专利名称：I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种I型鸭肝炎病毒(Duckh印atitisvirustype-1，DHV-1)血清抗体 酶联免疫法ELISA检测试剂盒，同时还涉及一种该试剂盒的检测方法和应用，属于禽类免 疫学技术领域。
背景技术：
鸭病毒性肝炎是幼龄雏鸭的一种高度致死性的急性传染病，此病的特征是发病 急，传播快，死亡率高，临诊表现为角弓反张，病理变化为肝炎和出血，此病常给养鸭场造成 严重的经济损失。此病最先在美国发现，并用鸡胚分离到病毒，其后在英国、加拿大、德国等 许多养鸭国家陆续发现此病。我国大部分省市和地区亦有此病的发生且呈上升趋势。鸭 胁爽‘病毒UJuckhepatitisvirus, DHV)，在分类上属微RNA病毒科，病毒大小约20 40nm， 在电镜下观察感染细胞，病毒在胞浆中呈晶格状排列，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和PH3.0 均有抵抗力，56°C加热60min仍可存活，但62°C的条件下30min即被灭活。病毒在1%福尔 马林或2%氢氧化钠中2h (15 20°C )或在2%漂白粉溶液中3h或者是在0. 2%福尔马林 或0. 25%β -丙内酯中37°C 30min均可被灭活。病毒可在污染的孵化器内至少存活10周， 在阴凉处的湿粪中可存活37d以上，在4°C条件下可存活2年以上，在-20°C则可长达9年。 此病主要感染鸭，在自然条件下不感染鸡、火鸡和鹅。此病的主要通过接触传播，经呼吸道 亦可感染，据推测不发生与蛋的传递。在野外和舍饲条件下，此病可迅速传播给鸭群中的全 部易感小鸭，表明它具有极强的传染性，感染多由从发病场或有发病史的鸭场购入带病毒 的雏鸭引起。由参观人员、饲养人员的串舍以及污染的用具、垫料和车辆等引起的传播经常 发生，鸭舍内的鼠类在传播病毒方面亦起重要作用。野生水禽可能成为带毒者，成年鸭感 染不发病，但可成为传染来源。雏鸭的发病率与病死率均很高，1周龄内的雏鸭病死率可达 95%，1 3周龄的雏鸭病死率为50%或稍低，4 5周龄的小鸭发病率与病死率较低。 鸭病毒性肝炎有三种类型，I型呈世界性分布，II型和III型鸭病毒性肝炎分别局 限于英国和美国。鸭病毒性肝炎I型(DVH- I)引起雏鸭的严重死亡，主要侵害4周龄以 内的雏雅，死亡率高达90%。目前国内流行的主要是DHV- I，是严重危害鸭子的主要传染 病之一。成年鸭在自然条件下被DHV-I感染后，可长期带毒和排毒而不出现临床症状，但进 入环境中的DHV-I对4周龄内的雏鸭却有高致病性，从而导致该病毒在鸭群中广泛传播。 因此，建立快速、敏感、特异的诊断方法是有效预防和控制该病的关键措施之一。目前，对 DHV-I的诊断主要依靠流行病学资料、临床症状、病理变化及病毒的分离和鉴定。但这些方 法用于检测感染DHV-I的死亡鸭组织中的病原时存在不足，如检测所需时间长、敏感性较 低等，临床应用受到一定的限制。因此，研制开发适用于鸭病毒性肝炎抗体检测的特异的、 敏感的、生物安全度高的、适合于基层使用的诊断检测的工具，对鸭免疫水平进行实时监控 和建立科学、灵活的鸭病毒性肝炎的免疫程序，以及对疫病的预防和控制有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒。本发明的目的还在于提供一种试剂盒的检测方法以及在I型鸭病毒性肝炎的检测、流行病学调查和免疫监测方面的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联 免疫法检测试剂盒，包括经重组VPl蛋白包被的酶标板，辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鸭 IgG抗体，TMB底物显色液，阳性血清，阴性血清。所述的包被酶标板所用的抗原即重组VPl蛋白是由基因工程菌株BL21体外诱 导表达获得，该菌株含表达质粒pET32a-VPl，重组表达质粒pET32a_VPl含有大肠杆菌 复制子ori、启动子PT7、外源VPl基因和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因，其表达式 为-ori-PT7-VPlgene-Ampgene-。其重组表达质粒pET32a_VPl的构建中，设计并合成的一对特异性引物为 上游引物 P1 5 ‘ -CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3 ‘
下游引物 P2 5 ‘ -GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3 ‘。
所述的阳性血清为经I型鸭肝炎病毒VPl蛋白免疫获得的I型鸭肝炎病毒标准阳性血 清，0D450nm ≥ 1. 00。所述的阴性对照为经筛选获得的鸭标准阴性血清，0D450nm≤0. 100。所述的TMB底物显色液包括显色液A和显色液B，其中显色液A的配制方法如下 200mg四甲基联苯胺(TMB)，用IOOmL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至IOOOmL, 配制成显色液A ；显色液化B的配制如下称取21g无水柠檬酸，28. 2g无水磷酸氢二钠 (Na2HPCM)，6. 4mL0. 75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至IOOOmL,调PH值到4. 5-5. 0，配制成显色液B。本发明的技术方案还采用了一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂 盒的检测方法，包括以下步骤
(1)将10X浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
(2)将待检血清用样品稀释液作1 100稀释，按100 μ L孔加入抗体检测板即经重组VPl 蛋白包被的酶标板中，同时设只加IOOyL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I 型鸭肝炎病毒标准阳性血清作为阳性对照，37°C孵育60分钟，甩干；
(3)每孔加洗涤液200μ L洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；
(4)每孔加100μ L的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37°C孵育 30分钟，甩干；
(5)每孔加洗涤液200μL，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；
(6)依次加入50μ L底物TMB显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育10分钟；
(7)加50μ L终止液(2MH2S04)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔
(8)以待测样本0D450nm值与标准阴性0D450nm值的比值(P/N)，大于或等于3判为阳 性，小于或等于1. 5为阴性，介于1. 5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2. 0 判为阳性，小于2.0为阴性。另外，本发明的技术方案还采用了 I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂 盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查方面以及免疫监测方面的应用。
本发明中
VP1蛋白的制备(即制备包被酶标板所用的抗原)
第一方面构建了表达载体pET32a-VPl。根据GenBank发表的DHV-I的VPl基因序列(序 列号EF653378)，利用DNAStar软件分析，设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶 切位点^boTPI和损al及保护性碱基(Takara公司合成)，下划线部分为酶切位点。上游引物Pl:5' -CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3 ‘ EcoRl 下游引物 P2 5 ‘ -GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3 ‘ Xba I
通过PCR获取VPl基因，将获取的VPl基因克隆入pMDIS-T载体并进行序列测定，将 PMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载体，构建重组表达质粒pET32a_VPl，将 重组质粒转化入BL21 (DE3)感受态细胞，并用双酶切和PCR进行鉴定，鉴定阳性的质粒即 为重组表达质粒pET32a-VPl。第二方面通过重组表达质粒pET32a_VPl体外高效表达，表达蛋白经镍柱纯化后， 测定蛋白浓度，以纯化蛋白为抗原研制ELISA试剂盒。VP1蛋白的最佳包被条件(即抗体检测板的最佳制备条件)
用PH8. 5的0. 05MTris-HCl缓冲液作包被液，将上述基因工程表达的VPl蛋白稀释为 10 μ g/mL,按100 μ L/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4°C包被过夜，甩干，按100 μ L/孔加入含 1%牛血清白蛋白(双(三甲基硅基)乙酰胺BSA)，37°C封闭4小时，洗涤甩干，置干燥室干燥 后，装入含干燥剂的包装袋中保存。辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗鸭IgG抗体的制备过程如下
(1)用超纯水配制辣根过氧化酶(HRP)溶液；加入0.06M过碘酸钠溶液4°C避光1小 时，加入160mM乙二醇，室温反应30-60分钟，加入PH4. 4的醋酸缓冲液2_8°C透析过夜，换 液两次；
(2)将纯化的兔抗鸭IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mMPH9. 6的碳酸 缓冲液中透析，4°C搅拌过夜，换液两次；
(3)透析液吸至离心管中，加现配的0.05M硼氢化钠溶液，4°C反应2小时，加入等量的 饱和硫酸铵溶液4°C放置30-60分钟，4°C 4000rpm离心10-20分钟，弃上清，将沉淀溶于少 量PBS，装入透析袋中，对0. 02MPBS (PH7. 4)透析，4°C过夜；
(4)收集透析袋中液体，4000rpm离心10-20分钟，上清液即为辣根过氧化酶标记的兔 抗鸭IgG多克隆抗体，将其与等量甘油混合，-20°C冻存，以含0. 1%双(三甲基硅基)乙酰胺 BSA, 0. 05%吐温-20，0. 01%硫柳汞钠，PH7. 4的磷酸缓冲液按1 200-5000稀释冻存。I型鸭肝炎病毒血清抗体ELISA检测试剂盒，其检测程序为
(1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
(2)将待检血清用样品稀释液作1 100稀释，按100 μ L孔加入抗体检测板中，同时设只 加IOOyL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I型鸭肝炎病毒标准阳性血清作 为阳性对照，37 °C孵育60分钟，甩干；
(3)每孔加洗涤液200μ L洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；
(4)每孔加100μ L的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37°C孵育 30分钟，甩干；
(5)每孔加洗涤液200μ L，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；(6)依次加入50μ L底物TMB显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育10分钟；
(7)加50μ L终止液(2MH2S04)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值 (0D450nm)。I型鸭肝炎病毒血清抗体ELISA检测试剂盒，其检测样本的判定标准为
以待测样本0D450nm值与标准阴性0D450nm值的比值(P/N)，大于或等于3判为阳性， 小于或等于1. 5为阴性，介于1. 5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2. 0判 为阳性，小于2.0为阴性。本发明是通过构建一个在原核细胞中表达的高效重组表达质粒，利用重组表达质 粒的表达产物为抗原，研制检测I型鸭肝炎病毒血清抗体的ELISA试剂盒，专用于I型鸭病 毒性肝炎的检测、流行病学调查和免疫监测。本发明试剂盒操作简单，人人都可操作，能较 好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等， 易于大范围推广应用。本发明ELISA试剂盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免 疫监测等方面具有很重要的应用价值，可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治， 因此具有广阔的市场情景和较大的经济、社会效益。本发明的特点和优点如下
(1)特异性强，敏感性高，安全性好
本发明重组VPl蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与相应亚型I型 鸭肝炎病毒阳性血清特异结合，不与鸭其它疫病阳性血清发生交叉反应，具有良好抗原性， 因此具有很高的特异性和敏感性，重组表达载体pET32a-VPl的表达产物具有良好的抗原 性；
(2)操作简便快速、结果判定准确
使用I型鸭肝炎病毒血清抗体检测试剂盒检测I型鸭肝炎病毒血清抗体时，无需另配 其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明书在1-2小时内即可判定检测结果，ELISA检 测试剂盒以显色的深浅显示检测结果，即检测孔出现蓝色显色为阳性，中止后成黄色，无色 为阴性，采用酶标仪机读数，减少主观性，准确可靠；
(3)成本低，制备简单 I型鸭肝炎病毒血清抗体ELISA检测试剂盒可批量检测，基因工程菌株BL21 (DE3) (pET32a-VPl)表达的VPl蛋白表达量很高，可占菌体蛋白60%以上；重组VPl蛋白以可溶 性形式存在于菌体内部，收集和纯化比较方便；同时纯化的重组VPl蛋白不需要进行蛋白 复性可用于ELISA试剂盒的研制。I型鸭肝炎病毒结构蛋白VPl位于DHV-I基因组的2103-2816位，VPl全基因由 714个核苷酸组成，编码238个氨基酸。3D位于DHVl基因组的6012-7373位，VPl全基因 由1362个核苷酸组成，编码454个氨基酸。VPl蛋白大部分暴露在病毒的里面，是决定病毒 抗原性的主要成分，VPl蛋白是主要结构蛋白，含有可诱导T、B淋巴细胞反应的多个抗原表 位，能诱导机体产生保护性的中和抗体。本发明利用PCR技术从I型鸭肝炎病毒基因组中扩增出VPl基因，构建了含VPl基 因的重组表达质粒pET32a-VPl，该质粒转化入宿主菌BL21 (DE3)，体外表达VPl蛋白经镍 柱亲和层析纯化后作为抗原，建立间接ELISA检测方法，并优化ELISA的反应条件形成检测 试剂盒，该试剂盒可在DVH-I的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。
图1 VPl基因的PCR扩增及重组表达质粒pET32a_VPl的鉴定图谱；
泳道1为DL2000Marker ；泳道2为VPl基因的PCR扩增产物；泳道3为pET32a_VPl/ EcoKl、Xba \ 双酶切；泳道 4 为 DL15000Marker ；
图2为重组VPl蛋白SDS-PAGE电泳及western-blot分析；
泳道1为低分子蛋白Marker ；泳道2为大肠杆菌BL21 (重组质粒pET32a_VPl)诱导表 达产物；泳道3为大肠杆菌BL21 (空质粒pET32a)诱导表达产物；泳道4为重组VPl蛋白 western-blot结果；泳道5为重组VPl蛋白western-blot结果；大肠杆菌BL21 (空质粒 pET32a)诱导表达产物western-blot结果；
图3为灭活疫苗免疫鸭体内抗体的动态变化。
具体实施方式
1、引物设计
根据GenBank发表的DHV-I的VPl基因序列(序列号EF653378)，利用DNAStar软件 分析，设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶切位点^oTPI和损al及保护性碱基 (Takara公司合成)，下划线部分为酶切位点。上游引物P1 5 ‘ -CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3 ‘ EcoRl 下游引物 P2 5 ‘ -GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3 ‘ Xba I
2、VP1基因的PCR扩增
PCR 反应条件94°C预热 5min，94°C变性 lmin，55°C退火 30sec，72°C延伸 50sec，30 个 循环，最后一个循环后再延伸10分钟。将PCR产物经含有溴化乙锭(EthidiumBromide，EB) 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒(大连TaKaRa公司)使用说 明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定约714bp大小片段即为VPl基因(图1)。3、表达VP1基因的基因工程菌株构建
用EcoRl和损al对VPl基因和质粒载体pET_32a进行双酶切，并置于37°C水浴作用 2h，酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的 VPl基因和pET-32a载体按1 :3的摩尔比4°C过夜连接。取连接产物加入含有100 μ L感受 态DH5ci的聚丙烯离心管中，轻轻混勻后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42°C 热休克90sec，然后立即冰浴2min。加入800 μ L37°C预热的LB培养基，于37°C振摇(100 150rpm) 45min。取100 μ L菌液均勻涂布含氨苄青霉素(Amp) 50 μ g/ml的琼脂LB平板，在 37°C正置20min后，倒置培养16 20h。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对 提取质粒进行^boTPI和损al双酶切鉴定。以酶切出现714bp左右大小DNA片段的质粒为 阳性质粒(图1)。并将阳性质粒命名为pET32a-VPl。送上海Invitrongen公司测序。采用 CaCl2转化法，将重组质粒pET32a-VPl转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)中，筛选阳性克隆，即 为基因工程菌株。4、VP1蛋白的诱导表达与免疫转印
挑取基因工程菌株单菌落接种到盛有3mlLB液体培养基(50μ g/ml氨苄青霉素)试管 中，于37°C振摇培养过夜，第二天从中取出一定量的菌体加到另一盛有3mlLB液体培养基 中，使菌体浓度达到OD6tltl ^ 0. 1，37°C振摇培养2、小时，当菌体浓度0D_ ^ 0. 4-0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达4 6h，每隔1小时收集100 μ L菌液。4000rpm，离 心lOmin，收集菌体，将收集的菌体用100 μ LPBS重悬后，加等体积的2 X SDS凝胶加样缓冲 液(100mmol/LTris Cl(pH6. 8) ；200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT) ；4%SDS (电泳级)；0. 2% 溴 酚蓝；20%甘油)，100°C煮沸5min以使蛋白质变形，取10 μ L加样进行SDS-PAGE凝胶电泳， SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册。表达产物诱导3小时即可产生分 子量约为43KD的目的条带(图2)。取3小时的培养物超声波处理，12，000r/min、4°C离心 5min分离上清和沉淀，用10%SDS-PAGE鉴定，表达蛋白以可溶性形式存在于菌体内部。并进 行转印，然后以鸭抗DHV-I血清为一抗，HRP标记的兔抗鸭IgG为二抗作免疫转印鉴定，最 后用DAB显色试剂盒显色，在醋酸纤维素膜上可见目的条带(图2)。5、VP1表达蛋白纯化及蛋白浓度测定
将诱导表达的菌液于12000rmp离心IOmin收获沉淀，以洗涤液(5mM咪唑，0. 5MNaCl, 20mMTris-HCl,pH7. 9)重悬菌体，后经超声波裂解lOmin，随后12000rmp离心IOmin收获包 涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达。将此上清用蛋白质Ni 柱亲和层析进行纯化，具体操作过程可参照Novagen公司His -bindpurif icationkit的说 明书，VPl表达蛋白经镍柱纯化后，测定该蛋白浓度。6、VP1表达纯化蛋白ELISA试剂盒的研制 6. 1、ELISA试剂盒的组成成分和最佳反应条件
1)抗原最佳包被浓度用PH8.5的0. 05MTris-HCl缓冲液作包被液，将上述基因工程 表达的VPl蛋白稀释为10yg/mL，按IOOyL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，
2)洗涤液PBST/Tween-20(NaCL8g, Na2HP0412H203. 6g, KCLO. 2g, KH2PO4O. 2g, Tween-200. 5mL，去离子水 IOOOmU
3 )最佳封闭液1%牛血清白蛋白(BSA)。4)血清稀释液0. OlM 的 PBS (NaCL8g, Na2HP0412H203. 6g, KCLO. 2g, KH2PO4O. 2g, Tween-200. 5mL，去离子水 IOOOmL), PH7. 2
5)血清的最佳稀释浓度100倍稀释
6)血清与抗原的结合时间60分钟
7)酶标二抗的最佳稀释浓度和反应时间2000倍稀释，30分钟
8)显色系统称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用IOOmL无水乙醇或DMSO溶解后，以双 蒸水定容至IOOOmL,配制显色液A ；称取21g无水柠檬酸，28. 2g无水磷酸氢二钠(Na2HPCM)， 6. 4mL0. 75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至IOOOmLdM PH值到4. 5-5. 0，配制显色液B;
9)终止液2MH2S04。6. 2、ELISA的操作程序
(1)将10X浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
(2)将待检血清用样品稀释液作1 100稀释，按100 μ L孔加入抗体检测板中，同时设只 加IOOyL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I型鸭肝炎病毒标准阳性血清作 为阳性对照，37 °C孵育60分钟，甩干；
(3)每孔加洗涤液200μ L洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；
(4)每孔加100μ L的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37°C孵育 30分钟，甩干；(5)每孔加洗涤液200μ L，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；
(6)依次加入50μ L底物TMB显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育10分钟；
(7)加50μ L终止液(2MH2S04)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值 (0D450nm)。6. 3、判定标准的确定
以待测样本0D450nm值与标准阴性0D450nm值的比值(P/N)，大于或等于3判为阳性， 小于或等于1. 5为阴性，介于1. 5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2. 0判 为阳性，小于2.0为阴性。6. 4、保存期试验
按照上述ELISA确定的条件，抗原包被、封闭后，分别在4°C和-20°C保存，于不同时间 取出进行ELISA试验，包被ELISA板的保存期在4°C可保存6个月，而在_20°C可保存12个 月。7、本发明ELISA试剂盒的使用说明书
1)加入100倍稀释液好的血清样品，100 μ L/孔，每次设阳性、阴性和空白对照，37°C 孵育60分钟，取出洗涤5次，每次1分钟；
2)加酶标记的二抗，100μ L/孔，37°C孵育30分钟，取出洗涤5次，每次1分钟；
3)依次加入50μ L底物TMB显色液A和50 μ L显色液B，37°C孵育10分钟，2M的浓硫 酸终止反应，50 μ L/孔，酶标仪测吸光值(波长450nm)；
4)以待测样本0D450nm值与标准阴性0D450nm值的比值(P/N)，大于或等于3判为阳 性，小于或等于1. 5为阴性，介于1. 5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2. 0 判为阳性，小于2.0为阴性。8、ELISA试剂盒的应用
8. 1、ELISA试剂盒检测I型鸭肝炎病毒灭活疫苗鸭血清样品
I型鸭肝炎病毒灭活苗免疫20只7日龄健康雏鸭(试验前检测I-DHV抗体阴性)，收集 免疫后0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d血清；在结果显示I-DHV抗体阴性的10日龄鸭经 免疫接种后5天ELISA就可以检测到相应的抗体，25天后OD值下降，表明本发明的ELISA试 剂盒中VPl纯化的表达蛋白具有良好的抗原性，能特异性地检测到免疫鸭血清中的抗VPl 抗体(图3)。8. 2、ELISA试剂盒检测临床血清样品
应用本发明所研制的试剂盒对来自河南、山东、江苏等地发病鸭群的2100份鸭血清 进行了 I型鸭肝炎病毒血清抗体的检测，结果检出抗体阳性鸭血清1839份，为了进一步检 测该方法的特异性和敏感性，我们先后从抗体阳性鸭中随机抽取了 200份发病肝脏，通过 9-11日龄鸭胚进行了病毒的分离鉴定。结果，200份从发病的肝脏分离物通过RT-PCR试验 检测证明均为病毒阳性，二者的符合率达100%。说明本发明的试剂盒在实际应用中具有良 好的特异性和敏感性。同时也表明本发明所研制的试剂盒可以检测I型鸭肝炎病毒感染， 可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治，本试剂盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、 流行病学调查和免疫监测等方面具有重要的应用价值。
权利要求
一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，包括经重组VP1蛋白包被的酶标板，辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鸭IgG抗体，TMB底物显色液，阳性血清，阴性血清。
2.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特 征在于所述的包被酶标板所用的抗原即重组VPl蛋白是由基因工程菌株BL21体外诱 导表达获得，该菌株含表达质粒pET32a-VPl，重组表达质粒pET32a_VPl含有大肠杆菌 复制子ori、启动子PT7、外源VPl基因和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因，其表达式 为-ori-PT7-VPlgene-Ampgene-。
3.根据权利要求2所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在 于，其重组表达质粒pET32a-VPl的构建中，设计并合成的一对特异性引物为上游引物 P1 5 ‘ -CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3 ‘下游引物 P2 5 ‘ -GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3 ‘。
4.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在 于所述的阳性血清为经I型鸭肝炎病毒VPl蛋白免疫获得的I型鸭肝炎病毒标准阳性血 清，0D450nm 彡 1. 00。
5.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在 于所述的阴性对照为经筛选获得的鸭标准阴性血清，0D450nm ^ 0. 100。
6.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在 于辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鸭IgG抗体的制备方法为(1)用超纯水配制辣根过氧化酶HRP溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4°C避光1_2小 时，加入160mM乙二醇，室温反应30-60分钟，加入pH4. 4的醋酸缓冲液2_8°C透析过夜，换 液两次；(2)将纯化的兔抗鸭IgG加入步骤(1)经活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mMpH9. 6 的碳酸缓冲液中透析，4°C搅拌过夜，换液两次；(3)透析液吸至离心管中，加0.05M硼氢化钠溶液，4°C反应1-2小时，加入等量的饱 和硫酸铵溶液4°C放置30-60分钟，4°C 4000rpm离心10-20分钟，弃上清，将沉淀溶于少量 PBS，装入透析袋中，对0. 02MPBS (pH7. 4)透析，4°C过夜；(4)收集透析袋中液体，4000rpm离心10-20分钟，上清液即为辣根过氧化酶标记的兔 抗鸭IgG多克隆抗体，将其与等量甘油混合，-20°C保存。
7.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在 于所述的TMB底物显色液包括显色液A和显色液B。
8.根据权利要求7所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在 于所述的显色液A的配制方法如下200mg四甲基联苯胺(TMB)，用IOOmL无水乙醇或DMSO 溶解后，以双蒸水定容至IOOOmL,配制成显色液A ；所述的显色液化B的配制如下称取21g 无水柠檬酸，28. 2g无水磷酸氢二钠(Na2HP04)，6. 4mL0. 75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至 IOOOmL,调PH值到4. 5-5. 0，配制成显色液B。
9.如权利要求1一8中任一条所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒 的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)将待检血清用样品稀释液作1 100稀释，按100 μ L孔加入抗体检测板即经重组VPl 蛋白包被的酶标板中，同时设只加IOOyL样品稀释液的空白、鸭标准阴性作为阴性对照、I 型鸭肝炎病毒标准阳性血清作为阳性对照，37°C孵育60分钟，甩干；(3)每孔加洗涤液200μ L洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干； (4)每孔加100μ L的辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体，空白不加，37°C孵育 30分钟，甩干；(5)每孔加洗涤液200μ L，洗涤5次，每次间隔1分钟，拍干；(6)依次加入50μ L底物TMB显色液A和50 μ L显色液B，37°C避光孵育10分钟；(7)加50μ L终止液(2MH2S04)，用酶标仪在450nm波长下读取每孔 (8)以待测样本0D450nm值与标准阴性0D450nm值的比值(P/N)，大于或等于3判为阳 性，小于或等于1. 5为阴性，介于1. 5-3之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2. 0 判为阳性，小于2.0为阴性。
10.如权利要求1一8中任一条所述的I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂 盒在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，同时还涉及一种该试剂盒的检测方法和应用，其中试剂盒包括经重组VP1蛋白包被的酶标板、辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG抗体、TMB底物显色液、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。本发明利用聚合酶链反应从DHV-1基因组中扩增出VP1基因，构建了含VP1基因的重组表达质粒pET32a-VP1，该质粒转化入宿主菌BL21(DE3)，体外表达VP1蛋白经镍柱纯化后作为抗原，建立酶联免疫吸附试验检测试剂盒，阳性血清为I型鸭肝炎病毒标准阳性血清，阴性对照为鸭标准阴性血清。检测试剂盒特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。
文档编号C12N15/51GK101839917SQ20101017552
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者吴庭才, 廖成水, 张春杰, 李银聚, 牛明福, 王臣, 程相朝, 赵战勤 申请人:河南科技大学