专利名称：日本蟳Jassr129微卫星DNA标记的检测方法
技术领域：
本发明属于日本_微卫星DNA分子遗传标记技术，具体说是一种日本_ Jassrl29微卫星DNA标记的检测方法。
背景技术：
本发明做出之前，国内外在其他蟹类中有相关的研究报道，Pamela C. Jensen等在对邓杰内斯蟹(Cancer magister)的研究中，设计了 99个微卫星引物，并对其中的9个进行了合成。利用尼龙膜杂交法，Masatsugu taWiano等在锯缘青蟹(正_，Scylla serrata) 中发现5个具有可变性的微卫星位点。David Gopurenko等在锯缘青蟹(沙_，Scylla paramamosain)的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规方法，E. S Yap等在远海梭子蟹 (Portunus pelagicus)中筛选到7个含有二核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。H. S. AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)基因组
富集文库中筛选出9个新的微卫星位点。B. Hgnfling等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性的微卫星位点。国内的宋来鹏、李晓萍等从基因组文库和微卫星富集文库中筛选了 30多个多态性的微卫星标记，并进行了标记多态信息含量做出了评价；刘磊等应用这些标记进行了家系鉴定的系谱认证分析；罗云等将这些标记应用到日本_遗传图谱构建中。至今为止，尚未见有关日本_微卫星DNA检测技术方面的报道。itJlM (microsatellites)(simple sequence repeats, SSR) 是指由1 6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。
发明内容
本发明是针对目前尚未有对日本_微卫星DNA检测技术公开的现状，提出一种日本虫尋Jassrl29微卫星DNA标记的检测方法，可快捷的获得日本_的Jassrl^遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出日本_在此位点的每个个体的基因型。本发明检测技术主要利用磁珠富集法建立的日本_微卫星富集文库中Jassrl29的微卫星DNA序列，使用I^rimer (Version 5. 00)软件在其核心序列的两端设计相应的PCR 引物，将引物序列合成后对日本_个体进行PCR扩增，从而快速地检测日本_每个个体在此微卫星区的遗传变异，从而获得该引物对日本序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地表现出每个个体的基因型。本发明的技术方案是一种日本_ Jassrl29微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，操作程序为首先提取日本_基因组DNA并稀释备用；再利用日本_基因组文库中的Jassrl^微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本_不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测； 利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本_在Jassrl^核心序列区高度遗传变异的多态性图谱Jassrl^微卫星核心序列的特异性引物序列分别为 正链 5，-CATTACGCTCGGAAAGTG-3，，负链 3，-TTCAGCAGCACAACCTCT-5，，使用该引物时的退火温度为49°C。对上述技术方案的改进提取日本_基因组DNA，将其稀释为50ng/ μ L，每个PCR 反应中加入3 μ L，反应总体积为20 μ L。对上述技术方案的进一步改进所述PCR扩增的加样参数为每个PCR反应总体积为 20 μ L,包括 50ng 日本_ 基因组 DNA3 μ L ；含 15mmol/L Mg2+ 的 IOX PCRBuffer2. 0μ L ； 2. 5mmol/L dNTP 1· 6 μ L ;5U/μ L 的 TaqO. 2 μ L ；本发明的引物 10mmol/L 各 1 μ L ；最后力口 ddH20至20 μ L ；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为95°C预变性5min ；95°C变性45s， 49°C退火45s，72°C延伸45s，35个循环；最后72°C再延伸IOmin ；4°C保存。对上述技术方案的进一步改进对PCR产物的检测将PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1 1.证进行分离；将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min — 蒸馏水6min — 0. 的硝酸银溶液25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到日本_在Jassrl^基因座位高度遗传变异的多态性图谱。应用上述引物和检测技术可以检测日本_的每个个体在JaSSrU9微卫星核心区的遗传变异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱即可读出基因型，方便、快捷、准确。其次，相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以区分个体是纯合子和杂合子状态。本发明适用于日本_群体遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等应用。JaSSrU9的 PCR引物是本发明的核心，可在日本_的群体检测中呈现高度遗传变异的多态性。本发明技术具有以下优点(1)本发明可快捷的获得日本_的Jassrl^遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出日本_在此位点的每个个体的基因型；(2)本发明主要应用于日本_群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
图1为本发明的JaSSrU9引物对日本_观个体的检测图谱，编号1- ，M是标准
分子量。
具体实施例方式下面通过实施例详细叙述本发明在日本_ Jassrl^微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取日本_基因组DNA并稀释备用；再利用日本_基因组文库中的含有Jassrl^微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本虫尋不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得日本_在Jassrl^核心序列区高度遗传变异的多态性图谱(如图1所示)。日本_在Jassr 1 核心序列如下ATCATCCATTACGCTCGGAAAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTG AGTGAGTGAGTGTGTGAGTGAGTTAGTTAGATAGTTTCAACTTATAGAAAAAGCCAATGAAAATGCAAAGGAAGAG GTTGTGCTGCTGAAAGTCTG上述核心序列中的标下划线的为弓丨物序列区。1、日本_基因组DNA的提取取肌肉组织lOOmg，剪碎后放入1. 5ml离心管中，加入 pH8. O 的 TE 溶液(10mmol/L Tris-CI，10mmol/L EDTA) 500 μ L，用研磨棒研磨。加入 10% SDS溶液25 μ L，混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4 μ L，混勻，55°C消化2. 5 3h。重蒸酚抽提两次，每次IOmin, 12000转/min离心5min，取上清；酚氯仿(1 1)抽提一次，IOmin, 12000转/min离心5min，取上清；氯仿抽提一次5min，5000g离心5min，取上清。加入1/25 体积的5mol/LNaCl溶液，混勻后再加入两倍体积的_20°C的无水乙醇沉淀DNA 15min ；挑出的DNA，用70%的乙醇洗涤数十分钟，使DNA干燥，用灭菌水500 μ L充分溶解后，定量将其稀释成50ng/yL的浓度备用。2、微卫星引物的设计在日本_微卫星富集文库基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，在Jassrl^核心序列的两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星DNA片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的主要依据。本发明的Jassrl^微卫星核心序列区域两端的特异性引物序列为正链 5，-CATTACGCTCGGAAAGTG-3，，负链 3，-TTCAGCAGCACAACCTCT-5，，使用该引物时的退火温度为49°C。3、PCR 扩增首先加样，加样量如下包括50ng日本_基因组DNA3y L ；含15mmol/L Mg2+的10X PCR Buffer2. 0μ L ；2. 5mmol/L dNTP 1. 6μ L ；5U/y L TaqO. 2 μ L ；本发明的引物 IOmmol/ L各1 μ L ；最后加ddH20至20 μ L。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为95°C预变性5min ；95°C变性45s，49°C退火45s，72°C延伸45s，;35个循环；最后72°C再延伸IOmin ； 4°C保存。4、PCR产物的检测PCR反应结束后，将产物在8%的变性聚丙烯酰氨的凝胶中进行电泳，电泳仪的功率为12W，电泳的时间在1 1.证左右，即可终止。将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min —蒸馏水6min - 0. 1%的硝酸银溶液25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即得到如图1所示的多态性图谱。
权利要求
1.一种日微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，操作程序为首先提取日本_基因组DNA并稀释备用；再利用日本_基因组文库中的Jass 微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本_不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本_在扭8虹1四核心序列区高度遗传变异的多态性图谱JassrU9微卫星核心序列的特异性引物序列分别为正链 5，-CATTACGCTCGGAAAGTG-3，，负链 3，-TTCAGCAGCACAACCTCT-5，，使用该引物时的退火温度为 49 0C ο
2.按照权利要求1所述的日本_Jassrl^微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于， 提取日本_基因组DNA，将其稀释为50ng/ μ L，每个PCR反应中加入3 μ L，反应总体积为 20 μ L0
3.按照权利要求1或2所述的日本_JassrU9微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的加样参数为每个PCR反应总体积为20 μ L，包括50ng日本_基因组 DNA3 μ L ；含 15mmol/L Mg2+ 的 IOX PCR Buffer2. 0 μ L ;2· 5mmol/L dNTP 1· 6 μ L ；5U/ μ L 的 TaqO. 2 μ L ；本发明的引物lOmmol/L各1 μ L ；最后力口 ddH20至20 μ L ；使用该引物时设置PCR 仪的程序参数为95°C预变性5min ；95°C变性45s，49°C退火45s，72°C延伸45s，35个循环； 最后72°C再延伸IOmin ；4°C保存。
4.按照权利要求1或2所述的的日本_JassrU9微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，对PCR产物的检测将PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1 1. 5h进行分离；将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min —蒸馏水6min — 0. 的硝酸银溶液25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到日本_在Jassrl^基因座位高度遗传变异的多态性图谱。
5.按照权利要求3所述的的日本_Jassrl^微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，对PCR产物的检测将PCR产物在6 %的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1 1. 5h进行分离；将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min —蒸馏水6min — 0. 的硝酸银溶液25min — 3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到日本_在Jassrl^基因座位高度遗传变异的多态性图谱。
全文摘要
一种日本蟳Jassr129微卫星DNA标记的检测方法，其特点是首先提取日本蟳基因组DNA并稀释备用；再利用日本蟳微卫星富集文库中的Jassr129微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本蟳不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本蟳在Jassr129核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。Jassr129微卫星核心序列的特异性引物序列分别为正链5’-CATTACGCTCGGAAAGTG-3’，负链3’-TTCAGCAGCACAACCTCT-5’，退火温度为49℃。方法简便，所得结果可直观地检测出日本蟳在此位点的每个个体的基因型。
文档编号C12Q1/68GK102162010SQ20111004371
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月19日 优先权日2011年2月19日
发明者刘萍, 宋春妮, 李健 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所