专利名称：：一种全合成培养基及其制备方法和用于培养裂殖壶菌的方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物的培养基及其用于培养裂殖壶菌的方法。
背景技术：
：大量的研究已充分证明，增加人体内长链Omega-3不饱和脂肪酸的饮食摄入量具有有益效果，二十二碳六烯酸(DHA)是一种Omega-3多(元)不饱和脂肪酸，动物自身难以合成，有重要的生理调节功能和医疗及保健作用(1)健脑益智，保护视力研究表明，DHA对婴幼儿大脑的正常发育和成人大脑功能的正常发挥有非常重要的作用，它不仅能促进婴幼儿大脑和眼睛的发育并提高其认知能力，而且影响成年人的大脑功能和行为反应，可有效地用于治疗阿尔茨海默型痴呆症并减少其发病率。(2)预防和治疗心血管疾病DHA有明显的降血脂，降血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和升高血清密度的功效，并保持心血管健康。(3)抑制炎性疾病(inflammatorydiseases)(如风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘等)。(4)抗癌、抗肿瘤作用有研究表明，DHA可成为一种新型的抗癌药物或辅助用药。由于DHA具有上述重要的生理功能，因此已引起人们越来越多的关注。现已发现几种异养的海洋微生物能高水平地生产这类重要的多不饱和脂肪酸，其中包括破囊壶菌属的海洋微生物。DHA作为长链不饱和脂肪酸，在不同的微生物体内有着不同的合成途径。大部分微生物都是通过脂肪酸合成酶系统(FAS)途径合成不饱和脂肪酸DHA，如破囊壶菌(Thraustochytrium)。杜冰等(杜冰，刘长海，姚汝华.微生物发酵法生产DHA的研究[J].食品科学，2005，26(3)=128-130)通过摇瓶培养破囊壶菌ATCC34304六天，DHA含量为0.32g/L0而另外一些微生物采用聚酮合成酶(PKS)途径合成不饱和脂肪酸DHA，如裂殖壶菌(Schizochytriumsp·)、隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)等(RatledgeC.Fattyacidbiosynthesisinmicroorganismsbeingusedforsinglecelloilproduction.JBiochimie，2004，86:807_815；AnaMendes,AlbertoReis，RitaVasconceIos,PedroGuerra，TeresaLopesdaSilva.CrypthecodiniumcohniiwithemphasisonDHAproduction:areview.JApplPhycol，2009，21:199-214；JianzhongHuang，XianzhangJiangetal.ExpressedsequencetaganalysisofmarinefungusSchizochytriumproducingdocosahexaenoicacid.JJournalofBiotechnology,2008,138:9-16)。王菊芳等(王菊芳，梁世中，陈峰.几种无机盐对隐甲藻生长和DHA产量的影响[J].湛江海洋大学学报，2001，21(4)18-22)采用胰蛋白胨、酵母浸提粉做培养基，摇瓶培养隐甲藻CrypthecodiniumcohniiATCC30556三天，其最大生物量和DHA产量分别为3.31g/L和0.49g/L。张娟梅等(张娟梅，江贤章，黄建忠·裂殖壶菌Schizochytriumsp.FJU-512细胞油脂的研究[J].福建师范大学学报，2007，23(2)75-80)采用葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、海水晶的天然培养基培养裂殖壶菌Schizochytriumsp.FJU-512，DHA产量为2.lg/L。裂殖壶菌是用于生产DHA的最理想的微生物之一，其生长繁殖较快，耐机械搅拌，培养条件要求相对较低，产生的脂质成分简单且易于分离，已成为一株可商业化生产DHA的理想来源(周茂洪，周林.1株裂殖壶菌(Schizochytrium.spl)的分离鉴定[J].微生物学通报，2006，33(4)48-51；RichardB.B，DonD.M,HansenM，etal.EnhancedproductionofLipidcontainingpolyenoicfattyacidbyveryhighdensityculturesofeukaryoticmicrobesinfermenters[P].UnitedStatesPatent,2003,US6，607，900)。此外，Schizochytrium产生的脂质中长链不饱和脂肪酸(LC-PUFA)含量高，且成分比例与母乳中的脂质组成相近，已被美国及欧洲有关食品权利机构批准添加至相关食物中使用(K.Boswell,E.K.Koskelo,L.Carl,S.Glaza,D.J.Hensen,K.D.WilliamsandD.J.Kyle.PreclinicalEvaluationofSingle-cellOilsthatareHighlyEnrichedwithArachidonicAcidandDocosahexaenoicAcid.FoodandChemicalToxicology,1996,34585-593；StatementoftheScientificPanelonDieteticProducts,NutritionandAllergiesonarequestfromtheCommissionrelatedtotheadditionofDHA-richoilfrommicroalgaetoanextendedrangeoffoods.RequestN°EFSA-Q-2005—286.EuropeanFoodSafetyAuthority,expressedon6July2006atits14thplenarymeetingcorrespondingtoitem8.2oftheagenda)。用于培养裂殖壶菌的培养基可分为三类，即天然培养基、半合成培养基和合成培养基。天然培养基由化学成分不清楚或不衡定的天然有机物配制而成，包含动植物提取物如酵母粉、酪蛋白胨、大豆蛋白胨等；半合成培养基由某些天然物质与少量已知成分的化学物质配制而成；合成培养基由各种成分已知的化学物质组成，成分精确，重复性强，并且可避免产品被动植物提取物污染。
发明内容本发明的目的之一在于根据裂殖壶菌的营养要求及代谢途径，提供一种全合成培养基及其制备方法。本发明的目的之二在于提供一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法。本发明所述全合成培养基包括碳源、氮源、维生素和无机盐，具体组成及含量如下碳源葡萄糖60150g/L；氮源丙氨酸1.82.2g/L、甲硫氨酸1.01.5g/L、半胱氨酸0.150.3g/L、赖氨酸0.20.5g/L、组氨酸1.21.4g/L、谷氨酸1.31.6g/L、谷氨酰胺1.31.6g/L、异亮氨酸1.21.5g/L、苏氨酸0.91.2g/L、色氨酸1.51.8g/L；维生素VBi28mg/L，VB12814mg/L，生物素39mg/L，硫辛酸1530mg/L,叶酸3842mg/L；无机盐:NaCl1018g/L，KCl0.30.6g/L，MgCl22.02.5g/L，CaCl20.60.75g/L,Na2HP040.35g/L,KH2P041.2g/L。所述全合成培养基的制备方法，包括以下步骤1)在无机盐溶液中加入碳源及氮源，灭菌，得溶液A；2)将维生素溶液用无菌过滤膜过滤除菌，然后再加到溶液A中，混合均勻后即得全合成培养基。在步骤1)中，所述在无机盐溶液中加入碳源及氮源，最好调节pH至6.06.5；所述灭菌，最好在100120°c下高压灭菌1030min。在步骤2)中，所述过滤膜的孔径最好<0.2iim。所述全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，包括以下步骤1)菌种活化将裂殖壶菌菌种转接于斜面培养；2)一级种子用接种环挑取活化的菌种，接入装有种子培养基的容器中培养；3)二级种子取一级种子，接入装有种子培养基的容器中培养；4)扩大培养将二级种子以4%的接种量接种于全合成培养基上培养，裂殖壶菌的生物量达到58g/L，总油脂约占细胞干重的55%，DHA产量为9.8g/L。在步骤1)中，所述斜面培养，最好在2226°C下200r/min培养12天。在步骤2)中，所述培养，最好在2226°C下200r/min培养1天。在步骤3)中，所述种子培养基最好为30g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，0.5倍浓度自然海水；所述培养最好在2226°C下200r/min培养1天。在步骤4)中，所述接种于全合成培养基上培养，最好在2226°C下200r/min培养34天。本发明以天然培养基及半合成培养基为优化起点，对特定培养基组分如碳源、氮源、维生素的种类及其浓度进行优化，并向其中添加了无机盐溶液，为海洋微生物裂殖壶菌提供一个适宜的生长环境，即采用人工海水(无机盐溶液)代替自然海水，使用方便，并避免了因地域不同而无机盐成分差异的缺陷。利用该合成培养基于摇瓶培养裂殖壶菌，装液量100ml/500ml，生物量(细胞干重)达到58g/L，总油脂约占生物量的55%，DHA产量为9.8g/L。图1为实施例2中不同碳源对Schizochytriumsp.生物量、总油脂及DHA积累的影响结果。在图1中，横坐标为培养时间(h)，左纵坐标为细胞干重(g/L)和总油脂(眷，g/L)，右纵坐标为DHA含量(▲，g/L)；a为甘油，b为果糖，c为乳糖，d为蔗糖，e为葡萄糖。图2为实施例3中氨基酸单一缺失图谱。在图2中，横坐标为每次实验中缺少的氨基酸组分，纵坐标为细胞干重与对照组相比的相对影响值，可为正、零、负值。其中横坐标的1-20分别代表20种氨基酸，其分别为1半胱氨酸，2亮氨酸，3组氨酸，4丙氨酸，5色氨酸，6甘氨酸，7甲硫氨酸，8天冬酰胺，9谷氨酸，10异亮氨酸，11精氨酸，12脯氨酸，13缬氨酸，14天冬氨酸，15赖氨酸，16谷氨酰胺，17丝氨酸，18苯丙氨酸，19苏氨酸，20酪氨酸。图3为实施例6中单因子实验维生素对Schizochytriumsp.生长和DHA积累中的作用。在图3中，横坐标为维生素的浓度(mg/L)，纵坐标为细胞干重(g/L)和DHA含量(g/L);a为VBnb为VB2，C为VB12，d为生物素，e为硫辛酸，f为叶酸为细胞干重，^^为DHA。具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1全合成培养基培养裂殖壶菌1)按无机盐组分NaCl15g/L，KC10.5g/L，MgCl22g/L，CaCl20.75g/L，Na2HP040.35g/L，KH2P041.2g/L，氮源组分丙氨酸2.Og/L、甲硫氨酸1.3g/L、半胱氨酸0.25g/L、赖氨酸0.4g/L、组氨酸1.2g/L、谷氨酸1.5g/L、谷氨酰胺1.3g/L、异亮氨酸1.5g/L、苏氨酸1.2g/L、色氨酸1.6g/L和葡萄糖120g/L配制培养基水溶液，然后用NaOH或柠檬酸调节pH至6.06.5，在115°C高压灭菌20min。2)将VBi6mg/L,VB1210mg/L,生物素8mg/L，硫辛酸20mg/L，叶酸40mg/L配成的维生素溶液用孔径<0.2ym的无菌过滤膜过滤除菌，然后加到培养基水溶液中混合均勻得全合成培养基。3)将保藏于-80°C，从浙江温州乐清海湾红树林分离、筛选所得的裂殖壶菌系菌种转接于斜面，25°C,200r/min培养2天。用接种环挑取活化的菌种，接入装有50mL的种子培养基(30g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，0.5倍浓度自然海水)的250mL三角瓶，25°C、200r/min培养1天得到一级种子。然后取4mL—级种子，接入装有100mL种子培养基(30g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，0.5倍浓度自然海水)的500mL三角瓶，25°C、200r/min培养1天得到二级种子。再将二级种子以4%的接种量接种于全合成培养基里，于25°C、200r/min培养4天，生物量达到58g/L，总油脂约占细胞干重的55%，DHA产量为9.8g/L。实施例2不同碳源对Schizochytriumsp.发酵产DHA的影响选取5种碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘油)，分别以100g/L的浓度添加到培养基中，氮源为酵母膏，添加量为10g/L，以及人工海水无机盐溶液；装液量100ml/500ml，于25°C、200r/min培养4天，结果见图1。如图所示选取的五种碳源Schizochytriumsp.都能够利用，其中对甘油、乳糖利用较难，对葡萄糖、蔗糖、果糖的利用率较高。以葡萄糖为碳源，Schizochytriumsp.摇瓶生物量为36.lg/L，是果糖的1.2倍，甘油的2倍；其中DHA含量6.14g/L。结果显示葡萄糖是Schizochytriumsp.生长繁殖的最佳碳源。实施例3氮源——氨基酸组分的单一缺失实验本实施例设计了氨基酸单一缺失实验以筛选出对Schizochytriumsp.生长有显著作用的氨基酸组分。在实施例2的基础上，选用葡萄糖做碳源，20种基本氨基酸代替酵母膏，各氨基酸初始浓度均为0.5g/L，实验过程中，每次一种氨基酸缺失，其他氨基酸浓度保持不变，结果见图2。如图所示，20种基本蛋白质组分氨基酸，它们在Schizochytriumsp.生长和积累DHA的过程中所起到的作用大小各异。半胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸等10种氨基酸缺失后，对Schizochytriumsp.生长和积累DHA影响相对比较大，同对照组(氨基酸未缺失)相比Schizochytriumsp.生物量积累明显减少，说明这些氨基酸在Schizochytriumsp.生长和积累DHA过程中扮演着比较重要的角色；丝氨酸、精氨酸、脯氨酸等7种氨基酸缺失后，Schizochytriumsp.生物量同对照组相比反而有所增加，说明这些氨基酸的存在会抑制Schizochytriumsp.生长，且不利于DHA的积累；亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺缺失后，Schizochytriumsp.生物量同对照组相当，表明该三种氨基酸对Schizochytriumsp.生长和积累DHA没有太大的影响。实施例4Schizochytriumsp.生长过程中氨基酸的利用情况通过液相色谱对Schizochytriumsp.生长过程前后培养基中氨基酸组分进行分析，得到了Schizochytriumsp.生长过程中各种必须氨基酸的利用情况，如表1所示。表1Schizochytriumsp.生长过程中氨基酸的利用情况Concentration/g-L"Aminoacid_Δ/g-LInitialfinalAlanineL34006L28~Methionine1.320.031.29Cysteine1.020.021.00Tryptophan1.630.021.61.Lysine1.090.031.06Glutamine1.490.061.43Glutamicacid1.560.121.44Threonine1.080.031.05Histidine1.250.011.24Isoleucine1.340.031.31实施例5均勻设计法优化培养基中氨基酸组分在实施例3和4的基础上运用均勻设计来优化必需氨基酸的组成，确定10种必需氨基酸为考察对象。固定培养基中其他成分，采用10因素5水平20组实验的方式[U2tl(510)]考察了10种氨基酸对Schizochytriumsp.生长和积累DHA的影响(见表2)。表2各考察氨基酸水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结合统计分析软件分析实验结果(见表3)，得到最优化的配比如下丙氨酸1.82.2g·L-1、甲硫氨酸1.01.5g·L—1、半胱氨酸0.150.3g·L—1、赖氨酸0.20.5g·L—1、组氨酸1.21.4g·L—1、谷氨酸1.31.6g·L—1、谷氨酰胺1.31.6g·L—1、异亮氨酸1.21.5g·Γ1、苏氨酸0.91.2g·Γ1、色氨酸1.51.8g·Γ1。其中对DHA的积累影响显著因素依次是丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸。将氨基酸组分代替传统氮源——酵母膏，微生物的生物量最大可提高32%。表3均勻设计方案及实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例6维生素对Schizochytriumsp.生长和油脂积累中的作用通过单因子实验，添加不同维生素考察Schizochytriumsp.生长和DHA积累情况，结果见图3。如图3所示，VB1,VB12、生物素、硫辛酸和叶酸对Schizochytriumsp.生长和积累DHA有一定的促进作用，而VBjfSchizochytriumsp.生长和积累DHA没有促进作用，添加VB2在某种程度上会抑制Schizochytriumsp.的生长。则各种维生素最适的添加量如下=VB128mg·Γ1、VB12515mg·Γ1、生物素39mg·Γ1、硫辛酸1530mg·Γ1、叶酸3842mg·Γ1。实施例7正交设计法优化维生素组合通过正交实验得出硫辛酸和VB1JfDHA积累有着较大的影响，其次是生物素、叶酸和VB10最佳维生素组合为=VB128mg·L-1，VB12814mg·Λ生物素39mg·L-1，硫辛酸1530mg-Γ1,叶酸3842mg.L—1。在发酵培养基中控制这些维生素处于亚适量水平，有可能使Schizochytriumsp.中负责降解油脂的酶活性降低，从而实现DHA的过量合成。因此维持这些维生素浓度之间的平衡对于DHA过量合成显得非常重要。权利要求一种全合成培养基，其特征在于包括碳源、氮源、维生素和无机盐，具体组成及含量如下碳源葡萄糖60～150g/L；氮源丙氨酸1.8～2.2g/L、甲硫氨酸1.0～1.5g/L、半胱氨酸0.15～0.3g/L、赖氨酸0.2～0.5g/L、组氨酸1.2～1.4g/L、谷氨酸1.3～1.6g/L、谷氨酰胺1.3～1.6g/L、异亮氨酸1.2～1.5g/L、苏氨酸0.9～1.2g/L、色氨酸1.5～1.8g/L；维生素VB12～8mg/L，VB128～14mg/L，生物素3～9mg/L，硫辛酸15～30mg/L，叶酸38～42mg/L；无机盐NaCl10～18g/L，KCl0.3～0.6g/L，MgCl22.0～2.5g/L，CaCl20.6～0.75g/L，Na2HPO40.35g/L，KH2PO41.2g/L。2.如权利要求1所述的一种全合成培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)在无机盐溶液中加入碳源及氮源，调节pH至6.06.5，灭菌，得溶液A；2)将维生素溶液用无菌过滤膜过滤除菌，然后再加到溶液A中，混合均勻后即得全合成培养基。3.如权利要求2所述的一种全合成培养基的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述灭菌,是在100120°C下高压灭菌1030min。4.如权利要求2所述的一种全合成培养基的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述过滤膜的孔径<0.2i!m。5.如权利要求1所述的一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，其特征在于包括以下步骤1)菌种活化将裂殖壶菌菌种转接于斜面培养；2)一级种子用接种环挑取活化的菌种，接入装有种子培养基的容器中培养；3)二级种子取一级种子，接入装有种子培养基的容器中培养；4)扩大培养将二级种子以4%的接种量接种于全合成培养基上培养，裂殖壶菌的生物量达到58g/L，总油脂约占细胞干重的55%，DHA产量为9.8g/L。6.如权利要求5所述的一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，其特征在于在步骤1)中，所述斜面培养，是在2226°C下200r/min培养12天。7.如权利要求5所述的一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养，是在2226°C下200r/min培养1天。8.如权利要求5所述的一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，其特征在于在步骤3)中，所述种子培养基为30g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，0.5倍浓度自然海水。9.如权利要求5所述的一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，其特征在于在步骤3)中，所述培养是在2226°C下200r/min培养1天。10.如权利要求5所述的一种全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，其特征在于在步骤4)中，所述接种于全合成培养基上培养，是在2226°C下200r/min培养34天。全文摘要一种全合成培养基及其制备方法和用于培养裂殖壶菌的方法，涉及一种微生物的培养基及其用于培养裂殖壶菌的方法。全合成培养基包括碳源、氮源、维生素和无机盐。在无机盐溶液中加入碳源及氮源，灭菌得溶液A；将维生素溶液过滤，再加到溶液A中混合即得全合成培养基。全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法为菌种活化将裂殖壶菌菌种转接于斜面培养；一级种子用接种环挑取活化的菌种，接入装有种子培养基的容器中培养；二级种子取一级种子，接入装有种子培养基的容器中培养；扩大培养将二级种子以1％～4％的接种量接种于全合成培养基上培养，裂殖壶菌的生物量达到58g/L，总油脂约占细胞干重的55％，DHA产量为9.8g/L。文档编号C12R1/645GK101831387SQ201010150460公开日2010年9月15日申请日期2010年4月16日优先权日2010年4月16日发明者乔兴忠,倪洁,卢英华,周林,敬科举,陈丽珠申请人:厦门大学