专利名称：：稀土配合物荧光探针对dna的测定方法
技术领域：
：本发明涉及DNA的检测方法，具体涉及一种稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，属于生化分析
技术领域：
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背景技术：
：DNA是最重要的遗传物质，是细胞增殖、遗传的物质基础，是引起细胞生化、生理改变的关键性物质；生物体的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA复制，由亲代传给子代，在后代的生长发育过程中，遗传信息由DNA转录给RNA并翻译成特异的蛋白质，蛋白质执行各种生物功能。DNA的分析测定是分子生物学领域研究的基础，因此它一直是人们关注和研究的主要课题。目前关于DNA的分析测定方法报道较多的主要有紫外分光光度法、荧光分析法、共振光散射法等。紫外分光光度法是利用DNA在260nm的紫外吸收进行定量测定的，该方法操作简便，通过测定结果可直接计算得出DNA的浓度，目前仍被广泛使用，但由于其灵敏度低，而且在260nm处产生紫外吸收的物质很多，容易干扰测定结果，使其在应用上受到了很多限制。共振光散射(RLS)是近年来发展起来的一种新的分析方法，灵敏度较高，操作简便，但测定的线性范围较窄。荧光分析法由于其很高的灵敏度和很好的选择性，越来越多地受到人们的关注，目前主要采用有机染料荧光探针、金属离子荧光探针以及金属离子络合物荧光探针对DNA进行分析测定，如溴化乙啶^8)，1^+-8-羟基喹啉，￡1!3+-四环素^13+-四环素，Tb"-钛铁试剂(TR)等，但在这些DNA荧光探针中，大多数探针具有很大的毒性，可能是致突变剂，尤其是当其与DNA的结合为不可逆时，非常可能是致突变剂。因此，对毒性低、选择性好、灵敏度高的DNA探针的研究成为一个非常活跃的研究领域。
发明内容本发明提供了一种快速、灵敏、低毒、对环境友好的稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，利用DNA对铽离子(Tb"-环丙沙星(CPFX)荧光体系的荧光增强效应，建立了Tb3+-环丙沙星荧光探针对DNA的测定方法。该荧光探针可消除其它物质对DNA的测定干扰，实现样品中痕量DNA的灵敏测定。—种稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，包括以下步骤(1)将Tb407溶于盐酸中，加水定容制成Tb3+浓度为0.5X10—53X10—5mol/L的Tb3+溶液；将含DNA的样品溶于0.010.lmol/L的NaCl水溶液中制成待测溶液；(2)将0.52mLpH=67、浓度为0.22mol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，O.53mLTb3+溶液，O.53mL浓度为IX10—53.0X10—5mol/L的环丙沙星水溶液和待测溶液混合，加水定容至10ml，摇匀并放置至少lOmin(优选1030min)，作为供试液；另取与供试液中相同的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液、Tb3+溶液和环丙沙星水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置相同时间，作为空白液；(3)在激发波长为280300nm，发射波长为540550nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为515nm的荧光分析仪中，分别测定空白液的荧光强度F。和供试液的荧光强度F，DNA荧光强度AF=F-F。。作为优选，所述的稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，包括以下步骤(1)将化407溶于盐酸中，加水定容制成化3+浓度为1X10—Smol/L的Tb"溶液；将含DNA的样品溶于0.010.lmol/L的NaCl水溶液中制成待测溶液；(2)将lmLpH=6.5、浓度为lmol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，lmLTb3+溶液，lmL浓度为1X10—5mol/L的环丙沙星水溶液和待测溶液混合，加水定容至lOrnl，摇匀并放置20min，作为供试液；另取与供试液中相同的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液、Tb"溶液和环丙沙星水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置20min，作为空白液；(3)在激发波长为290nm，发射波长为545nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm的荧光分析仪中，分别测定空白液的荧光强度F。和供试液的荧光强度F，DNA荧光强度AF=F-F。。所述的DNA优选为鲱鱼精DNA(hsDNA)或小牛胸腺DNA(ctDNA)。配制Tb3+溶液时，盐酸的用量不必过多，只要能使Tb407溶解即可。pH的影响pH〈6时，随pH的增大，测试体系(即供试液)的荧光强度逐渐增强；当pH=67时，测试体系的荧光强度达到最大并保持稳定；当pH>7时，随pH的增大荧光强度逐渐变弱。因此，选用pH=67的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，调节测试体系的pH值，以维持稳定的荧光强度。由于常规的缓冲溶液如磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液等有熄灭荧光的作用，本发明选用六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液来调节测试体系的PH值，使测试体系的pH值趋于稳定，且不会影响测试结果。所述的HMA-盐酸缓冲溶液的配制将HMA溶于水中，用盐酸调节至所需pH值即可。供试液中Tb"、环丙沙星浓度的影响当供试液中Tb3+增加到一定浓度时，即供试液中环丙沙星与铽离子的摩尔比为l:l时，体系荧光强度达到最大值；当Tb"浓度继续增加，体系荧光强度基本保持不变。因此可认为Tb"-环丙沙星-DNA三元络合体系中环丙沙星与Tb"的最佳络合摩尔比为l:1。同时实验发现，当环丙沙星浓度与Tb"浓度较高时，低浓度的DNA对体系的荧光增强效应明显降低，为了保证DNA测定的灵敏度，供试液中环丙沙星的浓度选用0.5X10—69X10—6mol/L，Tb3+的浓度选用0.25X10—69X10—6mol/L，为了进一步提高DNA测定的灵敏度，供试液中环丙沙星的浓度与Tb3+的浓度均优选为1X10—6mol/L。放置时间的影响配制供试液时需在摇匀后放置一定时间，本发明发现放置时间>10min，荧光强度就会保持稳定，稳定时间至少为30min，因此，本发明将供试液放置至少10min后进行荧光强度检测，优选放置10min30min，最优选放置20min后进行荧光强度检测，以保证在节约检测时间的同时达到好的检测效果。线性关系的确定取DNA标准品溶于0.010.lmol/L的NaCl水溶液中配制一系列由低浓度到高浓度的DNA标准溶液，按所述方法加入与供试液相同的其它试剂并在相同的荧光检测条件下分别测定荧光强度，以DNA荧光强度AF为纵坐标、DNA的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，确定hsDNA的浓度为0.012iig/mL时，ctDNA的浓度为0.011.0g/mL时，荧光强度与DNA浓度的线性关系，根据线性关系得出供试液中DNA的浓度。如需使用DNA的摩尔浓度，其摩尔浓度一般可根据紫外可见光度法检测260nm处的吸光度计算得出，其中摩尔吸光系数e取6600L/mo1cm。本发明方法检测限的确定选择体系荧光强度接近空白的DNA标准溶液，即DNA浓度为0.02g/mL时的标准溶液，在本发明优选的最佳实验条件下测定荧光强度，连续测定11次，按近似检测限的计算方法(3s/x)Xc进行计算，得到其检测限(S/N=3)为hsDNA3.8ng/mL，ctDNA10ng/mL;其中s表示由11次测得的荧光强度计算得到的标准偏差，x表示11次测得的荧光强度的平均值，c表示选定的DNA标准溶液的浓度，即为0.02g/mL。外来物质的干扰试验在浓度为2.5X10—Smol/L的hsDNA标准品溶液中添加金属离子、氨基酸、碱基、蛋白质等物质，采用本发明方法(即利用CPFX-Tb"荧光探针)进行检测，测试常见金属离子、氨基酸、碱基、蛋白质等对体系荧光强度的影响，在体系荧光强度变化不超过±5%范围内，其它物质不干扰测定的最大倍数(即占DNA摩尔浓度的倍数)如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可见，除P0/—离子外，常见金属离子、氨基酸、碱基、蛋白质对体系产生的干扰很小，表明本发明方法具有很好的选择性。本发明所用的试剂均选用分析纯，所用的水均选用纯水或蒸馏水。本发明具有以下有益效果1.本发明方法所用的试剂毒性很小，是对环境友好的荧光探针，可替代目前广泛应用的毒性且是致癌物质EB荧光探针。2.本发明的荧光探针，还可用于细胞的荧光成像。3.本发明方法简单、快速、准确，具有高的灵敏度与好的选择性，应用范围广泛，是DNA测定的理想方法。图1为本发明实施例1的工作曲线图；图2为本发明实施例2中部分合成样品的荧光光谱图，其中1代表CPFX(CPFX浓度为1.0iimol/L)，2代表CPFX-Tb3+(CPFX浓度为1.0iimol/L，Tb3+浓度为1.0iimol/L)，3代表hsDNA-Tb3+(hsDNA浓度为2.5iimol/L，Tb3+浓度为1.0iimol/L)，4代表CPFX_Tb3+-hsDNA(CPFX浓度为1.0iimol/L，hsDNA浓度为2.5iimol/L，Tb3+浓度为1.0iimol/L);图3为本发明实施例3的细胞荧光成像图。具体实施方式实施例1将1\07溶于盐酸中，加水定容制成1133+浓度为1X10—5mol/L的Tb"溶液。将含hsDNA的样品溶于0.lmol/L的NaCl水溶液中制成样品浓度为100iig/mL的待测溶液。将lmLpH=6.5、浓度为lmol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，lmL上述Tb3+溶液，lmL浓度为IX10—5mol/L的环丙沙星水溶液和lmL待测溶液混合，加水定容至10ml，摇匀并放置20min，作为供试液。另取lmLpH=6.5、浓度为lmol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，lmL上述Tb"溶液和lmL浓度为1X10—5mol/L的环丙沙星水溶液，混合后加水定容至lOml，摇匀并放置20min，作为空白液。将空白液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，在激发波长为290nm，发射波长为545nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm处，测定荧光强度F。。将供试液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，在激发波长为290nm，发射波长为545nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm处，测定荧光强度F，供试液中hsDNA荧光强度AF=F-F。。根据现有标准工作曲线的绘制方法，取hsDNA标准品溶于0.lmol/L的NaCl水溶液中配制一系列由低浓度到高浓度的hsDNA标准溶液，各标准溶液中均加入lmLpH=6.5、浓度为lmol/L的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液，lmL上述Tb"溶液和lmL浓度为1X10—5mol/L的环丙沙星水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置20min，得到标样，各标样的浓度依次为:0iig/mL，0.01iig/mL，0.02iig/mL，0.05iig/mL，0.1iig/mL，0.2iig/mL，0.5iig/mL，1.0yg/mL，2.0yg/mL。在激发波长为290nm，发射波长为545nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为lOnm处，测定上述标样的荧光强度巳，以荧光强度(即F「F。)为纵坐标、hsDNA的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，如图l所示，根据标准工作曲线和供试液中hsDNA的荧光强度AF得出供试液中hsDNA的浓度，计算得到待测溶液中hsDNA的浓度，进而得到含hsDNA的样品中hsDNA的浓度。同时采用现有的其它方法对待测溶液中hsDNA的浓度进行测定，结果见表2。表2不同方法对hsDNA的测定结果hsDNA浓度(X10—5mol/UR.S.D.(%，检测次数n=5)紫外光度法1.44EB探针法1.54±0.042.92实施例11.39±0.064.32实施例2回收试验根据其它物质不干扰测定的最大倍数配制DNA的合成样品，采用现有的标准加入法按同实施例1的测定方法(即Tb3+_CPFX荧光探针法)进行测定，计算回收率，结果如表3所示，测定的荧光光谱图见图2。表3合成DNA样品的回收率测定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>备注表中，测得量为5次测定值的平均值；A代表腺嘌呤(adenine);T代表胸腺嘧啶(thymine);U代表尿嘧啶(uracil);G代表鸟嘧啶(guanine);Gly代表甘氨酸(glycine);Glu代表谷氨酸(glutamicacid);Phen代表苯丙氨酸(phenylalanine);Tyr代表酪氨酸(tyrosine);BSA代表牛血清白蛋白(bovineserumalbumin)。从表2看出，回收率都在90%以上，回收率良好，表明该检测方法抗干扰力较好，方法可靠，准确度高。实施例3细胞成像在涂布有肾脏组织细胞的玻璃切片(由浙一医院提供)上滴加几滴由lmL浓度为lmol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液(pH=6.5)、lmL浓度为1X10—5mol/L的Tb3+溶液和lmL浓度为1X10—5mol/L的环丙沙星水溶液混合而成的混合液，检验环丙沙星_铽配合物荧光探针的荧光成像情况。同时做空白对照取一涂布有肾脏组织细胞的玻璃切片(由浙一医院提供)，在玻璃切片上滴加几滴lmL浓度为1X10—5mol/L的环丙沙星水溶液，单独进行组织细胞染色试验，作为空白1;另取一涂布有肾脏组织细胞的玻璃切片(由浙一医院提供)，在玻璃切片上滴加几滴lmL浓度为1X10—5mol/L的Tb3+溶液，单独进行组织细胞染色试验，作为空白2;分别在荧光显微镜下观察上述三块玻璃切片的荧光成像情况，发现环丙沙星_铽配合物荧光探针的细胞荧光成像如图3所示，环丙沙星与稀土铽离子单独进行组织细胞染色未观察到荧光成像。实施例4将Tb407溶于盐酸中，加水定容制成Tb3+浓度为0.5X10—5mol/L的Tb3+溶液。将含ctDNA的样品溶于0.Olmol/L的NaCl水溶液中制成样品浓度为100yg/mL的待测溶液。将0.5mLpH=6、浓度为0.2mol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，O.5mL上述Tb3+溶液，3mL浓度为3X10—5mol/L的环丙沙星水溶液和lmL待测溶液混合，加水定容至lOml，摇匀并放置30min，作为供试液。另取0.5mLpH=6、浓度为0.2mol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，O.5mL上述Tb3+溶液和3mL浓度为3X10—5mol/L的环丙沙星水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置30min，作为空白液。将空白液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，在激发波长为280nm，发射波长为550nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为15nm处，测定荧光强度F。。将供试液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，在激发波长为280nm，发射波长为550nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为15nm处，测定荧光强度F，供试液中ctDNA荧光强度AF=F-F。。标样的配制同实施例1。在激发波长为280nm，发射波长为550nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为15nm处，测定各标样的荧光强度巳，以荧光强度(即巳-F。)为纵坐标、ctDNA的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，根据标准工作曲线和供试液中ctDNA的荧光强度AF得出供试液中ctDNA的浓度，计算得到待测溶液中ctDNA的浓度，进而得到含ctDNA的样品中ctDNA的浓度。检测结果经误差分析，其相对标准偏差较小，结果准确度高。实施例5将Tb407溶于盐酸中，加水定容制成Tb3+浓度为3X10—5mol/L的Tb3+溶液。将含ctDNA的样品溶于0.Olmol/L的NaCl水溶液中制成样品浓度为100yg/mL的待测溶液。将2mLpH=7、浓度为2mol/L的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液，3mL上述Tb"溶液，0.5mL浓度为1.5X10—5mol/L的环丙沙星水溶液和lmL待测溶液混合，加水定容至10ml，摇匀并放置10min，作为供试液。另取2mLpH=7、浓度为2mol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，3mL上述Tb3+溶液和0.5mL浓度为1.5X10—5mol/L的环丙沙星水溶液，混合后加水定容至lOml，摇匀并放置10min，作为空白液。将空白液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，在激发波长为300nm，发射波长为540nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5nm处，测定荧光强度F。。将供试液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，在激发波长为300nm，发射波长为540nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5nm处，测定荧光强度F，供试液中ctDNA荧光强度AF=F-F。。标样的配制同实施例1。在激发波长为300nm，发射波长为540nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为15nm处，测定各标样的荧光强度巳，以荧光强度(即巳-F。)为纵坐标、ctDNA的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，根据标准工作曲线和供试液中ctDNA的荧光强度AF得出供试液中ctDNA的浓度，计算得到待测溶液中ctDNA的浓度，进而得到含ctDNA的样品中ctDNA的浓度。检测结果经误差分析，其相对标准偏差较小，结果准确度高。权利要求一种稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，包括以下步骤(1)将Tb4O7溶于盐酸中，加水定容制成Tb3+浓度为0.5×10-5～3×10-5mol/L的Tb3+溶液；将含DNA的样品溶于0.01～0.1mol/L的NaCl水溶液中制成待测溶液；(2)将0.5～2mLpH＝6～7、浓度为0.2～2mol/L的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液，0.5～3mLTb3+溶液，0.5～3mL浓度为1×10-5～3.0×10-5mol/L的环丙沙星水溶液和待测溶液混合，加水定容至10ml，摇匀并放置至少10min，作为供试液；另取与供试液中相同的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液、Tb3+溶液和环丙沙星水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置相同时间，作为空白液；(3)在激发波长为280～300nm，发射波长为540～550nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5～15nm的荧光分析仪中，分别测定空白液的荧光强度F0和供试液的荧光强度F，DNA荧光强度ΔF＝F-F0。2.如权利要求1所述稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的放置时间为1030min。3.如权利要求2所述稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将化407溶于盐酸中，加水定容制成化3+浓度为lX10—Smol/L的Tb"溶液；将含DNA的样品溶于0.010.lmol/L的NaCl水溶液中制成待测溶液；(2)将lmLpH=6.5、浓度为lmol/L的六次甲基四胺_盐酸缓冲溶液，lmLTb3+溶液，lmL浓度为1X10—5mol/L的环丙沙星水溶液和待测溶液混合，加水定容至lOrnl，摇匀并放置20min，作为供试液；另取与供试液中相同的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液、Tb"溶液和环丙沙星水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置20min，作为空白液；(3)在激发波长为290nm，发射波长为545nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm的荧光分析仪中，分别测定空白液的荧光强度F。和供试液的荧光强度F，DNA荧光强度AF=F-F。。4.如权利要求1、2或3所述稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，其特征在于，所述的DNA为鲱鱼精DNA或小牛胸腺DNA。全文摘要本发明公开了一种稀土配合物荧光探针对DNA的测定方法，包括以下步骤将六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液、Tb3+溶液、环丙沙星水溶液和DNA溶液混合，加水定容，摇匀并放置10～30min，作为供试液；另外，除了不添加DNA溶液其它均同供试液的操作配制空白液；在激发波长为280～300nm，发射波长为540～550nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5～15nm处，测定空白液和供试液的荧光强度F0和F，DNA荧光强度ΔF＝F-F0。本发明方法所用的试剂毒性很小，是对环境友好的荧光探针，且操作简单，能够快速、准确地进行DNA测定，具有高的灵敏度与好的选择性，应用范围广泛。文档编号C12Q1/68GK101709326SQ20091015375公开日2010年5月19日申请日期2009年11月5日优先权日2009年11月5日发明者童裳伦,项光宏申请人:浙江大学