专利名称：一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法
技术领域：
本发明属三氯蔗糖的制备领域，特别是涉及一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方
法。 吗
背景技术：
目前全球生产三氯蔗糖的是美国强生公司，其规模达到千吨左右。由于受专利保护限制，其他国家都没有相应的大规模生产。相比，虽然我国研究三氯蔗糖单位较多，发表文章也不少，而真正实施生产单位较少，以往某单位在生产三氯蔗糖产品过程中，美国强生公司以专利侵权为由，要求其停产，这不仅限制了我国三氯蔗糖生产工艺的发展，且在工业和经济上的滞留所带来的损失也是无法预计的。传统三氯蔗糖生产方法主要有以下三种(1)醚化法利用三苯基氯甲烷与蔗糖中羟基反应成醚来保护三个伯羟基，然后通过脱保护基、氯化、脱乙酰基等反应，合成三氯蔗糖。总收率为14 15%。缺点是步骤较多，原料三苯基氯甲烷价格较贵，生产成本较高； (2)酯化法用原乙酸三甲酯与蔗糖中4. 6位的二个羟基形成一个环状化合物，环状化合物在水分子攻击下开环得到4-乙酰基蔗糖和6-乙酰基蔗糖的混合物。在有机碱(特丁胺) 作用下，乙酰基发生迁移，大部分4-乙酰基蔗糖可转化为6-乙酰基蔗糖，再经过氯化、乙酰化、脱乙酰基等步骤制得三氯蔗糖。也有报导不经过全乙酰化步骤可以减少原料，简化工艺。本路线是美国强生公司要求停止生产的生产工艺。该工艺的缺点是要求高真空和极低温度，总收率不高约30 40%，投资大；(3)酶化法先用一种生物方法得到6-乙酰基葡萄糖，将6-乙酰基葡萄糖与蔗糖粉混合溶于缓冲溶液在β -果糖转化酶作用下，可以50%的产率得到6-乙酰基蔗糖，后者再通过氯化、去乙酰基等步骤得到三氯蔗糖，总收率为17% 左右。酶化法反应步骤多，发酶成本高，中间体提纯难度高，工业化生产成本高。因此，到目前为止，关于利用微生物降解生产三氯蔗糖的工艺，至今还未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，该制备工艺简单，操作平稳，收率高；反应均为通用标准设备，投资少；每步溶剂和附料可以回收，不仅成本降低而且对环境友好。本发明的一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，包括(1)在10_15衬％的水苏糖溶液中加入为溶液的l_5wt%酵母菌(市售)，于32 34°C发酵5 10h，离心除菌，取上清液经硅胶层析分离得甘露三糖；(2)将甘露三糖与吡啶按摩尔比1 5 15混合溶解，滴加氯化亚砜，然后升温到10(TC，保温3-15min，冷却后蒸除溶剂，分离得二氯甘露三糖；其中，甘露三糖与氯化亚砜的摩尔比为1 5-15;(3)将大肠杆菌K12菌株(市售)先进行紫外及亚硝酸复合诱变，然后按1-10%接种量接种到M9培养基，并加入为培养基总体积百分比1 3%的二氯甘露三糖，于37°C 筛选培养24-48h，选取生长良好的菌种，然后接种到液体培养基进行扩大培养，37°C培养 24-48h，得扩大培养后的菌种；(4)将水苏糖与吡啶按摩尔比1 5 10混合，于-5 0°C滴加氯化亚砜，然后升温至100 110°C保温4 6min，冷却分离得四氯水苏糖；其中，水苏糖与氯化亚砜的摩尔比为1 6 8 ；(5)最后在M9发酵培养基中加入四氯水苏糖，并按1-10%的接种量接入步骤(3) 所得扩大培养后的菌种，于36 37°C，通气搅拌5-25分钟，离心除菌种后超滤除蛋白，浓缩
结晶得三氯蔗糖。
所述步骤(3)中的M9培养基为磷酸氢二钾30g/L，磷酸二氢钾10_50g/L，氯化铵 50g/L，水 IL0所述步骤(3)中的液体培养基为上述的M9培养基+碳源1-5% wt棉子糖或水苏糖。所述步骤(5)中的四氯水苏糖的加入量为培养基2 10wt%。所述步骤(5)中的M9发酵培养基为磷酸氢二钾30g/L，磷酸二氢钾10_50g/L，氯化铵50g/L，水1L。本发明以水苏糖为起始原料，经过一步选择氯化得到四氯水苏糖，然后加入诱变后的能选择性降解半红糖基部分的微生物进行发酵，发酵液直接纯化制得三氯蔗糖。本方法所使用的微生物诱导物为二氯甘露三糖，以该化合物为唯一碳源进行微生物培养，结合常规诱导方法得到高效降解四氯水苏糖的微生物，同时筛选所用的二氯甘露三糖也可以部分纯化产品。有益效果(1)本发明的制备工艺简单，操作平稳，收率高；反应均为通用标准设备，投资少； 每步溶剂和附料可以回收，不仅成本降低而且对环境友好；(2)该方法所用的二氯甘露三糖，采用传统氯化工艺在吡啶溶剂中用氯化亚砜于低温时选择性氯化，除去溶剂后不必分离纯化可直接利用。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)在Imol水苏糖水溶液IL中加入60g酵母菌，于32°C发酵10h，离心除菌，取上清液经硅胶层析分离得约0. 7mol甘露三糖；(2)取Imol甘露三糖，加入5mol吡啶混合溶解，滴加5mol mol氯化亚砜，然后升温到100°C，保温3min，冷却后蒸除溶剂，分离得二氯甘露三糖；(3)将大肠杆菌K12菌株先进行紫外及亚硝酸复合诱变，然后按接种量接种到 M9培养基，并加入为培养基总体积比的二氯甘露三糖，于37°C筛选培养24h，选取生长良好的菌种，然后接种到液体培养基进行扩大培养，37°C培养24h ；(4)取1mol水苏糖，加入1Omol吡啶混合，于0°C滴加6mol氯化亚砜，然后升温至 110°c保温4min，冷却分离得约0. 7mol四氯水苏糖；(5)最后在发酵培养基中加入为培养基总体积比2%四氯水苏糖，并按的接种量接入扩大培养后的菌种，于36°C，通气搅拌25分钟，离心除菌种后超滤除蛋白，浓缩结晶得三氯蔗糖。实施例2(1)在1mol水苏糖水溶液IL中加入IOOg酵母菌，于33°C发酵6h，离心除菌，取上清液经硅胶层析分离得约0. 7mol甘露三糖；(2)取1mol甘露三糖，加入12mol吡啶混合溶解，滴加6mol氯化亚砜，然后升温到 100°C，保温lOmin，冷却后蒸除溶剂，分离得二氯甘露三糖；(3)将大肠杆菌K12菌株先进行紫外及亚硝酸复合诱变，然后6%接种量接种到M9 培养基，并加入为培养基总体积比2%的二氯甘露三糖，于37°C筛选培养36h，选取生长良好的菌种，然后接种到液体培养基进行扩大培养，37°C培养36h ；(4)取Imol水苏糖，加入13mol吡啶混合，于0°C滴加7mol氯化亚砜，然后升温至 100 110°C保温5min，冷却分离得约0. 7mol四氯水苏糖；(5)最后在发酵培养基中加入为培养基总体积比5%四氯水苏糖，并按6%的接种量接入扩大培养后的菌种，于37°C，通气搅拌10分钟，离心除菌种后超滤除蛋白，浓缩结晶得三氯蔗糖。实施例3(1)在1mol水苏糖水溶液IL中加入150g酵母菌，于34°C发酵5h，离心除菌，取上清液经硅胶层析分离得约0. 6mol甘露三糖；(2)取1mol甘露三糖，加入15mol吡啶混合溶解，滴加15mol氯化亚砜，然后升温到100°C，保温15min，冷却后蒸除溶剂，分离得二氯甘露三糖；(3)将大肠杆菌K12菌株先进行紫外及亚硝酸复合诱变，然后10%接种量接种到 M9培养基，并加入为培养基总体积比3%的二氯甘露三糖，于37°C筛选培养48h，选取生长良好的菌种，然后接种到液体培养基进行扩大培养，37°C培养48h ；(4)取Imol水苏糖，加入5mol吡啶混合，于0°C滴加8mol氯化亚砜，然后升温至 100 110°C保温4 6min，冷却分离得约0. 68mol四氯水苏糖；(5)最后在M9发酵培养基中加入为培养基总体积比10%四氯水苏糖，并按10%的接种量接入扩大培养后的菌种，于37°C，通气搅拌5分钟，离心除菌种后超滤除蛋白，浓缩
结晶得三氯蔗糖。
权利要求
1.一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，包括(1)在10_15wt%的水苏糖溶液中加入为溶液的l_5wt %酵母菌 (Sac-charomycescerevisiae)，于32 34°C发酵5 10h，离心除菌，取上清液经硅胶层析分离得甘露三糖；(2)将甘露三糖与吡啶按摩尔比1 5 15混合溶解，滴加氯化亚砜，然后升温到 100°C，保温3-15min，冷却后蒸除溶剂，分离得二氯甘露三糖；其中，甘露三糖与氯化亚砜的摩尔比为1 5-15;(3)将大肠杆菌K12菌株(Escherichiacoli K12)先进行紫外及亚硝酸复合诱变，然后按1-10%接种量接种到M9培养基，并加入为培养基总体积百分比1 3%的二氯甘露三糖，于37°C筛选培养M-4 !，选取生长良好的菌种，然后接种到液体培养基进行扩大培养， 37°C培养M-4 !，得扩大培养后的菌种；(4)将水苏糖与吡啶按摩尔比1 5 10混合，于-5 0°C滴加氯化亚砜，然后升温至100 110°C保温4 6min，冷却分离得四氯水苏糖；其中，水苏糖与氯化亚砜的摩尔比为1 6 8 ；(5)最后在M9发酵培养基中加入四氯水苏糖，并按1-10%的接种量接入步骤(3)所得扩大培养后的菌种，于36 37°C，通气搅拌5-25分钟，离心除菌种后超滤除蛋白，浓缩结晶得三氯蔗糖。
2.根据权利要求1所述的一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步骤(3)中的M9培养基为磷酸氢二钾30g/L，磷酸二氢钾10-50g/L，氯化铵50g/L，水1L。
3 根据权利要求1所述的一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步骤(3)中的液体培养基为M9培养基+碳源1-5% wt棉子糖或水苏糖。
4.根据权利要求1所述的一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步骤(5)中的四氯水苏糖的加入量为培养基3 10wt%。
5.根据权利要求1所述的一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，其特征在于所述步骤(5)中的M9发酵培养基为磷酸氢二钾30g/L，磷酸二氢钾10-50g/L，氯化铵50g/L，水 1L。
全文摘要
本发明涉及一种以微生物发酵制备三氯蔗糖的方法，包括在水苏糖中加入酵母菌，发酵培养后离心分离得甘露三糖；然后加入吡啶和氯化亚砜，经加热冷却，分离得二氯甘露三糖；以二氯甘露三糖作为唯一碳源进行大肠杆菌的筛选培养，筛选出优良菌株后再进行扩大培养；然后将预先制备好的四氯水苏糖加入到发酵培养基中，接入扩大培养的菌株，于36～37℃，通气搅拌5-25分钟，离心除菌种后超滤除蛋白，浓缩结晶得三氯蔗糖。该制备工艺简单，操作平稳，收率高；反应均为通用标准设备，投资少；每步溶剂和附料可以回收，不仅成本降低而且对环境友好。
文档编号C12P19/12GK102154409SQ20111006467
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者施立钦, 邱从平 申请人:宁波职业技术学院