专利名称：猪流感病毒h3n2和h1n1亚型ha1蛋白重组猪痘病毒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒及其制备方法。
背景技术：
痘病毒基因组结构庞大，大的基因组为很多外来基因的插入提供了空间，作为载体能够接纳大量的外源基因，并使其有效表达(Barbara Ε. Straw, Jeffery J. Zimmerman, Sylvie DjAllairejDavid J. Taylor.. DISEASES OF SWINE. 9TH EDITION. [M])。痘病毒还有良好的免疫原性，能激发宿主产生有效的免疫反应。猪痘病毒不感染其他动物，只感染猪， 在猪体只产生温和性反应，使用比较安全。因此，猪痘病毒是给猪传递免疫原的一种较为理想的载体。重组猪痘病毒疫苗具有弱毒疫苗的抗原增殖能力，使用方便，成本低廉。所以，猪痘病毒是猪专有的基因工程活载体疫苗颇具魅力的候选载体。猪流感(Swine influenza, Si)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病。虽然单纯的猪流感病毒感染表现为发病率高(100% )，死亡率低(约5% )，但猪流感病毒在体内可以感染肺泡巨噬细胞(Jung Τ, Chol C, Chae C. Localization ofSwine Influenza Virus in Naturally Infected Pigs [J], Vet Pathol，2002，39 :10-16.)。肺泡巨噬细胞受损严重影响肺部免疫防御机制，容易引起其它病原菌和病毒的继发感染。另外，由于猪呼吸道上皮细胞既有禽流感病毒又有哺乳动物及人流感病毒的受体，猪成为流感病毒基因发生重组的关键场所(Scholtissek C. Pigs as the "mixing vessel“ for the creation of new pandemic influenzaA viruses [J]. Med Princ Pract，1990，2 :65-71)，在流感病毒的生态学和流行病学中占据重要的地位。目前欧美市场猪流感疫苗是全病毒灭活疫苗，对预防猪流感发挥了重要的作用。但灭活疫苗诱导细胞免疫的能力弱，对异源和异型病毒感染不能提供有效保护，很难有效控制抗原多变的猪流感病毒在猪群中的感染与传播。口蹄疫病毒的非结构蛋白2A具有自身裂解作用，这就保证了位于其两侧的蛋白各自独立发挥其生物学功能。目前，2A蛋白的该特性已被广泛应用于基因工程疫苗、HIV和肿瘤等方面的研究(刘慧娟，金宁一，马鸣潇等.共表达0型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究.中国生物工程杂志，2007，27 (8) :25 28)猪流感病毒H3N2 (A/swine/Guangxi/1/2004 (H3N2))毒株(GenBank 收录号为 FJ157986)和猪流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi))毒株(GenBank 收录号为 EU502884)均是我国猪群中流行的优势毒株(祁贤.我国部分地区猪流感病毒分子流行病学及致病性研究，南京农业大学博士论文.2006. 6,88-130)，HAl蛋白是猪流感病毒的主要表面抗原，可诱导机体产生保护性中和抗体，可用来抵御猪流感病毒的感染。目前还没有构建成共表达猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl基因的转移载体pUSZll/H3-2A-Hl。本发明的另一目的是提供猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。本发明的又一目的是提供该重组猪痘病毒的制备方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl基因的转移载体pUSZll/H3-2A_Hl，该转移载体是将序列为SEQ ID NO. 1所示的由猪流感病毒H3N2毒株HAl基因序列、口蹄疫病毒的2A基因序列和猪流感病毒Hmi毒株HAl基因序列串联组成的H3-2A-H1基因插入猪痘病毒载体pUSZll的B amHI酶切位点所得。一种猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，是由猪痘病毒和所述的转移载体PUSZ11/H3-2A-H1感染、转染PK15细胞，进行同源重组获得的阳性克隆。其中，所述的猪痘病毒优选ATCC保藏号为ATee numberVR-363TM的野生型猪痘病毒WtSPV0所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl 于2011年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201102。该重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-Hl在分类上属于痘病毒科(Poxviridae)，猪痘病毒属 (Suipoxvirus)，猪痘病毒(Swinepox virus)。猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，包括如下步骤(1)根据 GenBank 收录号为 FJ157986 的猪流感病毒 H3N2 (A/swine/ Guangxi/1/2004(H3N2))毒株HAl的基因序列、GenBank收录号为HQ412603 口蹄疫病毒 2A 基因和猪流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi))毒株(GenBank 收录号为 EU502884)HA1的基因序列，自行设计并合成序列为SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因；(2)将所述的序列为SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因插入猪痘病毒载体pUSZll 中，然后通过酶切、测序鉴定和测定正反向，获得所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl 基因的转移载体PUSZ11/H3-2A-H1 ；(3)将猪痘病毒和所述的H3-2A-H1基因的转移载体pUSZll/H3-2A_Hl感染、转染 PK15细胞，进行同源重组获得所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。步骤(2)所述的将H3-2A-H1基因插入猪痘病毒载体pUSZll的具体方法为利用 BamHI分别对步骤(1)所述的序列为SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因和猪痘病毒载体 pUSZll进行单酶切，回收大小为2084bp的H3-2A-H1基因目标片段和大小为8391bp的猪痘病毒载体pUSZll线性大片段，连接两片段，得到重组质粒。经酶切、测序和测定正反向，将测序结果符合目的片段且方向为正向的质粒定名为pUSZl 1/H3-2A-H1。所述的制备方法还包括所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的蚀斑纯化步骤。所述的制备方法还包括利用IFA和Western-blot技术对所述的猪流感病毒H3N2 和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒进行表达鉴定的步骤。所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒在制备预防和/或治疗猪流感病毒H3N2和Hmi亚型感染的药物中的应用。
有益效果本发明首次同时将猪流感病毒H3N2和Hmi的HAl基因插入到猪痘病毒载体 PUSZll中获得重组载体PUSZ11/H3-2A-H1，该质粒筛选标志LacZ基因前带有痘苗病毒启动子P11，进行同源重组后蓝斑非常明显，利于筛选和纯化。本发明首次提出了用猪痘病毒载体构建猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。试验证明，本发明构建的猪流感病毒(H3N2和H1N1)重组猪痘病毒能够稳定表达外源蛋白，而且其效价稳定，种毒的毒价稳定在107TCID5Q/mL。通过动物试验证明rSPV/ H3-2A-H1能诱导小鼠产生显著的体液免疫和细胞免疫反应，能保护豚鼠和猪抵御猪流感病毒H3N2和Hmi的攻击。重组猪痘病毒不感染其他动物，只感染猪，在猪体只产生温和性反应，使用比较安全。重组猪痘病毒疫苗具有弱毒疫苗的抗原增殖能力，使用方便，成本低廉。所以，猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-Hl在猪流感(H3N2和Hmi亚型)的防制方面具有广阔的应用前景。生物材料保藏信息猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl于2011年1 月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO V201102。
图l、pSPl质粒图谱。图2、猪痘病毒转移载体pUSZll/H3-2A-Hl的构建示意图。图3、合成的H3-2A-H1基因BamHI酶切电泳图，M =Marker, 1 :Η3-2Α_Η1 基因 BamHI 酶切产物。图4、猪痘病毒载体pUSZIlBamHI酶切电泳图，M =Marker, 1 猪痘病毒载体pUSZll BamHI酶切产物。图5、重组质粒的酶切鉴定电泳图，M =Marker, 1 重组质粒BamHI酶切产物。图6、重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl的蓝斑筛选、纯化照片。图7、IFA鉴定图片，A、C、E为用H3N2阳性血清作一抗；B、D、F为用Hmi阳性血清作一抗；A、B 感染重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-Hl的H(15细胞，有明显的荧光；C、D 感染野生型猪痘病毒的H(15 细胞，没有荧光；E、F 未接种病毒的H(15细胞，没有荧光。图8、Western-blot鉴定(用H3N2阳性血清作一抗)图片；1 =Marker, 2 感染重组猪痘病毒的H(15细胞，3 感染野生型猪痘病毒的H(15细胞。图9、Western-blot鉴定(用Hmi阳性血清作一抗)图片；1 =Marker, 2 感染重组猪痘病毒的H(15细胞，3 感染野生型猪痘病毒的H(15细胞。图10、免疫后小鼠血清猪流感病毒(H3N2)中和抗体变化。
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图11、免疫后小鼠血清猪流感病毒(HlNl)中和抗体变化。图12、免疫后小鼠猪流感病毒(H3N2)特异的淋巴细胞增殖检测结果。图13、免疫后小鼠猪流感病毒(Himi)特异的淋巴细胞增殖检测结果。图14、猪流感病毒(H3N2)刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。图15、猪流感病毒(HlNl)刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。图16、猪流感病毒(H3N2)刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。图17、猪流感病毒(HlNl)刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。图18、豚鼠肺脏组织病理变化；A :rSPV/H3 免疫，H3N2 攻毒；B :rSPV/H3 免疫，HlNl 攻毒；C :wtSPV 免疫，H3N2 攻毒；D =WtSPV免疫，HlNl攻毒；E :PK15免疫，Η3Ν2攻毒；F :ΡΚ15免疫，HlNl攻毒。图19、猪攻毒(Η3Ν2)后鼻腔排毒情况检测结果。图20、猪攻毒(HlNl)后鼻腔排毒情况检测结果。图21、猪流感病毒(Η3Ν2)刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。图22、猪流感病毒(HlNl)刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。图23、猪肺脏组织病理变化，A :rSPV/H3 免疫，H3N2 攻毒；B :rSPV/H3 免疫，HlNl 攻毒；C :wtSPV 免疫，H3N2 攻毒；D =WtSPV免疫，HlNl攻毒；E :PK15免疫，Η3Ν2攻毒；F :ΡΚ15免疫，HlNl攻毒。
具体实施例方式实施例1猪痘病毒转移载体PUSZ11/H3-2A-H1的构建1. 1猪痘病毒载体pUSZll的构建pUSZll质粒(黄冬艳构建)图谱如图2所示，全长为8391bp ；pUSZll质粒中的LF 为左边的猪痘病毒同源重组臂，和猪痘病毒Kasza株的12121-13268bp处同源。以野生型猪痘病毒wtSPV(购自ATCC，保藏号为ATGG numberVR-363TM，下同)基因组DNA为模板， 以一对引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3进行PCR，然后用EcoR I和Kpn I酶切扩增产物， 把LF(SEQ ID NO. 4，1148bp)克隆到pUC19中；pUSZll质粒中的RF为右边的猪痘病毒同源重组臂，和猪痘病毒Kasza株的13457-14831bp处同源。同样以wtSPV基因组DNA为模板， 用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6进行PCR，然后用SalI和Hind III酶切扩增产物把 RF(SEQ ID N0. 7,1375bp)克隆进上述的pUC19中，形成pUSOl质粒。以pSPl (图1)质粒 (Junghyun Hahn, Se-Hoon Park, Jae-Young Song, et al. Construction of recombinant swinepoxviruses and expression of the classical swine fever virus E2 protein Journal ot Virological Methods 93 (2001) 49-56)为模板，用引物对PllZS :SEQ ID NO. 8 和P11ZX:SEQ ID NO. 9 (其中带有痘苗病毒的启动子Pll)，把LacZ基因克隆到载体pUSOl 的BamHI和SalI位点间，其余序列为pUC19框架序列。由此形成猪痘病毒载体pUSZll (图 2)。1. 2H3-2A-H1基因的合成、克隆和猪痘病毒转移载体pUSZll/H3-2A_Hl的构建根据猪流感病毒H3N2 (A/swine/Guangxi/1/2004 (H3N2))毒株 HAl 的基因序列(GenBank收录号为FJ157986)、GenBank收录号为HQ412603的口蹄疫病毒(0/ΥΜ/ YN/2000) 2A 基因和猪流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (HlNl))毒株(GenBank 收录号为EU502884) HAl的基因序列，自行设计并合成序列为SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因(前加BamHI酶切位点、痘苗病毒Pl 1启动子序列、启始密码子和将654位A替换成T (破坏BamHI位点)的H3N2的HAl基因、口蹄疫病毒的2A基因和将534位由A替换成T (破坏 EcoRI位点)的Hmi的HAl基因，后加终止子TAATAA和BamHI酶切位点)，该H3-2A-H1基因片段长度为2090bp，委托上海Invitrogen公司合成，并将其插入pUC19的BamHI酶切位点ο将含H3-2A-H1合成基因的pUC19载体和猪痘病毒载体pUSZll分别用BamHI单酶切。酶切体系如下10 μ L BamHLlOyL IOXK Buffer，50 μ L质粒，30 μ L无菌双蒸水，共 100 μ L0 30°C作用 4h。酶切完毕后，用的琼脂糖凝胶电泳，H3-2A-H1片段大小为2084bp (图3)、 PUSZll片段大小为8391bp (图4)，然后用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收。方法按试剂盒说明。再用连接酶连接，将其插入猪痘病毒载体pUSZll(图2)中。连接体系如下10. O μ LH3-2A-H1酶切回收产物，1. O μ L载体pUSZll酶切回收产物，1. O μ L 10XT4DNALigase,2. Ομ L IOXDNALigase Buffer，用无菌双蒸水补足总体积 20. O μ L。混勻后16°C连接16h。同时设定载体自身连接对照。1. 2. 1大肠杆菌DH5 α感受态细胞的转化和重组质粒的小量提取取连接产物按常规方法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(购自TIANGEN BIOTECH, 下同)，然后涂布于100 μ g/mL氨苄青霉素抗性平板上，37°C培养约24h。挑取外源基因与载体连接产物转化所涂布抗性平板上的单个菌落，接种于3. OmL的含50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 培养基中，180rpm 过夜振荡培养。根据 Geneaid Biotech 的 High-Speed Plasmid Mini Kit小量提取重组质粒，保存于_20°C。1. 2. 2重组质粒的鉴定酶切鉴定采用单酶切的方法进行鉴定。酶切反应体系为20 μ L =IyLBamHIJyL IOXK Buffer，10 μ L质粒，7 μ L无菌双蒸水。30°C水浴4h。产物用的琼脂糖凝胶电泳分析(图5)。的琼脂糖凝胶电泳证明酶切片段大小与预期结果一致。测序鉴定将酶切鉴定为阳性的重组质粒送Invitrogen公司双向测序，并用NCBI BLAST将所测得的序列及其推导的氨基酸序列与GenBank数据库中的猪流感病毒(H3N2和 H1N1)HA1基因以及口蹄疫病毒的2A基因的核苷酸和蛋白质进行同源性比较，再用Vector NTI和DNAstar软件进行基因的限制性内切酶和阅读框分析，证明我们所克隆入的基因与目的基因的同源性为100%，而且克隆入的基因完全符合载体阅读框要求。将测序结果符合目的片段且方向为正向的质粒定名为PUSZ11/H3-2A-H1 (图2)。实施例2猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的构建与鉴定2. 1感染与转染 在6孔板中用无抗生素MEM(购自TIANGEN BIOTECH，下同)营养液培养PK15细胞 (购自ATCC，ATCC Number:CCL-33TM，下同)至形成单层，弃营养液；以0. 02M0I的野生型猪痘病毒wtSPV感染，37°C作用2h，其间摇动3次，弃感染液，用洗液洗1次，每孔加入2mL 无抗生素维持液。取10 μ L脂质体(Invitrogen公司产品)加入至250 μ L无血清MEM中， 轻轻混勻，置室温5min将4 μ g鉴定好的质粒pUSZl 1/H3-2A-H1加入至250 μ L无血清ΜΕΜ，轻轻混勻。将两管混勻，置室温下作用20min，将复合物加到6孔板中，来回摇晃混勻。37°C 作用他后弃转染液，加入2. 5mL/孔无抗生素维持液，37°C培养至出现明显的细胞病变，收毒用于筛选。2. 2猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl的筛选、纯化与表达鉴定重组病毒的蓝斑筛选上述培养物反复冻融3次，IO1UO2UO^ ΙΟ4、105、IO6倍稀释后接种单层PK15。16h后用含200 μ g/mL X-gal (购自TIANGEN BIOTECH)、1 %低熔点琼脂糖 (购自TIANGEN BIOTECH)的营养琼脂取代无血清培养基，继续培养3 5d，出现的蓝色蚀斑即为猪流感重组猪痘病毒，命名为rSPV/H3-2A-Hl。重组病毒的蚀斑克隆单个蓝色蚀斑以102、103、104、105、106倍稀释后接种单层 PK15细胞，IMi后以含200 μ g/mL X_gal、1 %低熔点琼脂糖的营养琼脂取代无血清培养基， 继续培养3 5d，挑取单个蚀斑(图6)。重复5次。猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl表达鉴定IFA鉴定待接种rSPV/H3-2A-Hl和wtSPV的H(15细胞出现明显CPE (4 5d)后， 倾去维持液，PBS洗涤2次后，用4°C冷无水乙醇固定30-45min，弃固定液，将96孔细胞板自然晾干。在接毒细胞孔和未接毒细胞孔中分别加入50 μ L 1 50稀释的猪流感Η3Ν2、Η1Ν1 阳性血清(用北京爱德士元亨生物科技有限公司猪流感试剂盒检测的临床血清，下同)，置 37°C湿盒中作用45min，PBS洗涤3次，每次5min ；加入50 μ L SPA-FITC标记物(用0. OlMpH 7. 4PBS稀释100倍)，37°C湿盒作用45min，PBS洗涤3次，置倒置荧光显微镜下观察结果。 rSPV/H3-2A-Hl感染且加猪流感H3N2 (A)和HlNl (B)阳性血清的细胞孔观察到阳性细胞有典型的特异性亮绿色荧光，而wtSPV感染孔(C、D)和对照的细胞孔(E、F)内无特异性绿色荧光(图7)，可见重组病毒rSPV/H3-2A-Hl能同时表达H3N2、Hmi的HAl蛋白。Western-blot鉴定取感染后收集、保存的含有重组猪痘病毒的上清接种 PK-15细胞，培养7 后收集感染重组猪痘病毒的细胞，加入1. 5mL的离心管中，2000rpm, 离心5min，弃上清，用PBS洗涤2次，弃上清，加入细胞裂解液100 μ L，冰浴30min，加入2 X 上样缓冲液IOOyL,煮沸;3min，离心5min，取上清0份)电泳分析。用同样的方法处理用wtSPV感染的H(15细胞作为阴性对照。细胞煮沸裂解后用12%聚丙烯酰胺凝胶进行 SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，按文献(杜以军.猪α干扰素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对口蹄疫病毒VPl抗原的免疫增强作用研究.南京农业大学博士论文，2008. 6，38)方法转印。 将转印后的PVDF膜0份)转移至封闭液(含5%脱脂乳的PBST)中，室温轻摇3 证后 4°C封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液PBST洗膜3次，每次lOmin，然后两张膜一张加入以封闭液1 1000稀释的兔Hl亚型SIV多抗血清(用猪流感病毒Hmi按常规方法免疫兔子所得)的一抗溶液，另一张加入以封闭液1 1000稀释的兔H3亚型SIV多抗血清(用猪流感病毒H3N2按常规方法免疫兔子所得)的一抗溶液，室温下振荡1. 5 池；再用PBST洗膜3次，每次lOmin，然后加入以封闭液1 30000稀释的羊抗兔IgG-HRP标记物，室温振荡 1. 5 ；再用PBST洗膜3次，每次lOmin。最后用HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色。具体步骤为转印结束前在显色盒中依次加入IxHRP反应缓冲液lmL、试剂A 50 μ L、试剂B 50 μ L,混勻，避光保存，30min内使用。转印结束后将PVDF膜取下，放入显色盒内预先混勻的显色液中，待观察到明显的目的条带后停止显色。将PVDF膜晾干，观察。结果显示，两张膜中感染重组猪痘病毒的细胞都有预期的目的条带，而WtSPV感染的H(15细胞无目的条带出现(图8、图9)，可见重组病毒 rSPV/H3-2A-Hl能同时表达H3N2、HlNl的HAl蛋白，并且部分H3-2A-H1蛋白在2A的作用下发生了裂解。将经鉴定的重组病毒rSPV/H3-2A_Hl保藏于中国典型培养物保藏中心，简称 CCTCC，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO :V201102，保藏日为2011年1月6曰。2. 3猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl的滴度测定将H(15细胞种植于96孔板，待长成单层，将重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl (CCTCC NO :V201102)冻融3次，用维持液将病毒作10倍比稀释；弃去长满单层H(15细胞的96孔板中的营养液，接种稀释好的病毒液，每个稀释度4个孔，100 μ L/孔；37°C、5% CO2饱和湿度下培养5d，观察CPE，积累每个稀释度的CPE孔数，按Reed-Muench法计算病毒的TCID5(1。 重组猪痘病毒 rSPV/H3-2A-Hl (CCTCC NO :V201102)的 TCID50 为 107_7mL。2. 4猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl稳定性试验把重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-Hl(CCTCC NO :V201102)在H(15细胞上连续传代30代，每5代分别检测rSPV/H3-2A-Hl中H3N2、HlNl的HAl蛋白的转录与表达，同时测定其组织细胞半数感染量。结果表明，H3N2、HlNl的HAl蛋白在重组猪痘病毒rSPV/ H3-2A-H1 (CCTCC NO :V201102)连续传代过程中表达稳定，其组织细胞半数感染量也未发生变化。接毒后细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在107TCID5Q/mL。实施例3小鼠的免疫学试验取6-8周龄雌性BALB/c小鼠45只，随机分为3组，每组15只。第1组每只肌肉免疫 rSPV/H3-2A-Hl (CCTCC NO :V201102)，剂量为 0. 2X IO7'0TCID50 ；第 2 组每只肌肉注射 wtSPV 0. 2X IO7 ciTCID5tl，第3组每只肌肉注射H(15细胞裂解上清0. 2mL。21d、35d后分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21、35、42d采血测定中和抗体；在首次免疫后21、35、42d取脾脏，分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应(5只/组/次)；首次免疫后 35d取脾脏，分离淋巴细胞，分别用猪流感病毒H3N2和Hmi刺激，测定培养上清中IFN- γ 和IL-4的量。3. 1中和抗体变化病毒中和试验-固定病毒稀释血清法。首先参照动物病毒学(第二版)，测定猪流感病毒Η3Ν2和HlNl的TCID50。在病毒中和试验前3 将MDCK细胞(购自上海坤肯生物化工有限公司，下同) 种植于96孔细胞板。待检血清56°C灭活30min，12000rpm离心5min除菌后，小心吸出上清，用维持液(含2% FCS的DMEM(购自TIANGENBIOTECH))分别将血清按1 4、1 8、 1 16、1 32，……，作2的连续倍比稀释；将病毒Hmi和H3N2用维持液分别稀释至含 200TCID50/100 μ L，然后将稀释的血清与等体积的病毒液(含200TCID5(1/100 μ L)混合，于 37°C水浴作用lh。弃去已长满单层MDCK细胞的96孔培养板中的营养液，将血清病毒混合液加入到细胞孔中，100 μ L/孔，每个血清稀释度作4的复孔，37°C培养2 3d。同时设定以下对照(1)猪流感H3N2阴性血清对照；( 猪流感Hmi阴性血清对照；( 猪流感病毒H3N2 一猪流感H3N2阴性血清对照；(4)猪流感病毒Hmi —猪流感Hmi阴性血清对照；(5) 猪流感病毒H3N2 —猪流感H3N2阳性血清(中和抗体效价为1 32)作为阳性对照；(6)猪流感病毒Hmi —猪流感Hmi阳性血清(中和抗体效价为1 32)作为阳性对照；(7)空白对照。结果判定，当⑶、⑷对照孔出现CPE，而⑴、⑵、(5)、(6)和(7)对照孔均未出现CPE时记录每个血清稀释度的CPE孔数。以能够完全抑制CPE的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价。血清中和试验结果显示(图10、11)两个对照组小鼠血清没有猪流感病毒(swine influenzavirus, SIV) (H3N2.H1N1)中和活性；rSPV/H3-2A_Hl 免疫组小鼠血清具有 SIV 中和活性，且二免后呈明显上升趋势。血清中H3N2和Hmi的中和抗体变化趋势相似，两者之间无明显差异。3. 2SIV(H3N2,H1N1)特异的淋巴细胞增殖检测3. 2. 1小鼠脾淋巴细胞的制备 参照文献(杜以军.猪α干扰素和粒细胞_巨噬细胞集落刺激因子对口蹄疫病毒VPl抗原的免疫增强作用研究.南京农业大学博士论文，2008. 6，66-67)进行。淋巴细胞制备好后进行细胞计数，用RPMI-1640(购自TIANGEN BIOTECH)完全培养基调节细胞密度至5X IO6个/mL ；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100 μ 1/孔。3. 2. 2淋巴细胞增殖试验在种植好淋巴细胞的孔中，分别加入20 μ g/ml的SIV (Hmi)、SIV (H3N2)抗原作为刺激原100 μ 1，对照孔加入100 μ 1 RPMI-1640完全培养基，各作3个重复孔。37°C 5% C02 温箱中培养66h，吸出上清，加入160μ 1新鲜的培养基，同时每孔再加入40 μ 1 MTT (5mg/ ml)，37°C下继续培养4h。吸弃培养液，每孔加入100μ 1 DMS0，振荡融解结晶，测定OD57tlnm 的值。计算刺激指数刺激指数SI =刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值检测结果(图12、13)显示重组猪痘病毒免疫组小鼠脾淋巴细胞经SIV (Η3Ν2)和 SIV(HlNl)刺激后出现特异的细胞活化增殖。组间比较免疫后21d、35d和42d，重组猪痘病毒免疫组与两个对照组淋巴细胞增殖差异显著(P < 0. 05)。3. 3SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测分别用SIV(H3N2)和SIV(HlNl)作为刺激抗原(终浓10 μ g/mL)刺激分离的淋巴细胞，37°C下培养66h。用 ELISA试剂盒(购自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate) 来测定培养上清中细胞因子IFN-Y和IL-4的量，按说明书来操作。一免后35d，小鼠脾淋巴细胞经SIV刺激，培养上清中IFN- γ和IL_4含量检测结果显示(图14、15)各组小鼠脾淋巴细胞培养上清中都有细胞因子分泌。组间比较rSPV/ H3-2A-H1免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4含量显著高于其它两个对照组(P < 0. 05)，而用H3N2和Hmi的刺激的细胞因子浓度变化趋势相似，两者之间无明显差异。实施例4豚鼠的免疫学试验及攻毒保护试验取200-300克雌性Hartly豚鼠36只，随机分为6组，每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H3-2A-Hl，剂量为0. 4X IO7.0TCID50 ；第3、4组每只免疫wtSPV,剂量为 0. 4X IO7 0TCID50 ；第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清0. 4mL。免疫方式为两后腿胫骨上方肌肉注射。21d分别以相同的剂量加强免疫1次。首次免疫后28d采血，分离淋巴细胞， 用SIVH3N2和Hmi刺激，测定培养上清中IFN- γ和IL-4的量。35d采血测定中和抗体滴度。第35d攻毒，第1、3、5组用ImL无针头注射器每只鼻腔注射0.2X IO5 tlTCID5ci的H3N2; 2、4、6组每只鼻腔注射0. 2 X IO5 0TCID50的HlNl0攻毒后观察7d。临床表现记录每天喂食时，记录观察项目的出现情况，最后根据7天记录结果，进行平均，具体方法参考文献(王兴龙，猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异及GM-CSF对GP3/GP5的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2010. 6，61)进行。观察项目有精神沉郁、食欲下降、 眼睑水肿、咳嗽、呼吸困难和流鼻涕6项指标，根据严重程度每项0-3分；肺大体病变的评分参照文献(Wesley RD, Tang Μ, Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5Recombinant Viruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2 SwineInfluenza Virus[J]. Vaccine,2004,22(25/26) 3427-3434.)进行。42d将全部豚鼠安乐死，取肺组织处理、接种鸡胚(盲传2代)，HA、HI 试验检测流感病毒，同时取肺样本用甲醛固定做病理切片，观察病理变化。4. ISIV (H3N2)和SIV(HlNl)刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测无菌取豚鼠的外周血，用肝素抗凝，用生理盐水稀释1倍，轻轻加于4mL的淋巴细胞分离液面上，2000r/min，离心20min ；取界面淋巴细胞层，用PBS洗3次，悬于RPMI 1640 培养液，计算并调整细胞浓度至2 X 106/ml。将细胞悬液加到96孔板中，每孔100 μ 1。在种植好淋巴细胞的孔中，分别加入20ug/ml的SIV(H3N2)和SIV(HlNl)抗原作为刺激原100 μ 1，对照孔加入100 μ 1 RPMI-1640完全培养基，各作3个重复孔。37°C 5% CO2温箱中培养66h，吸出上清。细胞因子的检测方法同前。一免后观山豚鼠外周血淋巴细胞经SIV刺激，培养上清中IFN- γ和IL-4含量检测结果显示(图16、17)各组豚鼠外周血淋巴细胞培养上清中都有细胞因子分泌。组间比较rSPV/H3-2A-Hl免疫组IFN- γ和IL-4含量显著高于其它两个对照组(P < 0. 05)，而用 SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激的细胞因子浓度变化趋势相似，两者之间无明显差异。4. 2豚鼠肺脏组织病理变化观察进行肺脏组织病理变化观察，病理组织切片的制备过程参照文献(王兴龙.猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异及GM-CSF对GP3/GP5的免疫增强作用研究.南京农业大学博士论文，2010. 6，62-63)进行。攻毒后7d，第1组(A)和第2组(B)豚鼠肺组织无变化，而对照组均发生了明显的病理变化，表现为严重的间质增生，有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏(图18)。4. 3豚鼠免疫保护试验(表1)血清中和试验结果显示，免疫后35d，rSPV/H3-2A-Hl免疫组豚鼠血清中检测到 SIV(H3N2)和SIV(HlNl)特异的中和抗体，但不同豚鼠之间抗体滴度低的为1 8，高的可达到1 32。wtSPV、PK15免疫组血清对SIV(H3N2)和SIV(HlNl)均没有中和活性。—免后35d攻毒，免疫rSPV/H3-2A_Hl的豚鼠无流感症状出现。而对照组表现为体温升高、精神沉郁、食欲下降、流鼻涕、呼吸困难、咳嗽，尤其是流鼻涕很明显，而其他症状轻微。rSPV/H3-2A-Hl免疫组中无肉眼可见病理变化，而所有对照组豚鼠肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现。从免疫rSPV/H3-2A-Hl的豚鼠未分离到SIV，而对照组全都分离到SIV。实施例5猪体攻毒保护试验
本部分试验在江苏省农业科学院完成。所有的猪均在无SIV的环境设施中饲养。30头6周龄的大长二元猪(SIV、PRRSV、 PCV、SPV阴性)，随机分为6组，每组5头，每一组在单独的圈舍饲养。第1组和第2组免疫rSPV/H3-2A-Hl，剂量均为1 X 107TCID50/lmL/头；第3、4组注射wtSPV，剂量均为 1 X IO7TCID5tZlmL/头；第5、6组每头注射PK15细胞裂解上清lmL。免疫方式为肌肉注射。 在免疫后21d，前腔静脉采血检测针对SIV的特异性中和抗体；同时分离外周血淋巴细胞， 分别用SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激，测定培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-4的量。在免疫后21d，所有猪攻毒，攻毒方式为鼻腔注入(拔取注射器针头)。第1、3、5组每只鼻腔注入 IX 105·ciTCID5tl 的 SIV(H3N2) ；2、4、6 组每只鼻腔注入 1 X 105_tlTCID50 的 SIV(HlNl)。攻毒后连续5d，观察临床表现，测体温，采鼻拭子检查鼻腔排毒情况，攻毒后第5d，猪进行安乐死处理，观察肺脏病理变化。鼻拭子中流感病毒含量检测和肺大体病变的评分参照文献进行(Wesley R D, Tang Μ, Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with HumanAdenovirus 5 Recombinant Viruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2Swine Influenza Virus[J]. Vaccine,2004,22 (25/26) 3427-3434.)。取肺组织处理、接种10日龄SPF鸡胚(盲传2代)，HA、HI试验检测SIV ；同时取肺组织甲醛固定，做病理切片观察。临床表现记录每天给动物喂食时(早、中、晚3次)，观察动物，记录观察项目的出现情况，最后根据5天记录结果，进行平均，获得动物临床表现打分值，具体方法参考文献(王兴龙，猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异及GM-CSF对GP3/GP5 的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2010. 6，61)进行。临床表现记录包括精神沉郁、食欲下降、眼睑水肿、流鼻涕、呼吸困难、咳嗽、皮肤发红和粪便干硬8项指标，每项有 1分，无O分。5. 1攻毒后体温测量结果攻毒后第一天3、4、5、6组猪的直肠温度都有不同程度的升高，但上升的幅度有限，一般为40°C，1天后体温回复正常。1、2组猪的直肠温度在攻毒后一直保持在正常范围。5. 2攻毒后鼻腔排毒情况测量结果从攻毒前开始采集每头猪的鼻拭子，一直到试验结束。按Wesley (Wesley R D， Tang Μ,Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5RecombinantViruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2 Swine Influenza Virus [J]. Vaccine, 2004, 22 (25/26) :3427_3434.)检测鼻拭子中 SIV 量，结果如图19、20。攻毒后，PK15和wtSPV组猪的鼻腔中都有SIV分泌，而重组毒免疫组未检测到病毒。5. 3SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测猪外周血中淋巴细胞经SIV刺激特异的细胞因子含量检测结果显示(图21、22) 在免疫后21d，各组猪外周血淋巴细胞培养上清中都有细胞因子分泌。组间比较rSPV/ H3-2A-H1免疫组猪外周血淋巴细胞培养上清中IFN- γ和IL-4含量显著高于其它两个对照组(P < 0. 05)。用SIV(H3N2)和SIV(HlNl)刺激的细胞因子浓度变化趋势相似，两者之间无明显差异。5. 4猪肺组织病理变化观察(图23)攻毒后第1组㈧和第2组⑶仔猪肺脏无病理变化，而其他组发生了明显的病理变化，主要是肺泡内淋巴细胞浸润、肺泡壁破坏、上皮细胞脱落，支气管腔内充满淋巴细胞。5. 5猪体攻毒保护试验(表2)血清中和试验结果显示，免疫后21d，rSPV/H3-2A-Hl免疫组猪血清中均能够检测到SIV特异的中和抗体，但不同猪之间抗体滴度低的为1 8，高的达到1 32。WtSPV, PK15免疫组猪血清对SIV没有中和活性。免疫后21d攻毒，免疫rSPV/H3-2A_Hl的猪均无SI症状出现，而对照组猪表现为体温升高、精神沉郁、食欲下降、眼睑水肿、流鼻涕、喜卧、呼吸困难、咳嗽和皮肤发红等流感症状。rSPV/H3-2A-Hl免疫组猪中无肉眼可见病理变化，而对照组猪肺部都有紫色、坚实区出现。免疫rSPV/H3-2A-Hl的猪未分离到SIV，而对照组猪全都分离到SIV。本研究成功构建了表达SIV HAl的重组猪痘病毒rSPV/H3-2A_Hl，并在小鼠、 豚鼠和猪体内分别进行了免疫及攻毒保护实验。结果显示，免疫了重组猪痘病毒rSPV/ H3-2A-H1的动物体内产生了 SIV HAl特异的抗体，免疫组的淋巴细胞增殖指数和培养上清中IFN-γ、IL-4含量显著高于对照组。证明rSPV/H3-2A-Hl能够显著提高机体的体液免疫及细胞免疫反应。攻毒后，HQ5和wtSPV组猪的鼻腔中都有SIV分泌，而重组毒免疫组未检测到病毒。用同源SIV (H3N2)和SIV (HlNl)攻击免疫rSPV/H3-2A_Hl的豚鼠和猪无流感症状和病理变化，且未分离到病毒。而对照组则表现为体温升高、精神沉郁、食欲下降、流鼻涕、 呼吸困难、咳嗽等流感症状，所有对照组肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现，并从中分离到病毒。综上所述，本研究获得了串联表达猪流感病毒H3N2和HmiHAl蛋白重组猪痘病毒 rSPV/H3-2A-Hl。rSPV/H3-2A_Hl能诱导动物产生显著的体液免疫和细胞免疫反应，能保护豚鼠和猪抵御同源SIVHmi和H3N2的攻击。表1豚鼠的免疫应答及攻毒后结果
权利要求
1.一种猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl基因的转移载体pUSZll/H3-2A_Hl，其特征在于该转移载体是将序列为SEQ ID NO. 1所示的由猪流感病毒H3N2毒株HAl基因序列、口蹄疫病毒的2A基因序列和猪流感病毒Hmi毒株HAl基因序列串联组成的H3-2A-H1基因插入猪痘病毒载体PUSZll的BamH I酶切位点所得。
2.一种猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，其特征在于该病毒是将猪痘病毒和权利要求1所述的转移载体PUSZ11/H3-2A-H1感染、转染H(15细胞，进行同源重组获得的阳性克隆。
3.根据权利要求2所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，其特征在于所述的猪痘病毒为ATCC保藏号为ATGG^number VR-363 野生型猪痘病毒wtSPV。
4.根据权利要求3所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，其特征在于所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒(rSPV/H3-2A_Hl)于 2011年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :V201102。
5.权利要求2所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据GenBank收录号为FJ157986的猪流感病毒H3N2(A/swine/ Guangxi/1/2004(H3N2))毒株HAl的基因序列、GenBank收录号为HQ4U603 口蹄疫病毒2A 基因、GenBank 收录号为 EU502884 的猪流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (HlNl)) 毒株HAl的基因序列，自行设计并合成序列为SEQ ID NO. 1所示的H3-2A-H1基因；(2)将所述的序列为SEQID NO. 1的H3-2A-H1基因插入猪痘病毒载体pUSZll的BamHI 酶切位点，然后通过酶切和测序鉴定，获得所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl基因的转移载体 PUSZ11/H3-2A-H1 ；(3)将猪痘病毒和所述的H3-2A-H1基因的转移载体pUSZll/H3-2A-Hl感染、转染H(15 细胞，进行同源重组获得所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。
6.根据权利要求5所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于步骤( 所述的将H3-2A-H1基因插入猪痘病毒载体pUSZll的具体方法为利用BamH I分别对步骤(1)所述的序列为SEQ ID NO. 1的H3-2A-H1基因和猪痘病毒载体pUSZll进行单酶切，回收大小为2084bp的H3-2A-H1基因目标片段和大小为8391bp的猪痘病毒载体pUSZll线性大片段，连接两片段，得到重组质粒，经测序和测定正反向，将测序结果符合目的片段且方向为正向的质粒定名为pUSZl 1/H3-2A-H1。
7.根据权利要求5所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于所述的制备方法还包括所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的蚀斑纯化步骤。
8.根据权利要求5所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于所述的制备方法还包括利用IFA和ffestern-blot技术对所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒进行表达鉴定的步骤。
9.权利要求2所述的猪流感病毒H3N2和Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒在制备预防和/或治疗猪流感病毒H3N2和Hmi亚型感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了猪流感病毒H3N2和H1N1亚型HA1蛋白重组猪痘病毒及其制备方法。根据猪流感病毒H3N2毒株和H1N1毒株的HA1基因序列、口蹄疫病毒的2A基因序列，设计、合成H3-2A-H1基因，并把该基因克隆入猪痘病毒载体pUSZ11中，得到转移载体pUSZ11/H3-2A-H1。将猪痘病毒和转移载体pUSZ11/H3-2A-H1感染、转染PK15细胞，进行同源重组获得重组猪痘病毒。该重组猪痘病毒能稳定表达猪流感病毒H3N2和H1N1的HA1蛋白，能有效地刺激机体的免疫保护反应，可在制备预防和/或治疗猪流感病毒H3N2和H1N1亚型感染的药物中应用。
文档编号C12R1/93GK102154367SQ20111002690
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者许家荣, 陆承平, 黄冬艳 申请人:南京农业大学