专利名称：牛结核病pcr快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种牛结核病PCR快速诊断试剂盒。
背景技术：
目前，结核病在全球范围内呈蔓延趋势，全球有结核病2000万人，我国现有结核病人约600万，每年死亡约28万，我国是世界上22个结核病高负担的国家之一。据统计资料，我省有结核病人约20万，儿童约占1/3。结核病是由人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌引起，结核病除感染人外还能使50多种哺乳动物和25种禽类感染，牛是最敏感的动物。牛结核主要由牛结核分枝杆菌引起，是一种人畜共患的慢性传染病，牛感染结核病经过非常缓慢，由于患病器官不同，临床症状各不一致，主要分为以下三种第一种是肺结核，特点是长期顽固性干咳， 鼻液呈黏液、脓性，患病牛疲劳，消瘦，贫血，呼吸困难。第二种乳房结核，乳房淋巴结肿大， 乳区患病，无热无痛，以发生局限性或弥漫性的硬结节为特点，乳房表面凹凸不平，泌乳量降低，乳汁变稀，严重时乳腺萎缩，泌乳停止。第三种肠结核，以消瘦和持续下痢，或腹泻和便秘交替出现为特点，粪便呈稀粥状，混有黏液或脓性分泌物，味腥臭，生长缓慢，最后消瘦死亡。此外，结核杆菌还可以侵害其他器官，故可发生睾丸结核、子宫结核、淋巴结核、浆膜结核和脑结核。牛结核病在我国的发生和流行普遍存在，给我国的养牛业带来巨大损失。人结核的10%以上由牛分枝杆菌引起，由于牛和人类的关系(牛奶、牛肉及耕牛等)较其他动物更为密切，牛结核的发生和流行与人结核病呈正相关关系，要消灭结核病，首先是要消灭牛结核病，要消灭和控制牛结核病关键是要对该病进行诊断。传统的牛结核分枝杆菌检测方法耗用时间比较长，一般是1 2个月，而常规的结核菌素皮内反应检测方法，不断有报道存在非特异性反应。现在市场缺少一种能对临床样本的牛结核病进行简便、快捷、灵敏、准确的检测的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛结核病PCR快速诊断试剂盒，它可以快速检测牛结核病，并且简便、灵敏、准确、特异性强。本发明是这样实现的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，它包括800μ 浓度为IOmg/ mL的蛋白酶K，3. 2mL裂解液，6mL的TE缓冲液，250μ 的PCR酶，170μ 超纯水，ImL清洗剂， 200μ 的Marker DL2000, 20μ 浓度为20 μ M的上引物，20μ 浓度为20 μ M的下引物，40μ 阴性对照，40μ 阳性对照以及20个吸附柱。裂解液为由IOmM的Tris_HCL、ImM的EDTA、2. 5M的NaCL以及占裂解液总体积 5%的SDS组成的混合溶液。TE缓冲液包括IOmM的Tris-HCL及ImM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的PH 值为7.8。
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PCR 酶的组成包括 IOmM 的 Tris-HCL (PH8. 3)、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 以及 0.05U Polymerase/^L 。上弓丨物为5 ‘ -GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3 ‘，下弓丨物为 5' -ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3‘。阴性对照为超纯水。阳性对照为标准牛结核分枝杆菌DNA模板。清洗剂是体积百分比为70%的乙醇。采用吸附柱收集DNA模板。牛结核病PCR诊断方法的建立材料与方法
1参考菌株
牛分枝杆菌参考菌株〔编号为93006 (4)〕、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌购自北京药品生物制品检定所。巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室分离鉴定。2主要试剂
2.1引物(浓度为20 μ M，用TE溶液配制)
根据牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段设计引物，PCR扩增出一长度为478bp大小的特异片段，该序列在Genbank上的登录号为X57835. 2。引物序列如下 上引物 5 ‘ -GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3 ‘ 下引物 5 ‘ -ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3 ‘ 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2. 2 TE 缓冲溶液(IOmM Tris-HCL, ImM EDTA)、蛋白酶 K(浓度 10mg/mL，用 TE 溶液配制)、裂解液(IOmM Tris-HCLUmM EDTA、2. 5M NaCL以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液)、超纯水、70%乙醇、生理盐水、琼脂糖、无水乙醇、3. 8%的柠檬酸钠、IXTBE电泳缓冲液、溴化乙锭(EB)或Goldview核酸染料均由项目组配制。Marker DL2000、PCR酶 (IOmM Tris-HCL (PH8. 3) ,50mM KCL、1.5mM MgCL2、0. 05U Polymerase/^L)购自天根生化科技[北京]有限公司。2. 3样本的采集
无菌采集新鲜牛奶，-20°C保存备用。用柠檬酸钠或EDTA作为抗凝剂无菌采集全血，-20°C保存备用。3模板的提取
3. 1牛分枝杆菌的培养模板的提取
将牛分枝杆菌接种于改良罗氏培养基上，37°C培养15 30天，可观察到米黄色、粗糙、 隆起、不透明、边沿不整齐，呈颗粒结节的菌落，收集菌体于1. 5mL离心管中，加入TE缓冲溶液200μ ，蛋白酶Κ40μ ，裂解液160μ ，充分混勻，60°C水浴作用15 20分钟，加入无水乙醇200μ ，采用吸附柱收集DNA模板，清洗剂为70%的乙醇。.2胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌DNA模板的提取方法与牛结核分枝杆菌DNA模板的提取方法相同。. 3样本模板的提取取牛奶(或全血)ImL于1. 5mL离心管中，IOOOOr / min离心2_5分钟，弃上清液，沉淀采用生理盐水清洗2次，弃上清液。加入TE缓冲溶液200μ ，蛋白酶K 40μ ,裂解液160μ ， 充分混勻，60°C水浴作用15-20分钟，加入无水乙醇200μ ，采用吸附柱收集DNA模板，清洗剂为70%的乙醇。4牛结核分支杆菌特异性片段的PCR扩增
采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下进行扩增。反应体系和条件如下PCR酶为12. 5μ ，标准牛结核杆菌DNA摸板2μ ，样本DNA摸板5μ ，上下引物各0. 75μ , 加入ddH20至25μ ，在Tgradient96扩增仪下进行30次如下循环94°C变性5分钟，94°C 40 秒，63°C 40秒，72 °C 60秒，30个循环，72°C延伸7分钟。反应结束后将扩增产物取7μ 进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测显示约在478bp处，出现一条PCR目标带，其结果如图1 所示，与预计的结果非常接近。5 PCR法扩增的特异性测定
分别用牛结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌DNA为摸板，进行PCR扩增，除牛结核分枝杆菌出现扩增带，其他的细菌未见特异性478bp片段扩增。结果如图2所示。6 PCR法扩增的敏感性的测定
采用TU-1800spc紫外可见光光度计，对牛结核分枝杆菌标准DNA模板的含量进行测定，测得OD26tl平均值为0. 040nm，经计算结果是DNA模板的含量为0. 304Pg/^L。取标准牛结核DNA模板，按10倍稀释法进行稀释，模板稀释浓度依次为10 _ \ 10 _ 2，10 “ 3……10 “ 8 ，取2PL进行扩增，则牛结核分枝杆菌标准DNA浓度依次为304ng，30. 4ng, 3. 04ng, 304pg, 30. 4pg，3.04pg，304fg，30.4fg，3. 04fg。试验结果表明可检出的牛结核分枝杆菌标准 DNA模板的最小含量是30. 4pg。结果如图3所示。由于采用了上述技术方案，本发明采用常规的PCR，对反应条件进行优化，根据牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段设计引物，研制了用于检测牛结核病的PCR试剂盒，该试剂盒可以检测牛结核分枝杆菌，适用于牛结核病的检测、诊断和流行病学调查。本发明采用常规PCR法，可从牛奶、全血等临床样本中直接检测到牛结核分枝杆菌，灵敏度约为 30. 4pg,需要的时间仅为6小时，具有快速、灵敏性高、特异性强等特点。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。
附图1为牛结核分支杆菌特异性片段试验M: Marker DL2000 ；1:标准阴性；2 标准阳性；3 被检出的阳性样本； 附图2为PCR特异性试验M: Marker DL2000 ；1 牛结核分枝杆菌；2 大肠杆菌；3 沙门氏菌；4 巴氏杆菌；5 胸膜肺炎放线杆菌；6 支气管败血波氏杆菌；7 魏氏梭菌；8 李氏杆菌； 附图3为PCR敏感性试验M: Marker DL2000 ；1 DNA 模板为 304ng ；2 DNA 模板为 30. 4ng ；3 =DNA 模板为 3. 04ng ；4 =DNA 模板为 304pg ；5 =DNA 模板为 30. 4pg ；6 =DNA 模板为 3. 04pg ；7 =DNA 模板为 304fg ；8 =DNA 模板为 30. 4fg ；9 =DNA 模板为 3. 04fg。
具体实施例方式
具体实施例方式牛结核病PCR快速诊断试剂盒，它包括800μ 浓度为10mg/mL的蛋白酶K，3. 2mL裂解液，裂解液为由IOmM WTris-HCLUmMW EDTA、2. 5M的NaCL以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液；6mL的TE缓冲液，TE缓冲液包括IOmM的Tris-HCL 及ImM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的PH值为7. 8 ；250μ 的
PCR酶，PCR酶为天根生化科技(北京)有限公司PCR MasterMix产品，其具体组成包括 IOmM 的 Tris-HCL (ΡΗ8. 3)、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 及 0. 05U Polymerase/^L ； 170μ 超纯水，200μ 的Marker DL2000, 20μ 浓度为20 μ M的上引物，20μ 浓度为20 μ M的下引物， 上引物为 5-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3，下引物为 5-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3 ；采用 40μ 的超纯水作为阴性对照；采用40μ 标准牛结核分枝杆菌DNA模板作为阳性对照；采用体积百分比为70%的乙醇作为清洗剂；采用吸附柱收集DNA模板。
权利要求
1.一种牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于它包括800μ 浓度为lOmg/mL的蛋白酶K，3. 2mL裂解液，6mL的TE缓冲液，250μ 的PCR酶，170μ 超纯水，ImL清洗剂，200μ 的Marker DL2000, 20μ 浓度为20 μ M的上引物，20μ 浓度为20 μ M的下引物，40μ 阴性对照，40μ 阳性对照以及20个吸附柱。
2.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于裂解液为由 IOmM的Tris-HCLUmM的EDTA、2. 5M的NaCL以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于TE缓冲液包括 IOmM的Tris-HCL及ImM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的PH值为7. 8。
4.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于PCR酶的组成包括 IOmM 的 Tris-HCL、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 以及 0. 05U Polymerase/^L。
5.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于上引物为 5 ‘ -GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3 ‘，下引物为 5 ‘ -ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3 ‘。
6.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于阴性对照为超纯水。
7.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于阳性对照为标准牛结核分枝杆菌DNA模板。
8.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于清洗剂是体积百分比为70%的乙醇。
9.根据权利要求1所述的牛结核病PCR快速诊断试剂盒，其特征在于采用吸附柱收集DNA模板。
全文摘要
本发明公开了一种牛结核病PCR快速诊断试剂盒，它包括800μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K，3.2mL裂解液，6mL的TE缓冲液，250μL的PCR酶，170μL超纯水，200μL的MarkerDL2000，20μL浓度为20μM的上引物，20μL浓度为20μM的下引物，40μL阴性对照以及40μL阳性对照。本发明采用常规的PCR方法，对反应条件进行优化，根据牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段设计引物，研制了用于检测牛结核病的PCR试剂盒，该试剂盒可以检测牛结核分枝杆菌，适用于牛结核病的检测、诊断和流行病学调查，具有快速、灵敏性高、特异性强等特点。
文档编号C12R1/93GK102154525SQ20111011031
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者余波, 史开志, 吴位珩, 孙启跃, 徐景峨, 杨茂生, 杨莉 申请人:贵州省畜牧兽医研究所