专利名称：一种利用生物相容的高分子修饰葡萄糖氧化酶表面以提高其寿命和稳定性的新方法
技术领域：
该方法涉及一种葡萄糖氧化酶的的改造方法，通过葡萄糖氧化酶表面的多个氨基基团，使一种具有生物相容性的高分子聚合物连接在其表面使之被改造。改造后的葡萄糖氧化酶具有更好的热稳定性及更长的 使用寿命，属于生物酶研究领域。
背景技术：
高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇等。分子量为160KDa左右，每分子葡萄糖氧化酶含有两分子的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。固体酶制剂在0°C下保存至少稳定两年，在-15°C下稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的温度范围为30°C 60°C，最适PH为5。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢是一种强氧化剂，有杀菌消毒的作用。由于其具有催化专一性、高活性和催化高效性等优点，在食品工业、医药、饲料添加剂等方面应用非常广泛，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。其最主要的用途是生产葡萄糖酸及作为抗氧化剂而广泛用于食品保鲜过程中。自从1928年Muller发现并命名葡萄糖氧化酶至今，每年都有许多人对葡萄糖氧化酶进行研究与探索，尤其是对它的辅基一黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。大量的文献报道了有关FAD的固定或改造，例如用于制备葡萄糖传感器、电化学方面的应用以及酶活性等方面的研究。然而，有关通过对葡萄糖氧化酶的表面进行改造以调节其寿命和稳定性的报道却很少。本发明旨在对葡萄糖氧化酶的表面直接进行改造，通过在表面连接上具有生物相容性的高分子链，从而达到改善葡萄糖氧化酶的热稳定性及其寿命的目的，使改造后的葡萄糖氧化酶能够更好的应用于食品加工、食品保鲜以及防腐处理等领域。且在制备的过程中具有很低的毒性，是一种绿色环保的制备方法。
发明内容
本发明提出了一种对葡萄糖氧化酶的表面进行改造的新方法，以期通过葡萄糖氧化酶表面的氨基基团对其进行改造，使其热稳定性和使用寿命得到提高。该方法用带有巯基噻唑啉末端基的RAFT试剂，通过RAFT(可逆加成断裂链转移)聚合法合成了 α-(1-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧乙烯)(PEG-A)高分子聚合物。通过高分子链末端的巯基噻唑啉基团，与葡萄糖氧化酶表面的氨基进行酰胺化反应，从而连接在其表面。改造后的葡萄糖氧化酶，其表面的高分子链把酶的活性中心(FAD)等组分部分包围，对酶的结构起到了稳固和保护作用。因此，改造后的葡萄糖氧化酶具有优良的热稳定性和更长的使用寿命O发明是通过下述方式实现的，包括下列步骤(I)合成带有巯基噻唑啉末端基的RAFT试剂，然后聚合PEG-A得到带有巯基噻唑啉末端基的高分子，使其聚合物链连接在葡萄糖氧化酶上。(附图I)
(2)酶活性的測定通过紫外分光光度计分析法，对改造后酶的活性进行測定。(3)热稳定性的測定把酶溶解在去离子水中，在70°C下保温3小时，每隔一段时间，取样品进行(4)活性测试。測定得出结论，葡萄糖氧化酶在70°C下很快失去活性，而改造后的葡萄糖氧化酶在3小时后仍然具有活性。(附图2)(4)使用寿命的測定把酶的水溶液放于室温下60天，每隔一段时间，取样品进行
(4)活性测试。測定得出结论，葡萄糖氧化酶在室温下能储存29天，而改造后的葡萄糖氧化酶在60天后仍然具有活性(附图3)
图I是聚合物链的合成及改造葡萄糖氧化酶示意图。图2是热稳定性测定结果图。图3是使用寿命的测定结果图。
具体实施例方式实施例I.取RAFT试剂O. 527g，2_巯基噻唑啉O. 238g，溶于IOml的ニ氯甲烷中。再加入脱水剂ニ环己基碳ニ亚胺(DCC)O. 497g，和催化剂4- ニ甲氨基吡啶(DMAP) 24. 5mg,在室温下搅拌7小吋。反应结束后，抽滤除去固体颗粒，然后通过硅胶柱提纯产物。将带有巯基噻唑啉末端基的RAFT试剂7. 6mg, α-(I-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧こ烯)(PEG-A) 2g，偶氮ニ异丁氰(AIBN) lmg，溶解在4ml ニ氧六环中，其中，RAFT试剂与PEG-A的摩尔比为I : 100。通氮气除氧40min，然后密封反应体系，在75°C的油浴中反应5小时。反应结束后，用こ醚沉淀提纯聚合物，得到预期的产物。把5mg的葡萄糖氧化酶溶液在5ml磷酸盐缓冲液中(pH = 7)，按照摩尔比I : 30的比例加入合成的聚合物，室温下搅拌48小吋。反应结束后，用截留分子量10万的透析袋进行透析除去过量的高分子，将改造的葡萄糖氧化酶冷冻干燥。然后进行酶活性、热稳定性及使用寿命测试。实施例2.将I中摩尔比改为RAFT试剂PEG-A = I 50，其他如实施例I。实施例3.将I中摩尔比改为RAFT试剂PEG-A = I 200，其他如实施例I。实施例4.将I中质量比改为RAFT试剂PEG-A = I 400，其他如实施例I。
权利要求
1.ー种利用生物相容的高分子修饰葡萄糖氧化酶表面以提高其寿命和稳定性的新方法 (1)带有巯基噻唑啉末端基的RAFT试剂的合成取RAFT试剂O.527g，2-巯基噻唑啉O.238g，溶于IOml ニ氯甲烷中，再加入ニ环己基碳ニ亚胺(DCC)O. 497g，和4-ニ甲氨基吡啶(DMAP) 24. 5mg，在室温下搅拌7小时，反应结束后，抽滤除去固体颗粒，然后通过硅胶柱提纯产物。
(2)PEG-A聚合物的合成将带有巯基噻唑啉末端基的RAFT试剂7.6mg, α-(1-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧こ烯)(PEG-A) 2g,偶氮ニ异丁氰(AIBN) Img,溶解在4mlニ氧六环中。其中，RAFT试剂与PEG-A的摩尔比为I : 100。通氮气除氧40min，然后密封反应体系，在75°C的油浴中搅拌反应5小吋，反应结束后，用こ醚沉淀提纯聚合物，得到预期的产物。
(3)高分子聚合物链连接在葡萄糖氧化酶上把5mg的葡萄糖氧化酶溶液在5ml磷酸盐缓冲液中(pH = 7)，按照摩尔比I : 30的比例加入合成的聚合物，室温下搅拌48小时，反应结束后，用截留分子量10万的透析袋进行透析提纯，提纯后冷冻干燥，得到产物，然后进行酶活性、热稳定性及储存性的测试。
2.按照权利要求I所述的制备方法，其特征在干步骤(2)中聚合物分子量并非固定，可以根据聚合物分子量的需要按比例改变单体用量。
3.按照权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中反应温度是可以调节的，.60 90°C范围内均可。
4.按照权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中RAFT试剂与AIBN的比例并非固定，RAFT/AIBN = 2_8。
全文摘要
本发明提出了一种对葡萄糖氧化酶的表面进行改造的新方法，以期通过葡萄糖氧化酶表面的氨基基团对其进行改造，使其热稳定性和寿命得到提高。该方法用带有巯基噻唑啉末端基的RAFT试剂，通过RAFT(可逆加成断裂链转移)聚合法合成了α-(1-氧代-2-丙烯基)-ω-甲氧基聚(氧乙烯)(PEG-A)高分子聚合物。通过高分子链末端的巯基噻唑啉基团，与葡萄糖氧化酶表面的氨基进行酰胺化反应，从而连接在其表面。改造后的葡萄糖氧化酶，其表面的高分子链把酶的活性中心(FAD)等组分部分包围，对酶的结构起到了稳固和保护作用。因此，改造后的葡萄糖氧化酶具有优良的热稳定性和更长的使用寿命。
文档编号C12N9/96GK102719423SQ20121017361
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者刘敬权, 王蕊, 罗雄 申请人:青岛大学