专利名称：类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种类单胺氧化酶C类脱水 酶MaoC基因的分离及其编码的蛋白质制备方法，以及其在制备生物降解物质聚羟基脂肪 酸酯上的应用。
背景技术：
在过去的50年内，石油化工塑料已是应用最多的材料，主要是因为这类塑料具有 多种结构、多种性能，且原材料价格低廉。目前这类塑料产量年增长速度为9. 9%，但给人类 带来了重要的的“能源问题”和“环境问题”。生物降解塑料是近些年发展起来的被全球公认的一种真正绿色环保塑料，易于被 环境中的有机物质代降解，从根本上解决“白色污染”问题。目前全球研发的生物降解塑料 品种已有几十种，其中聚羟基脂肪酸酯(PHA)是其中最为活跃的研究热点。PHA作为一种 “生物可降解塑料”除用于环境友好型包装之外，还可用与热敏胶、压敏胶和水溶胶及拉成 纤维等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作为医用植入材料和可控药物 缓释载体，PHA的寡聚物可作为酮体供体的营养添加剂，PHA的手性单体作为药物或手性合 成的中间体，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分离；PHA合成基因还可用于调节微生物的 新陈代谢，调节微生物于逆境条件下的生存能力，由此可用于改造工业微生物菌株，提高微 生物发酵的效率等。作为生态环境友好型塑料，PHA是最具环保和最具发展前景的绿色塑料 之一，该类塑料的不断开发和应用领域的不断拓宽将会给人类生活带来极其深远的影响。PHA的生物合成是一个受多种酶参与催化、由不同的代谢途径控制的复杂过程。 PHA合成需要酮基硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHA聚合酶。此外，(R)_专一的烯 酰辅酶A水合酶(PhaJ)能通过脂肪酸的氧化提供合成PHA的前体物，它的使用为脂肪 酸在重组菌株中合成PHA提供了有力的工具。
发明内容
基于上述的原因，本发明提供了 1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水 酶(MaoC-like dehydratase, MaoC)基因MaoC及其蛋白质制作技术，以及应用该基因编码 的类单胺氧化酶C类脱水酶在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用，该基因有897 个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子， 通过特异性酶活测定实验，证明了该基因编码的蛋白质具有合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的 生物活性，酶活力达到58. lU/mg。因此，该基因可有效合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，为进一 步应用可生物降解物质即绿色塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技术储备。本发明所提供的类单胺氧化酶C类脱水酶基因，其特征在于其基因序列如Seq ID No 1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子。类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase, MaoC)是最近发现的一种新 乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)，该酶在脂肪酸0 -氧化至PHA的合成过程中提 供(R)_专一的羟烷基辅酶A(R-3-hydr0XyaCyl-C0A)。MaoC已经被证明对底物巴豆酰辅酶 A(Crotonyl-CoA)具烯醇基辅酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性。MaoC因具乙酰辅酶A脱水 酶(Enoyl-CoA hydratase)活性而成为与PHA合成相关的众多酶类成员之一。而本发明所提供的MaoC基因与JGI(jgi/phyCaf7/20609)中的辣椒疫霉全基因组 序列中的MaoC基因氨基酸序列比对，同源性达99. 33%，核苷酸序列有14个碱基的差异，氨 基酸序列有2个氨基酸的差异，这种差异与菌株来源的不同有关，因此本发明所分离获得 的MaoC基因是一个新的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因，本发明提供的有关MaoC基因具有聚 羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶功能特性的信息具鲜明的原创性。为了能够更好的将其应用，发明人提供了一种制备本发明所述MaoC基因及蛋白 的分离制备方法1、基因克隆具体步骤A 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组DNA，备用；B:根据2008年由美国能源部基因研究所(U.S.D印artment of Energy Joint Genomelnstitute-DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得 目的基因(MaoC)序列，设计特异引物(其序列如Seq ID No :3及Seq ID No :4所示)经 PCR克隆获得基因全长；2、制备蛋白质及酶活测定步骤A :MaoC基因原核表达载体构建，目的基因克隆至pET28a(+)载体中；B 将上述重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli (BL21 (DE3))感受态细胞，异 丙基硫代-D-半乳糖苷(Isopropylthio-0 -D-galactoside，IPTG)诱导表达；C 表达产物酶活检测、SDS-GAGE分析及纯化。本发明所用的载体和宿主菌均常见，pET28a(+)为MaoC基因表达载体，E. coli BL21(DE3)为该基因的表达宿主菌。其中由于BL21(DE3)是本领域的惯常写法，因此在权利 要求中未对(DE3)中的括号进行删除，以免造成指代不明确，通过上述方法克隆的基因及其制备的蛋白质，为研究该类基因的功能及其编码的 蛋白质酶活，乃至为聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成提供了一个重要基因及其操作技术，为了 验证其性质，发明人对该基因编码的蛋白质酶活进行了测定，其方法如下MaoC酶活测定是通过测定对底物巴豆酰辅酶A(Cr0t0nyl-C0A)的水解程度， 测定底物的消耗量即263nm波长下紫外吸收值的降低值，活力单位定义为每分钟消耗 lu molcrotonyl-CoA所需的蛋白酶液量(mg)，蛋白酶液浓度测定采用Bradford法。经 过这种方法的检测，结果证明酶活力达到58. lU/mg，证实了其可以对对底物巴豆酰辅酶 A(Crotonyl-CoA)具烯醇基辅酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性，进而可以作为成为与聚羟基 脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate^HA)合成相关的众多酶类成员。基于这种原因，发明人 将其应用于PHA的生物合成。综上所述，本发明提供1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水酶 (MaoC-likedehydratase)基因MaoC及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，通过特异性酶活测定实验，证明了该基因编码的蛋白质具有合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的生物活 性，酶活力达到58. lU/mg。因此，该基因可有效合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，为进一步应用 可生物降解物质即绿色塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技术储备。
图1. MaoC基因重组表达载体示意中Kan为卡那抗性，MCS为多克隆位点，BamH I和EcoR I为双酶切位点，MaoC 为目的基因；图2. MaoC基因PCR扩增示意中1为核酸Marker ；2为扩增出的MaoC基因；图3. MaoC原核表达诱导蛋白示意中 1 为 pET28a (+) -MaoC 重组菌 IPTG 诱导前；2-7 为 pET28a (+) -MaoC 重组菌 IPTG诱导后，诱导出36KDa大小的目的蛋白；8为标准蛋白Marker ；图4. MaoC原核表达产物纯化示意中1为MaoC诱导前阴性对照；2为MaoC诱导后蛋白液超声后上清；3为MaoC诱 导后蛋白液超声后沉淀；4为M-NTA亲和纯化后穿过液；5为纯化后的洗脱蛋白；6为标准 蛋白 Marker o
具体实施例方式本发明所提供的实施例，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York Go Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper, J 等(Blac-kwell 禾斗学出 版社，1988)所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例1 (基因克隆及测序)根据2008年由美国能源部基因研究所(U. S.D印artment of Energy Joint Genomelnstitute-DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得 目的基因(MaoC)序列，设计特异引物(其序列如Seq ID No :3及Seq ID No :4所示)，以 辣椒疫霉基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增步骤如下PCR 反应程序为95°C lOmin ；94°C lmin, 55°C lmin, 72°C lmin,共 35 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。反应体系为:ddH20(32. 5 u L), 10X buffer (5 u L), MgCL2 (4 u L), dNTP (4 u L), MaoC-F (1 u L)，MaoC-R (1 u L)，DNA (2 u L), TaqE (0. 5 ii L)。取10 y L反应产物电泳，确定含有目基因单克隆，送上海博亚生物有限公司测序。 测序结果与辣椒疫霉基因组全序列中的MaoC序列比对，确定目的基因。根据基因全长序列 推测获得相应的氨基酸序列。实施列2 (基因表达)提取表达载体pET28a(+)质粒备用；经PCR扩增后的基因通过琼脂糖凝胶电泳进 行纯化回收后待用。将基因和载体质粒进行双酶切，酶切体系为
权利要求
类单胺氧化酶C类脱水酶基因，其特征在于其基因序列如Seq ID No1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO2所示。
2.如权利要求1所述类单胺氧化酶C类脱水酶基因分离克隆及其蛋白质制备方法，其 步骤如下1)MaoC基因分离克隆的具体步骤A 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组DNA，备用；B 根据已公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得目的基因MaoC 的序列，设计特异引物，其序列如Seq ID No :3及Seq ID No :4所示，经PCR克隆得到MaoC 基因全长序列；2)制备蛋白质的具体步骤A 将MaoC基因原核表达载体构建，目的基因克隆至pET28a(+)表达载体中； B 将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，异丙基硫代-0 _D_半乳糖苷 诱导表达。；C 表达产物酶活性检测、SDS-GAGE分析及纯化。
3.类单胺氧化酶C类脱水酶基因，应用于制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)基因MaoC及其蛋白质制作技术，以及应用该基因编码的类单胺氧化酶C类脱水酶在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用，该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子。
文档编号C12N15/70GK101979589SQ20101029597
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者张修国 申请人:山东农业大学