，化学位移0.85-1.85(40H，Cholesterol)，2.20(2H，34-CH2)，2.30(2H，3-CH2)，4.00(H，23-CH)，4.34(H，5-CH)，4.29(2H，15-CH2)，5.37(H，36-CH)，7.97(H，CHN)，8.12(H，NCHN)，12.70(H，NH)。元素分析值C(69.06％)H(8.78％)N(8.91％)，与理论值C(69.20％)H(8.34％)N(8.28％)相近。
实施例3.去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯的制备本品是琥珀酸分子两端分别与去羟肌苷脂肪环侧链羟基和胆固醇羟基酰化的产物，化学名Succinic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester 5-(6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-yl)-tetrahydro-furan-2-ylmethyl ester，分子式C41H60N4O6，分子量704.9。首先合成中间体胆固醇半琥珀酸酯，再与去羟肌苷(ddI)酰化得到目标产物。具体合成步骤如下取胆固醇(3.86g，10mmol)、琥珀酸酐(3g，30mmol)、DMAP(0.122g，1mmol)加100ml二氯甲烷，55℃搅拌3天，减压蒸干溶剂得类白色固体，加乙醇25ml加热至溶解，搅拌下倒入15％NaCl冰水溶液中，以1mol/L盐酸调节pH至2.0，过滤，用水洗涤，滤渣以无水乙醇∶乙酸乙酯(10∶1)重结晶，即得到纯的胆固醇半琥珀酸酯白色粉末约4.8g。取去羟肌苷(1.18g，5mmol)、胆固醇半琥珀酸酯(4.86g，10mmol)、DCC(1.236g，6mmol)、DMAP(610mg，5mmol)加入50ml DMF∶THF(1∶1)，密闭，50℃搅拌2天，减压蒸发浓缩，剩余溶液搅拌下倒入饱和NaHCO3冰水溶液中，过滤，水洗至中性，滤渣经硅胶柱以氯仿∶甲醇(97∶3)洗脱得到粗产品，以甲醇重结晶得去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯白色粉末2.3g。薄层层析显示一个斑点。熔点188-190℃。1H NMR(CDCl3)显示，化学位移0.85-1.85(40H，Cholesterol)，2.30(m，4H，CHCH2CH)，2.62(m，2H，CHCH2CH)，2.64，2.65(m，4H，OCH2CH2O)，4.35(m，1H，CHO)，4.37(m，2H，C2O)，4.60(m，1H，CHO)，5.35(d，1H，CCHCH2)，6.29(t，1H，CHN)，8.11，8.14(s，1H，NCHN)，12.71(s，1H，NH)。元素分析值C(69.86％)H(8.58％)N(7.95％)，与理论值C(69.77％)H(8.54％)N(7.84％)相近。
其它不同连接基的去羟肌苷胆固醇衍生物分子如去羟肌苷胆固醇马来酸酯、去羟肌苷胆固醇富马酸酯的合成步骤与上面描述的步骤相近。
实施例4.去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯钠盐的制备分子式C41H60N4O6Na。取去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯(7.05g，0.01mol)溶于20ml氯仿，加入含0.01mol NaOH的甲醇溶液，振摇超声，减压挥干溶剂，甲醇重结晶，得到去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯钠盐白色晶体。该晶体在甲醇中溶解度大于氯仿。薄层层析显示一个斑点。元素分析值C(67.30％)H(8.21％)N(7.42％)，与理论值C(67.65％)H(8.31％)N(7.70％)相近。其它碱盐如钾盐、钙盐、镁盐制备方法相近。
实施例5.去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯醋酸盐的制备分子式C43H65N4O8。取去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯(7.05g，0.01mol)溶于20ml氯仿，加入含0.01mol醋酸的丙酮溶液，振摇超声，减压挥干溶剂，异丙醇重结晶，得到去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯醋酸盐白色固体。该固体较易溶于氯仿。薄层层析显示一个斑点。元素分析值C(67.56％)H(8.52％)N(7.56％)，与理论值C(67.42％)H(8.55％)N(7.31％)相近。其它有机酸盐如甲酸盐、草酸盐、马来酸盐制备方法相近。
实施例6.去羟肌苷胆固醇庚二酸酯的制备本品是庚二酸分子两端分别与去羟肌苷脂肪环侧链羟基和胆固醇羟基酰化的产物，化学名Pimelic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester 5-(6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-yl)-tetrahydro-furan-2-ylmethyl ester，分子式C44H66N4O6，分子量747.02。去羟肌苷胆固醇庚二酸酯的合成步骤如下取庚二酸(16.02g，10mmol)溶于50ml二氯甲烷，加热回流，逐滴加入二氯亚砜5ml，回流2h，中间可补充适量二氯亚砜，然后减压挥去大部分溶剂，又加入50ml二氯甲烷和胆固醇(3.86g，10mmol)室温搅拌5h，继续加入去羟肌苷(1.18g，5mmol)，室温搅拌5h，减压蒸干溶剂得类白色固体，加THF适量加热至溶解，搅拌下倒入饱和NaHCO3冰水溶液中，过滤，水洗至中性，滤渣经硅胶柱以氯仿∶甲醇(95∶5)洗脱得到粗产品，以异丙醇重结晶得去羟肌苷胆固醇庚二酸酯白色粉末2.0g。薄层层析显示一个斑点。熔点192-195℃。元素分析值C(70.68％)H(8.59％)N(7.85％)，与理论值C(70.74％)H(8.91％)N(7.50％)相近。
实施例7.齐多夫定胆固醇琥珀酸酯的制备本品是琥珀酸分子两端分别与齐多夫定脂肪环侧链羟基和胆固醇羟基酰化的产物，分子式C41H61N5O7，分子量735.96。齐多夫定胆固醇琥珀酸酯的合成步骤与实施例1中的阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯相类似，产物元素分析结果C(66.58％)H(8.59％)N(9.09％)，与理论值C(66.91％)H(8.35％)N(9.52％)相近，薄层层析结果显示一个点。
实施例8.拉米夫定胆固醇琥珀酸酯的制备本品是琥珀酸分子两端分别与拉米夫定脂肪环侧链羟基和胆固醇羟基酰化的产物，英文化学名为Succinic acid 5-(4-amino-2-oxo-2H-pyrimidin-l-yl)-[1，3]oxathiolan-2-ylmethyl ester 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester，分子式C39H59N3O6S，分子量697.97。拉米夫定胆固醇琥珀酸酯的合成步骤与实施例3中的去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯相似，产物元素分析结果C(67.58％)H(8.46％)N(6.38％)，与理论值C(67.11％)H(8.52％)N(6.02％)相近，薄层层析结果显示一个点。
实施例9.阿糖胞苷胆固醇马来酸酯的制备本品是马来酸分子两端分别与阿糖胞苷4位芳胺和胆固醇羟基酰化的产物，英文化学名为3-[1-(3，4-Dihydroxy-5-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-2-yl)-2-oxo-1，2-dihydro-pyrimidin-4-ylcarbamoyl]-acrylic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclo-penta[α]phenanthren-3-yl ester，分子式C40H59N3O8，分子量709.91。阿糖胞苷胆固醇马来酸酯的合成步骤如下取阿糖胞苷(300mg，1.23mmol)溶于2ml水，加入15ml溶有马来酸酐(287mg，2.47mmol)的二氧六环，室温搅拌2天，减压挥去溶剂，残渣用正己烷洗涤，并用乙醇水(1∶1)重结晶，得到N4-马来酸-阿糖胞苷单酯。此中间体(1.21g，5mmol)溶于20ml DMF，然后加入20ml溶有胆固醇(3.86g，10mmol)的THF溶液，室温搅拌3天，搅拌下倒入饱和NaHCO3冰水溶液中，过滤，水洗至中性，滤渣经硅胶柱以氯仿∶甲醇(90∶10)洗脱得到粗产品，以乙醇重结晶得阿糖胞苷胆固醇马来酸酯白色粉末2.5g。薄层层析显示一个斑点。熔点142-145℃。产物元素分析结果C(67.88％)H(8.76％)N(5.65％)，与理论值C(67.67％)H(8.38％)N(5.92％)相近。
实施例10.阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯脂质体的制备取阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯(20mg)、大豆磷脂(0.1g)于250ml烧瓶中，用20ml二氯甲烷溶解，减压旋转蒸发，得到一层有机脂溶性膜，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml，振荡，大部分膜脱落，在50℃超声，直至得到均匀混悬液，显微镜下观察，大部分粒子直径小于1微米，即为阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯脂质体。
实施例11.阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯非离子表面活性剂泡囊的制备取阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯(30mg)、司盘60(0.08g)于250ml烧瓶中，用20ml二氯甲烷溶解，减压旋转蒸发，得到一层有机脂溶性膜，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml，振荡，大部分膜脱落，在50℃超声，直至得到阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯非离子表面活性剂泡囊的均匀混悬液，激光散射粒度分析仪检测，平均粒径为325纳米。
实施例12.去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯长循环脂质体的制备取去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯(50mg)、大豆磷脂(0.1g)、PEG化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)(0.01g)于烧瓶中，用20ml氯仿∶异丙醚(1∶1，v/v)溶解，加入适量蒸馏水，超声使其成为乳剂，减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，加入少量水，继续减压旋转蒸发，凝胶态物质脱落并分散成均匀混悬液，显微镜下观察，大部分粒子直径小于1微米，即为去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯长循环脂质体。
实施例13.去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯固体脂质纳米粒的制备取去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯(60mg)、单硬脂酸甘油酯(0.8g)、吐温80(0.02g)于烧杯中加热至80℃，逐渐加入含十二烷基硫酸钠(10mg)的80℃水(10ml)，保持温度不变，呈透明液体。再将其用注射器注入到高速搅拌的0℃水中，呈透明液体。在原子力显微镜下观察，多为100纳米以下的粒子。该去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯固体脂质纳米粒混悬液可常温放置7天未见沉淀析出。该固体脂质纳米粒混悬液添加适当保护剂后冻干成固体粉末，临用前加入水，即成去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯固体脂质纳米粒混悬液。
实施例14.阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯自组装传递系统的制备取阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯溶于四氢呋喃(5％，w/w)，用微量注射器注入到搅拌的水中，注入速度约100μl/min，至得到均匀微混悬液，减压可挥去有机溶剂，并可在加热条件下进一步浓缩产品，产品经磷钨酸负染后，粒子透射电镜下观察，为纳米级的粒状或棒状结构，即为阿昔洛韦胆固醇琥珀酸酯自组装传递系统。
实施例15.去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯自组装传递系统的制备将含有去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯(5％，w/w)和泊洛沙姆P188(1％，w/w)的四氢呋喃溶液，用微量注射器注入到搅拌的水中，注入速度约100μl/min，至得到均匀微混悬液，减压可挥去有机溶剂，并可在加热条件下进一步浓缩产品。产品经磷钨酸负染后，用透射电镜观察，为纳米级的粒状或棒状结构(见说明书附
图1和附图2)，粒径在20-1000纳米之间，即为去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯自组装传递系统。
图1低浓度(0.47mg/ml)去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯自组装传递系统负染法透射电镜照片。
图2高浓度(11.88mg/ml)去羟肌苷胆固醇琥珀酸酯自组装传递系统负染法透射电镜照片。
权利要求
1.一种核苷类似物胆固醇衍生物，其特征是核苷类似物胆固醇衍生物的结构为Nu-L-Ch其中Nu是核苷类似物基团，L是脂肪链连接基，并且L中的碳数在2～7之间，Ch是胆固醇基团。
2.如权利要求1的核苷类似物胆固醇衍生物，Nu、L和Ch之间以酯键连接。
3.如权利要求1的核苷类似物胆固醇衍生物，其中L的原型分子是双羧基脂肪酸。
4.如权利要求1的核苷类似物胆固醇衍生物，其中Nu的原型分子是核苷类似物，并且在其非芳香环的脂肪链或环上连有羟基。
5.如权利要求4的核苷类似物胆固醇衍生物，其中Nu的原型分子是具有抗病毒或抗癌作用的药物。
6.如权利要求1的核苷类似物胆固醇衍生物，其中L的原型分子是双羧基脂肪酸，Nu的原型分子是具有抗病毒或抗癌作用的核苷类似物药物，并且在其非芳香环的脂肪链或环上连有羟基，Ch是胆固醇基团。
7.如权利要求1～6的任一核苷类似物胆固醇衍生物形成的高度分散的传递系统，包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、微乳。
8.如权利要求7的高度分散的传递系统，含核苷类似物胆固醇衍生物的粒子直径小于1微米。
9.如权利要求1～6的任一核苷类似物胆固醇衍生物形成的高度分散的自组装传递系统，其分散粒子组成中的核苷类似物胆固醇衍生物的分子摩尔比例大于50％，其余为添加剂。
10.如权利要求9的自组装传递系统，其中添加剂选自磷脂、多元醇酯类表面活性剂、聚氧乙烯类表面活性剂、双十六烷基磷脂酸、胆固醇及其衍生物、硬脂胺。
全文摘要
本发明公开了一种核苷类似物胆固醇衍生物，特征是核苷类似物胆固醇衍生物的结构为Nu－L－Ch其中Nu是核苷类似物基团，L是脂肪链连接基，并且L中的碳数在2～7之间，Ch是胆固醇基团。由核苷类似物胆固醇衍生物可以形成高度分散的传递系统，包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒和微乳，也可以形成自组装传递系统。
文档编号A61K47/28GK1634969SQ20041009065
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者金义光, 艾萍 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所