专利名称：家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是一种来自家蚕的具有还原昆虫体内3位脱氢蜕皮激素活性的3位脱氢蜕皮激素α还原酶JHff -reifociaM基因。
背景技术：
昆虫是世界上最成功的动物，其数量和种类最多，分布最广，与人类的关系也非常密切，如作为鳞翅目昆虫代表之一的重要经济昆虫家蚕以及绝大多数农林害虫等。昆虫的表皮(即昆虫的外骨骼)是由蜡质层和几丁质层组成的，其中蜡质层的作用主要是防止水分的蒸发。表皮细胞分泌的外骨骼一经硬化后，就不能继续扩大，从而使昆虫生长受到限制。因此，昆虫在生长发育过程中会出现蜕皮现象。在进行多次蜕皮后，昆虫幼虫时期的某些组织会消失而产生成虫特异的组织，生活习性也会发生改变，这种变化称为变态。蜕皮与变态是昆虫生长发育的基本生理现象。而昆虫的蜕皮与变态发育主要是由前胸腺合成分泌的蜕皮激素(Molting hormone, ΜΗ)和咽侧体合成分泌的保幼激素(Juvenile hormone, JH)协同控制的。因此，理解蜕皮激素代谢机制不仅有助于对家蚕生长发育的控制，对其它鳞翅目害虫的防治也有广泛的指导和借鉴意义。蜕皮激素的滴度在不同的发育时期呈现精确的、周期性的变化。蜕皮激素的规律性变化对昆虫的发育起着十分重要的作用。昆虫消减体内蜕皮激素浓度主要有两种方式， 一是通过排泄排出体外，另外是通过将蜕皮激素转化为非活化形式从而降低体内蜕皮激素的浓度。目前研究证明，有很多转化途径能使蜕皮激素失活(Rees 1995)，例如形成非活性的3位差向异构化蜕皮激素(3-印iecdysone)。先前研究认为这一失活途径在鳞翅目昆虫中尤为重要。昆虫中蜕皮激素的3位差向异构化途径主要经过两步蜕皮激素在蜕皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase, E0)的作用下合成3位脱氢蜕皮激素，3位脱氢蜕皮激素最终在3 位月兑氧虫兑皮激素 α 还原(3dehydro-ecdysone-3 α -reductase, 3DE-3 α -reductase) 的作用下形成非活性形式3位差向异构化蜕皮激素(3-印iecdysone)，从而使蜕皮激素丧失活性。另外，3位脱氢蜕皮激素又可以在3位脱氢蜕皮激素β还原酶(3dehydr0-eCdys one-3 β -reductase, 3DE-3 β -reductase)的作用下重新转化成蜕皮激素。在该途径中，3 位脱氢蜕皮激素α还原酶是蜕皮激素失活的关键酶，它决定了中间物质3位脱氢蜕皮激素能否形成非活性的3位差向异构化蜕皮激素。虽然该酶在蜕皮激素滴度变化过程中起着重要作用，而且其生理、生化性质已经在很多昆虫中有研究。但是，3位脱氢蜕皮激素α还原酶基因及其编码的酶在家蚕中还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆并鉴定3位脱氢蜕皮激素α还原酶JM-Ja-re^/cteM基因。将该基因导入真核表达系统中，经诱导使其表达。酶活性测定证实其具有3位脱氢蜕皮激素α还原酶的活性。最后利用转基因手段将该基因转入家蚕体内，通过特异性启动子使目的基因特异地高量表达，从而降低虫体内蜕皮激素的滴度，进而人为地调节家蚕的生长发育。本发明申请人利用生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定了一个3位脱氢蜕皮激素α还原酶JM-Jff -reifocteM基因。利用家蚕5龄3天总cDNA为模板，设计了一对特异的3位脱氢蜕皮激素α还原酶JUa-re^/cte^引物，然后进行克隆，得到了一段序列。测序验证为目的序列。然后将该基因连接在表达载体PPIC9K上，并经诱导表达，证实了酶活性，为下一步将该基因导入家蚕中奠定了物质基础。本发明的家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶JM-Jff -reifocteM基因通过以下步骤得到
(1)首先以NCBI上已报道的鳞翅目昆虫海灰翅夜蛾LSpodopteralittoralis)中3位脱氢蜕皮激素α还原酶(S13DE-3 α -reductase登录号为AF255341)为问询序列，用Blast 程序在家蚕表达数据库(EST)和基因组数据库搜寻家蚕的同源基因。通过信息分析，最终得到一条匹配度最高的基因。该基因的核苷酸序列长753 bp，无内含子，编码一个含250个氨基酸的蛋白质序列，且该序列与海灰翅夜蛾的S13DE-3 α -reductase相似性达到56%。基于候选基因的核苷酸序列设计特异性引物，上游为5’ GAATTCATGAGTTTCACAAAT 3’，下游为5’ GCGGCCGCTCATCTGAGCAGCAG 3’ ；划线部分为酶切位点，其中上游引物的酶切位点为 SnaB I，下游引物的酶切位点为Not I ；
(2)提取家蚕5龄3天幼虫的全蚕RNA，然后将其反转成cDNA，并以其为模板，用设计的特异性引物进行扩增，获得目的条带，PCR产物回收后与PMD-19-T载体连接转化入大肠杆菌Dffia感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；
(3)将含有目的片段的T克隆与毕赤酵母表达载体pPIC9K分别用SnaBI和Not I进行双酶切，分别回收目的片段，电泳检测后，用DNA连接酶将其连接，并转化大肠杆菌Dffia 感受态细胞，筛选获得含有pPIC9K-Bm3DE_3 α -reductase重组质粒的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；
(4)提取重组质粒pPIC9K-Bm3DE_3α -reductase将其进行线性化和去磷酸化，然后用电击转化的方法转入酵母感受态细胞O0ZcAia pastor is X_33)，再涂于MD板上培养两天，挑取单菌落，之后点种于含G418的YPD板上进行阳性克隆的筛选，再进行PCR验证确认&I13DE-3 α -reductase基因已导入酵母菌中，再置于BMMY中培养，添加甲醇以诱导 Bm3DE-3 α -reductase的表达，取上清液进行蜕皮激素氧化酶酶活性的测定；
(5)对3位脱氢蜕皮激素α还原酶的酶活性进行测定。通过上述方法获得家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3 α -reductase基因，其完整的⑶S及推断的氨基酸序列如下
ATG AGT TTC ACA AAT AM GTG GTT CTC GTC ACC GGG GGC AGC TCG GGT ATC GGT GCC TCT GCC GCC GTA CAC TTC
MSFTNKVVLVTGGSSGIGA SAAVHFGCT AAG GM GGT GCG GAC GTG GCC ATA GTA GGT CGA AAC GTT ACG AAA CTG GAC MC GTG GCC CGG GAA TGT GCG
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本发明的优点是本发明获得了家蚕3位脱氢蜕皮激素α iWMBm3DE-3 a -reductase基因，利用酵母真核表达系统将该基因进行外源表达，其表达产物能有效地作用于3位脱氢蜕皮激素， 使其转化为非活性的3位差向异构化蜕皮激素，从而降低昆虫体内蜕皮激素的滴度。将 Bm3DE~3 α-reductase基因利用转基因技术导入家蚕体内，使其在蛹期高量表达，可调节昆虫蜕皮激素的滴度，进而人为地控制家蚕的发育。
具体实施例方式实施例1
家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶基因的生物信息学鉴定
首先以NCBI上已报道的鳞翅目昆虫海灰翅夜蛾littoral is)中3位脱氢蜕皮激素α还原酶(S13DE-3 α -reductase登录号为AF255341)为问询序列，用Blast程序在家蚕表达数据库(EST)和基因组数据库搜寻家蚕的同源基因。通过信息分析，最终得到一条匹配度最高的基因。该基因的核苷酸序列长753 bp，无内含子，编码一个含250个氨基酸的蛋白质序列，且该序列与海灰翅夜蛾的S13DE-3 α -reductase相似性达到56%。实施例2:
家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶基因的克隆
基于候选基因的核苷酸序列设计特异性引物，上游为5’ GAATTCATGAGTTTCACAAAT 3’，下游为5’ GCGGCCGCTCATCTGAGCAGCAG 3’ ；划线部分为酶切位点，其中上游引物的酶切位点为SnaB I，下游引物的酶切位点为Not I。提取家蚕5龄3天的全蚕RNA，用MLV反转录酶(promega公司生产)将其反转成cDNA，然后以其为模板，用设计的特异性引物进行扩增，获得目的条带，PCR产物回收后与PMD19-T载体连接转化入大肠杆菌Dffia感受态细胞， 获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致。实施例3:
家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶基因的真核表达及酶活测定 将含有目的片段的T克隆与pPIC9K空质粒分别用SnaB I和Not I进行双酶切，分别回收目的片段，以Solution I连接酶将其连接并转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，筛选获得含有pPIC9K-Bm3DE_3 α -reductase的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；提取质粒 pPIC9K-Bm3DE-3 α -reductase将其进行线性化和去磷酸化处理，然后用电击转化的方法转入毕赤酵母感受态中，再涂于MD板上培养两天，挑取最先长的单菌落，之后点种于含G418 的YPD板上进行阳性克隆的筛选，再进行PCR验证确认其&I13DE-3 α -reductase基因已导入酵母菌中，然后置于BMMY中培养，添加甲醇以诱导&I13DE-3 α-reductase的表达。利用饱和硫酸铵法沉淀表达上清液中的蛋白，用Tris-Hcl缓冲液溶解蛋白，过夜透析。然后取溶解液加入3位脱氢蜕皮激素进行酶促反应，反应产物用高效液相色谱(HPLC)检测。结果显示除了 3位脱氢蜕皮激素产生的色谱峰外，有一新的色谱峰。对该峰进行质谱鉴定，证实其为3位差向异构化蜕皮激素。
权利要求
1.家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因，其特征在于具有如说明书序列表所示的核苷酸序列。
2.家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因编码的蛋白质，其特征在于具有如说明书序列表所示的氨基酸序列。
全文摘要
一种来自家蚕的具有还原昆虫体内3位脱氢蜕皮激素活性的3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因，利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆得到。利用酵母真核表达系统将该基因进行外源表达，其表达产物能有效地作用于3位脱氢蜕皮激素，使其转化为非活性的3位差向异构化蜕皮激素，从而降低昆虫体内蜕皮激素的滴度。将Bm3DE-3α-reductase基因利用转基因技术导入家蚕体内，使其在蛹期高量表达，可调节昆虫蜕皮激素的滴度，进而人为地控制家蚕的发育。
文档编号C12N15/10GK102250929SQ20111019944
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者向仲怀, 孙伟, 张泽, 沈以红 申请人:西南大学