专利名称：转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应(pcr)检测方法
技术领域：
本发明涉及对转红色荧光蛋白基因唐鱼特异的检测方法。
背景技术：
唐鱼(Tanich thys albonubes )是一种原产中国广州市白云山附近溪流，我国特有 的小型鲤科鱼类，属于我国二级野生保护动物。由于唐鱼具有独特的观赏价值，现已流传至 世界各地，成为人们喜爱的观赏鱼品种。唐鱼体背棕色或青棕色，体侧有三道色彩条纹谱 带，从上至下分别为金黄或红黄、青铜绿、靛蓝，以金黄或红黄带为主，故其被称为“白云金 丝鱼”。唐鱼不仅具有观赏价值，还因其具有体型小、繁殖周期短、饲养条件要求低、容易在 实验室条件下实现纯化培育、具有连续产卵特性、卵膜透明、胚胎发育可观察等特点，可作 为发育生物学、环境监测的实验动物模型，具有很高的、潜在的科学研究的价值。转红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)基因唐鱼是本实验室利用显 微注射法，将线性化的红色荧光表达载体(pDSRed-mylZ2)注射入唐鱼的受精卵而获得的， 该转基因唐鱼通体红色，颜色均勻、色彩艳丽，是一个具有极大观赏价值和科研究价值的新 品种。随着转基因生物的不断出现和大规模应用，转基因技术及其产品也引发了全世界对 其潜在生物安全问题的广泛讨论和关注。转基因生物安全主要指通过基因工程技术所产生 的遗传工程体及其产品的安全性问题，即指在转基因生物体的实验研究、中间试验、规模化 生产、市场化过程中，因转基因生物体释放、生产、使用和处置的不当，而可能对人类赖以生 存和发展的自然生态环境构成难以估量的风险。评估转基因生物是否安全，主要是从三个 方面看，一是转基因生物的食品安全性；二是从生态上讲是否安全，转基因个体经人为定向 改造后，往往生长更快，或抗病力、抗逆性增强，一旦释放到自然界，可能破坏原有的种群生 态平衡；三是从遗传上讲，如果转基因生物释放到自然界，与野生种交配导致外源基因的扩 散，威胁物种的遗传多样性。转红色荧光蛋白基因唐鱼不作为人类的食用鱼，所以一般不具 有食品安全问题，但如果转基因唐鱼被人为无意识地释放到自然界，是否会引起生态和和 遗传多样性的改变问题，是科研工作者必须关注的问题。建立一种方法，定期抽样检测野生 的唐鱼是否有外源红色蛋白基因的存在，检测实验室中表型特征出现之前的鱼苗是否为转 红色荧光蛋白基因唐鱼，是非常必要的。目前，转基因动物的检测方法有许多种，如整体表型观察法、生物化学性质及生物 活性检测法、DNA-斑点杂交法、Southern杂交法、染色体原位杂交法、Northern杂交法、 RT-PCR法、RNase保护分析法、蛋白免疫技术检测法等。整体表型观察法是从动物整体水平 上观察表现型的改变，分析基因型对动物整体性状和生理功能的影响。转红色荧光蛋白基 因唐鱼目前主要采用的检测方法就是整体表型观察法，但要等到小鱼长到一个月左右，才 能观察到红色，要想更加早期的鉴定就要采取其它有效的检测办法了。红色荧光蛋白的生 物化学性质及生物活性检测方法繁琐，费时费力，不适用于对于转红色荧光蛋白基因唐鱼 的检测。DNA-斑点杂交法在分析基因组DNA时，对样品纯度要求低、简便经济、灵敏度高，但 该方法易出现假阳性。Southern杂交法对样品的质量和纯度要求较高，操作烦琐，费用也较高。染色体原位杂交法可以检测外源基因在染色体上的具体位置，但成本高、操作烦琐，不 适合大批量快速检测的转基因唐鱼要求。Northern杂交法、RT-PCR法、RNase保护分析法 是检测外源红色荧光蛋白mRNA的表达，需求提取RNA，实验操作要求高、步骤烦琐，不适合 转红色荧光蛋白基因唐鱼的检测。蛋白免疫技术检测法要等外源红色荧光蛋白基因经过转 录、翻译成蛋白后，才能检测得到，也不适合转红色荧光蛋白基因唐鱼的早期检测。PCR检测 方法具有所需样品少、灵敏度高、操作简便、检测快速等优点，被广泛应用于转基因动物的 检测。PCR检测方法比DNA-斑点杂交法操作更加简便、易掌握。本实验室根据转红色荧光蛋白基因唐鱼外源红色荧光蛋白基因序列设计引物， 建立了快速、有效的能特异性检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的PCR方法。PCR检测方法比 DNA-斑点杂交法操作更加简便快速、容易掌握。
发明内容
本发明是为了建立一种快速、准确、有效的早期检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的 方法。根据外源的红色荧光蛋白基因序列设计了一对特异性扩增红色荧光蛋白基因的 引物，经过优化反应体系和反应条件，认为退火温度64°C为最适的退火温度，以转红色荧光 蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板扩增出一条487bp的片段，以野生型唐鱼基因组DNA为模 板进行扩增，没有扩增产物。检测同时设有阳性质粒对照和阴性对照。具体检测方法 (一)引物的设计
根据红色荧光蛋白基因序列设计并合成引物如下 Pl 5' -GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGT-3' P2 5'-CTACAGGAACAGGTGGTGGCGG-3'
以转红色荧光蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板预期扩增片段487bp，以野生唐鱼基因 组DNA为模板预期无扩增片段出现。(二)模板DNA的提取
(1)取待检测的整个唐鱼鱼苗或唐鱼的肌肉组织剪碎后，加入0. 5mL的裂解液(10 mmol/L Tris-HCl ；0. 1 mol/L EDTA ；0. 5% SDS ；30mg/L RNase ； 100mg/L 蛋白酶 Κ，ρΗ8· 0)， 55°C消化1小时，其间不时轻轻摇动。(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 :1 )，颠倒混勻，室温下静置5分钟后， 12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转 /分钟离心10分钟，取上清液。(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。(4)用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10 分钟，加入 50μ 1 TE (10mmol/L Tris — HCl ； lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)溶解 DNA, 4°CC存备 用。(三)PCR反应体系
4ddH20
10XPCR Buffer 4XdNTP (10mmol/L)
0. 5μ L
20 μ L 5 μ L
細酶(5υ/μ L) Pl (10ymol/L) Ρ2 (10ymol/L) 模板DNA
0. 2μ L 0. 4μ L 0. 4μ L
(四)PCR反应条件
94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，64 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，32个循环；72°C 延伸7分钟。(五)琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶(含荧光染料)中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外 灯下观察并照相。本检测方法可早期鉴定转红色荧光蛋白基因唐鱼，甚至小鱼在出苗前就可以进行 检测；检测速度快，大约可以在5个小时内完成；在检测时可以设阳性对照(以含有红色荧 光蛋白基因的质粒pDSRed-mylZ2为PCR模板)和阴性对照(以水为模板)，所以检测结果十 分准确；用该方法检测一个样品所需的成本大约为0. 6元，成本低。
权利要求
转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应(PCR)检测方法，其特征是(一)引物的设计根据红色荧光蛋白基因序列设计并合成引物如下P15' GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGT 3'P25' CTACAGGAACAGGTGGTGGCGG 3'以转红色荧光蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板预期扩增片段487bp，以野生唐鱼基因组DNA为模板预期无扩增片段出现；(二)模板DNA的提取(1)取待检测的整个唐鱼鱼苗或唐鱼的肌肉组织剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10 mmol/L Tris HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25241)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；(4)用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用；(三)PCR反应体系ddH2O 20μL10×PCR Buffer 2.5μL4×dNTP(10mmol/L)0.5μLTaq酶(5U/μL) 0.2μLP1 (10μmol/L)0.4μLP2 (10μmol/L)0.4μL模板DNA1.0μL(四)PCR反应条件94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7分钟；(五)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶(含荧光染料)中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相。
全文摘要
转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应(PCR)检测方法，涉及对转红色荧光蛋白基因唐鱼特异的检测方法。根据外源的红色荧光蛋白基因序列设计了一对特异性扩增红色荧光蛋白基因的引物，经过优化反应体系和反应条件，认为退火温度64℃为最适的退火温度，以转红色荧光蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板扩增出一条487bp的片段，以野生型唐鱼基因组DNA为模板进行扩增，没有扩增产物。本检测方法可早期鉴定转红色荧光蛋白基因唐鱼，甚至小鱼在出苗前就可以进行检测；检测速度快；在检测时可以设阳性对照(以含有红色荧光蛋白基因的质粒pDsRed-mylz2为PCR模板)和阴性对照(以水为模板)，所以检测结果十分准确，成本低。
文档编号C12Q1/68GK101906477SQ201010243529
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者于凌云, 全迎春, 叶星, 姜鹏, 李胜杰, 樊佳佳, 白俊杰, 陈敏, 马冬梅 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所