专利名称：用于鸭颈长性状筛选的微卫星标记、其检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及鸭颈长性状筛选的微卫星标记、其检 测试剂盒及应用。
背景技术：
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。分子标记是以个体 间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与 其他几种遗传标记一形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优 越性有大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分 子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析； 分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁； 检测手段简单、迅速。微卫星DNA(Microsatellite DNA)是近几年发展起来的一种新的分子标记。微卫 星又称为简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSR)，一般由1-6个核苷酸重复序列 所构成的核心序列与其两侧的侧翼序列构成。每个微卫星标记的微卫星DNA片段的重复数 约为几次到几十次。微卫星DNA序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，基因的间隔区和内含子以 及外显子和调控区均有微卫星的分布(黄海根，1995)。有文献报道，在染色体中除着丝粒 及端粒区域外，其它区域均广泛散在分布有微卫星位点(Winter et al.，1992)。不同物种 中，微卫星序列的含量各不相同，真核生物平均每50-150kb就存在一个微卫星位点(Tautz et al.，1989)，人类基因组中每间隔6kb存在一个微卫星位点，鸟类基因组中则每间隔 20-39kb存在一个微卫星位点(Primer etal.，1997)。并且各种微卫星序列的丰度在不同 物种中也各不相同。例如，在人类及哺乳类动物基因组中，最丰富的微卫星序列是(AC)n; 而在植物基因组中则以(AT)n最多(Wang et al.，1994)。在真核生物基因组中，二核苷酸 微卫星序列最为丰富，三核苷酸微卫星的序列含量比二核苷酸微卫星序列大约低10倍，而 四核苷酸微卫星的微卫星序列则相对较少(Ma et al.，1996)。微卫星的核心序列一般不转录，因为这些极其简单的核苷酸顺序上缺少转录所必 需的启动子。侧翼序列使某一微卫星特异定位在染色体的一定位置，核心序列重复数的差 异是形成微卫星多态性的基础，由于不表达的序列不受选择压力，因而它们的演化比表达 的序列快得多，以至于在一个品种内能够积累出显著数目的序列多态性。与其它分子标记相比，微卫星标记具有以下特点(1)广泛随机分布于真核生物 基因组中，外显子和内含子皆有分布；(2)可根据微卫星两侧的保守性侧翼序列设计引物， 通过PCR扩增检测其多态性；(3)高度多态，信息含量高；(4)进化上分离时间短的物种间 微卫星侧翼序列保守性较高，如Reed等用鸡的特异性微卫星引物扩增火鸡基因组，54%的 引物具有PCR扩增产物(Reed et al.，2000) ； (5)共显性遗传；(6)微卫星的序列一般较 短，即使是部分降解的DNA也可能有足够用来扩增的微卫星序列，这一点更优于RAPD和更
3长目的基因序列的VNTR，因而在古DNA的研究及法医学鉴定中具有重要的应用价值；(7)随 着毛细管电泳技术及相关技术的发展，全自动化的大规模基因型分析已成为可能。因而，自 1974年Skirmer等首先发现微卫星以来(Skinner et al.，1974)，该标记被广泛应用于生 物进化、遗传学鉴定、种质资源分析及遗传图谱的构建、功能基因和数量性状的定位等研究 (张天真等，2001 ；樊斌，1999 ；况少青，1997 ;Heyen et al.，1997，Schnabel et al. ,2000, Rosenberg et al.,2001)o家畜的体型外貌不仅是一定生产力的直接表征，而且也是发育情况、健康状况和 结实度的外表反映，在育种工作中有着极其重要的意义。通过体尺测量，可以鉴定品种特征 和个体间的差异，判断家畜的生产力和经济价值，估计家畜的生物学效率。而颈长性状作为 体尺性状中的重要一项，是畜牧业生产中重要的经济性状之一，也是鸭品种选育中的重要 指标。利用微卫星标记与某些功能基因或QTL间的连锁关系，可将一些功能基因或QTL 定位在染色体或连锁群中。特别在数量性状基因位点的定位上，微卫星标记有望将控制家 禽某一数量性状的微效多基因剖分成不同的QTL，并将它们一一定位到染色体上，通过分析 各QTL的效应和互作关系，可能将发现更多的新结构基因和功能基因，或许对数量性状的 研究也有所突破。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鸭颈长性状筛选的微卫星标记、其检测试剂盒及应用。本发明利用已构建的鸭微卫星富集文库和遗传图谱，进行颈长性状标记-QTL的 定位。在构建的遗传图谱基础上，应用包含在16个连锁群的85个多态标记信息，利用Haley 回归区间定位法对F2资源群进行颈长性状的标记-QTL区间分析，进行QTL检测和效应估 计。所有的分析在http://latte. cap. ed. ac. uk网站通过在线进行。分析采用固定模型， 考虑家系、性别、批次三个固定效应，颈长性状用体斜长为协变量。模型见公式y = μ+P(QlM) [CaiA+CdiD] +e其中μ为群体平均数；P(Q|M)为已知标记基因型时，QTL标记基因型的概率；Cai为群体中第i个个体在给定座位的加性组分的回归系数；A为QTL的加性效应；Cdi为群体中第i个个体在给定座位的显性组分的回归系数；D为QTL的显性效应；e为残差效应。结果发现，由引物SEQ ID No. 2&3标志的QTL显著作用于7周龄的颈长。进而，本 发明提供用于鸭颈长性状筛选的微卫星标记，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明进一步提供用于扩增权利要求1所述微卫星标记的引物。在本发明优选的 实施方案中所述引物序列为Pf GAAAGAATGAGTTAAAAAGGCA,Pr :TGAGGCTTAATTGGTGGACA。
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进一步，本发明还提供含有上述引物的试剂盒。该试剂盒还进一步包括以下试剂 中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本发明微卫星标记及试剂盒可用于鸭的辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早 期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。CAU资源家系由中国农业大学李宁教授课题组建立的用于定位研究影响鸭重要 经济性状QTL、寻找克隆主效基因的F2杂交实验群体，亲本为北京鸭。实施例1、鸭颈长性状的QTL定位在CAU资源家系中测定F2代个体7周龄的颈长及体斜长，以体斜长为协变量进行 QTL回归区间定位分析，显著性均为Chromosome wide的显著水平。模型见公式y = μ +P (Q | M) [CaiA+CdiD] +e其中μ为群体平均数；P(Q|M)为已知标记基因型时，QTL标记基因型的概率；Cai为群体中第i个个体在给定座位的加性组分的回归系数；A为QTL的加性效应；Cdi为群体中第i个个体在给定座位的显性组分的回归系数；D为QTL的显性效应；e为残差效应。QTL回归区间定位结果表明，7周龄颈长受12号连锁群QTL的影响。表1. 7周龄颈长QTL位点的分布
加性效应显性效应性状连锁群 位置(cM)F值似然率LOD值显著水平置信区间估计值标准误估计值标准误颈长12 7.65. 009. 772. 12* -3.461. 101. 42 1. 8291. 0备注“*”表示显著。实施例2微卫星位点DNA基因型测定一、禽血的采取及处理于昌平南口种鸭厂采集到15个家系共约650个个体的纯种北京鸭血液样品，翅静 脉采血，每一个体采取0. 5ml血样，加入0. 2ml抗凝剂，充分混勻。常温带回实验室后，以 1 9比例加入禽血裂解液，常温裂解抗凝血48小时后-20°C保存备用。二、鸭基因组DNA的提取(1)取0. 4ml裂解血(Iml血液加9ml禽血裂解液)放入1. 5ml离心管中，视情况
5补加TE稀释；(2)加入蛋白酶k至终浓度200 μ g/ml，混勻，55°C水浴消化24_36小时，视情况补 加蛋白酶K，继续消化；(3)加入等体积Tris饱和酚，轻摇lOmim，12000rpm离心IOmin ；(4)将上清转移至新离心管中；(5)用等体积的酚氯仿(1 1)和氯仿各抽提一次；(6)上层水相加入1/10体积乙酸钠(pH5. 2)和2倍体积无水乙醇沉淀DNA，室温 沉淀Imin左右至致密的絮状DNA出现；(7)用干净的Tip枪头把DNA挑出放入新离心管，用70%的乙醇洗涤DNA沉淀两 次，真空抽干后加入100-200 μ 1 TE (ΡΗ8. 0)溶解DNA ；(8)0. 7%的琼脂糖电泳初步检测浓度和纯度，将各样品DNA浓度稀释至20ng/ μ I。三、利用试剂盒检测微卫星位点基因型该试剂盒包括PCR扩增的一对引物，序列见表2中序列；其他PCR扩增试剂；PCR 扩增用Taq DNA聚合酶及其缓冲液。根据OTL定位结果，设计5’端标记有HEX或FAM亚磷酸酰胺荧光基团的引物，引 物信息如表2所示表2.与颈长性状连锁的微卫星标记信息
状上下游引物(5’-3')Tm(°C)表型解释效应值ki(%)颈长例1^)0^八0八八10八0丁丁八从八八00€八58.15.04
TGAGGCTTAATTGGTGGACAPCR反应体系(15 μ 1)
上游引物(IOmM)0. 5μ 1
下游引物(IOmM)0. 5μ 1
dNTP(IOmM)1. 2μ 1
IOXPCR Buffer1. 5μ 1
Taq酶0. 3μ 1
模板(20ng/ μ 1)2. Ομ 1
dd H2O9. Ομ 1
反应条件
开始，94°C 预变性 5min ；中间，94°C，30S ；58°C，30S ；72°C，35S ；共 35 个循环；最
后，72°C延伸7min，4°C保存。反应于96孔板中进行，应做阴性对照。四、基因型分析用灭菌的去离子水稀释PCR产物3-10倍，取1 μ 1稀释产物，加入10 μ 1去离子 甲酰胺，0. 15 μ 1 Genescan-350R0X 或 Genescan-500R0X ，充分振荡混勻后在 3100 测序 仪 GS-RUN-36-P0P4defaultModule 下(D 系统)电泳 36-44 分钟。应用 Genescan 3. 7 及 Genemapperl. 1软件分析PCR扩增片段大小。结果，颈长性状QTL位点的等位基因数为4个，其基因型如SEQID No. 1所示，(重
6复(CTTT)11为其核心序列，对于不同等位基因，其CTTT碱基的数目不同)。实施例3、鸭微卫星标记辅助育种模型的建立来自北京金星鸭业中心的9系北京鸭的先后5批预选留子代及其父母代群体，每 一批预选留子代均有近100个体，公鸭约占1/5，母鸭约占4/5，最终需要选留下各一半个 体。利用现有的鸭分子遗传学研究成果，发明人创建了一种标记辅助育种模式来计算 子代的潜在综合育种值，用公式表示如下
其中，H’代表了父母代的后代与不同生长性状相连锁的微卫星标记位点的潜在基 因型效应值，即综合育种值；m为考虑的经济性状总数；η为与某一性状j相连锁的标记的 总数，如和7周龄颈长相连锁的标记有1个；wj代表某一经济性状指标j所占的权重，如对 于η个不同生长指标中重点参考颈长性状，则对于颈长w取值为η-1，其他5个性状权重为 1，从而保证了颈长性状的决定性作用；kji指与某性状相关的微卫星位点i对此性状j的 表型解释效应值大小，或者称贡献值；Emlji、Em2ji、Eflji, Ef2ji分别是对于性状j，分别 来自父本和母本的第i个位点的等位基因效应值，此效应值是利用黄银花(2007a，2007b) 等在QTL定位时对9个标记位点记录的大量表型和基因型数据，通过SAS中的GLM多元线 性回归分析(考虑性别和批次效应)，得到各等位基因对表型的参数估计值(Estimate)，再 用各估计值占总体估计值的百分比作为各个等位基因效应值。如果有父母代个体在某位点 基因型数据缺失，则计算育种值时采用各等位基因效应值的平均值代替。由此公式计算所 得后代个体中潜在H’值再按从小到大顺序排列，这样初步选留个体又获得了一个育种值排 序号S2。最后的两步方法只需要完成一遍，就可以作为对父母代的每一批子女留种的重要 参考标准。同时，还需要对每一批预选留子代详细记录7周龄颈长数据，为了节约饲养成本， 根据这些测定数据先进行初步筛选，留下超过计划留种数目50%到100%的体重和体型较 大的个体，并根据每个个体的体重大小(重点指标)按从小到大顺序排列获得每个初步选 留个体表型序号Si，以便进行接下来的标记辅助育种筛选。经过上面方法中最终得到了每 个初步选留个体表型排序号Sl和育种值排序号S2。因为所采用的微卫星标记大多为性状 连锁均衡标记，可能在多次传代后与QTL发生分离，故仍结合表型数据予以辅助纠正。这里 给予Si、S2值相同的权重，其加和值S = S1+S2便可以作为最终留种选择的标准。目标是 按照计划选留数目，选择S值较大而且S1、S2值尽量接近的个体，个别S值很大但Sl和S2 相差很远可能是由于实验误差或标记与QTL分离等原因引起，不建议保留这样的个体。另 外降低留种群体的亲缘程度，尽量避免近交，对于全同胞家系个体尽量仅保留公母子鸭各 一只，对于半同胞家系个体尽量仅保留公母子鸭各两只，由此最终完成了标记辅助育种的 全过程。对于经这样筛选后的北京鸭后代群体在基因组水平是否得到了改善，可以比较筛 选前后群体的等位基因频率变化。这里举9系北京鸭第5批后代选育留种结果为例，观察 分子标记辅助育种前后的后代群体各个标记位点优势等位基因(占最大比重的等位基因)
7的频率改变以及内部等位基因数目的改变，如表3中数据所示。可见在仅仅一次分子标记 辅助选种之后，优势等位基因频率得到了提高。 表3.筛选前后9系北京鸭第5批后代在标记位点上优势等位基因频率及等位基 因数的比较
权利要求
用于鸭颈长性状筛选的微卫星标记，其为以下引物的扩增产物PfGAAAGAATGAGTTAAAAAGGCA，PrTGAGGCTTAATTGGTGGACA。
2.如权利要求1所述的微卫星标记，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
3.用于扩增权利要求1所述微卫星标记的引物。
4.如权利要求2所述的引物，其为 PfiGAAAGAATGAGTTAAAAAGGCA, Pr :TGAGGCTTAATTGGTGGACA。
5.含有权利要求3或4所述引物的试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、 DNA 聚合酶、dNTPs。
7.权利要求1或2所述微卫星标记、权利要求3或4所述引物或权利要求5或6所述 试剂盒在鸭选育中的应用。
全文摘要
本发明提供了用于鸭颈长性状筛选的微卫星标记、其检测试剂盒及应用，本发明微卫星标记，是引物对SEQ ID No.2&3的扩增产物，其优势基因型如SEQ ID No.1所示。本发明微卫星标记及试剂盒可用于鸭的辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
文档编号C12N15/11GK101921751SQ20101023497
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者吴非, 李宁, 黄银花 申请人:李宁